HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ TIẾN VINH

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CÔNG NGHỆ
SINH HỌC VÀ TRUYỀN THỐNG TRONG NHÂN GIỐNG,
TẠO SINH KHỐI RỄ VÀ TRỒNG TRỌT CÂY ĐAN SÂM
(SALVIA MILTIORRHIZA BUNGE) TẠI GIA LÂM, HÀ NỘI

CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG
MÃ SỐ: 62.62.01.10

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI - 2016


Công trình hoàn thành tại:
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS. TS. NGUYỄN PHƢƠNG THẢO
2. TS. NINH THỊ PHÍP

Phản biện 1: PGS.TS. ĐOÀN THỊ THANH NHÀN
Hội Sinh học

Phản biện 2: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN
Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 3: TS. TRẦN NGỌC HÙNG
Viện Nghiên cứu Rau quả


nguyên được các đặc tính của cây mẹ, đồng đều, sạch bệnh, sức sống cao khi đưa ra
trồng trên đất… nên đã và đang được ứng dụng rộng rãi vào sản xuất nhiều loại cây
trồng, trong đó có cây dược liệu. Phương pháp nuôi cấy rễ tơ với những ưu điểm
vượt bậc như như rễ phát triển nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất
điều hòa tăng trưởng ngoại sinh, bền vững về mặt di truyền và tổng hợp hợp chất
thứ cấp với hàm lượng cao hơn hoặc bằng với cây mẹ, tạo sinh khối lớn. Hơn nữa,
gần đây sự phát triển hệ thống bioreactor mở ra nhiều triển vọng trong việc nuôi
cấy rễ ở quy mô công nghiệp (Guillon et al., 2006). Tại Việt Nam chưa có bất kỳ
công trình nghiên cứu nào áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học vào sản xuất
cây giống và nhân nuôi sinh khối rễ Đan sâm nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp.
Do vậy, đề tài này được tiến hành có ý nghĩa lớn về mặt khoa học và thực tiễn.
1.2. MỤC TIÊU
1.2.1. Mục tiêu chung
Đề xuất quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro cây Đan sâm có hệ số nhân
cao, chất lượng cây giống tốt và các biện pháp kỹ thuật tối ưu để trồng cây Đan
sâm ngoài đồng ruộng. Đồng thời, tạo được các dòng tế bào rễ tơ Đan sâm và xác
định được một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc nhân nuôi rễ tơ in vitro
làm tiền đề cho việc xây dựng qui trình sản xuất các hợp chất thứ cấp phục vụ công
nghiệp dược liệu ở Việt Nam.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
(1) Xác định được các thông số kỹ thuật trong quy trình nhân giống in vitro cây
Đan sâm.
(2) Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen nhờ vi
khuẩn Agrobacterium rhizogenes nhằm tạo được các dòng rễ tơ cây Đan sâm và
một số thông số của quá trình nhân nuôi sinh khối rễ tơ Đan sâm.
1


(3) Xác định được các biện pháp kỹ thuật (thời vụ, mật độ trồng, dinh dưỡng)
thích hợp cho sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng dược liệu rễ cây Đan sâm.

2.1.1. Nguồn gốc
Cây Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge thuộc ngành Hạt
kín – Angiospermae, lớp 2 lá mầm - Dicotyledones, phân lớp Cúc - Asteridae, bộ Hoa
môi – Lamiales, họ Hoa môi – Lamiaceae, chi Salvia.
Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) còn được biết đến với tên gọi là Radix
Salviae Miltiorrhizae, huyết sâm, huyết căn, xôn đ … là một loài thực vật sống lâu
năm, loài bản địa của cả Trung Quốc và Nhật Bản.
2


2.1.2. Đặc điểm thực vật học
Đan sâm là cây thảo, lâu năm, cao khoảng 30 – 70 cm. Thân phát triển thẳng
đứng và vuông cạnh, phía trên thân cây phân nhánh. Toàn thân được bao phủ bởi
lớp lông mềm màu vàng và lông tuyến. Lá kép lông chim lẻ mọc đối, 3-5 lá chét, lá
chét giữa thường lớn hơn. Chùm hoa ô tròn, mọc ở đầu cành hoặc trên nách lá, gồm
nhiều vòng chỗ dày, chỗ thưa xếp thành tầng dọc, dài 10 – 15 cm.
Đan sâm có 13 – 21 rễ đ , được phát triển từ thân rễ chính. Rễ Đan sâm nh
dài hình trụ, dài 10 – 20 cm, đường kính 0,5 – 1,5 cm, ăn sâu xuống đất, cong queo,
có khi phân nhánh và có rễ con dạng tua nh . Rễ có màu đ tươi, mặt ngoài nhăn
nheo tạo thành rãnh nh song song xuôi theo chiều dài của rễ (Đỗ Tất Lợi, 2004).
2.1.3. Phân bố
Tại Trung Quốc, Đan sâm được trồng ở tỉnh Tứ Xuyên khoảng 100 năm về
trước (Wang et al., 2004) và được trồng phổ biến ở các tỉnh Sơn Đông, Hà Nam, Hà
Bắc, Liêu Ninh, Giang Tô, Chiết Giang, Giang Tây, Tứ Xuyên, Hồ Bắc, Quý Châu,
Quảng Đông, Sơn Tây. Đan sâm được di thực vào Việt Nam khoảng những năm
1960, được trồng ở Tam Đảo (Vĩnh Phúc), Văn Điển (Hà Nội), Bắc Hà (Lào Cai) và
một số vườn thuốc khác. Hiện nay, Đan sâm được chú ý phát triển để nhân rộng tại
Trại Tam Đảo, Sapa và Trung tâm nghiên cứu trồng chế biến cây thuốc Hà Nội.
2.1.4. Yêu cầu điều kiện sinh thái của cây Đan sâm
Nhiệt độ thích hợp cho hạt Đan sâm nảy mầm là 15 - 25oC, cây sinh trưởng, phát

al., 2005; Wang et al., 2005).
2.2. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU THỤ DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM
2.2.1. Trên thế giới
Đan sâm đã có lịch sử 2000 năm sử dụng. Trung Quốc, cây Đan sâm có
nguồn gốc tự nhiên và trồng trọt đều được sử dụng phổ biến ở các tỉnh Sơn Đông,
An Huy, Giang Tô, Chiết Giang, Giang Tây, Hồ Bắc, Tứ Xuyên, Quý Châu, Sơn
Tây, Quảng Đông… trong đó các tỉnh Sơn Tây, Tứ Xuyên, Hà Bắc, Hà Nam và
Sơn Đông là khu vực sản xuất Đan sâm chất lượng và sản lượng cao.
Năm 1998, nhu cầu Đan sâm trên thế giới mới chỉ ở mức 4.500 tấn/năm thì
năm 2002 là 10.000 tấn trên toàn thế giới và lên tới 80.000 tấn/năm trong thời gian
gần đây (Hu et al, 2005).
Một trong các sản phẩm sử dụng phổ biến nhất có chứa dược liệu Đan sâm là
Thiên Sứ Hộ Tâm Đan do các nhà khoa học Trung Quốc bào chế trên cơ sở kết hợp
hai loại thảo dược là Đan sâm và tam thất để phòng và điều trị các bệnh lý tim mạch
như đau thắt ngực, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tăng cholesterol máu…
Có mặt trên thị trường từ năm 1993, tính đến nay có hơn 2 tỷ liều dùng được
kê đơn cho khoảng 10 triệu bệnh nhân điều trị trong thời gian ngắn hoặc kéo dài tại
34 Quốc gia trên toàn thế giới như Mỹ, Nga, Canada, Singapo, Nam Phi, Việt Nam...
2.2.2. Tại Việt Nam
Đan sâm được di thực và sử dụng từ những năm 1960 ở Việt Nam và hiện
nay loại dược liệu này được trồng thử nghiệm ở Lào Cai (Sập, Bắc Hà), Vĩnh Phúc
(Tam Đảo) và Hà Nội (Văn Điển) và một số vườn thuốc khác (Ngô Quốc Luật và
cs., 2014).
2.3. CÁC YẾU TỐ KỸ THUẬT
2.3.1. Phƣơng pháp nhân giống cây Đan sâm
Cây Đan sâm có thể nhân giống hữu tính bằng hạt hoặc vô tính từ rễ củ, tách
chồi và phương pháp nuôi cấy mô tế bào (Zhao et al., 1999; Wang et al., 2002;
Zhang and Zhang, 2004) (Bảng 2.1).
4


tách chồi
Hạt
Chồi
Rễ củ
Gieo hạt: tháng 7-8 hoặc Không
có Giâm củ: tháng 2-3
tháng 2-3
thông tin
Chuyển cây ra
Chuyển cây ra đồng ruộng:
đồng ruộng: khi
cuối tháng 10 hoặc khi cây
cây đạt chiều cao
đạt chiều cao 6-10 cm
6-10 cm
Tháng 8 hoặc tháng 3
Cuối tháng Tháng 2-3
10 đến đầu
tháng 11
Lượng hạt: 15,0-22,5 kg/ha Không
có Mật độ trồng 33 x
Mật độ gieo hạt: hàng cách thông tin
23 cm
hàng 12 - 15 cm
Mật độ trồng: 33 (30-35
cm) x 23 (20)
Lượng hạt: 7,5 kg/ha
Mật
độ Mật độ trồng: 33
Gieo xạ: hàng cách hàng trồng: 33x23 x 23 cm

nhiều màu, cao ráo, thoát hơi nước. Sau khi cày bừa kỹ, cần lên luống cao 20 –
25cm, rộng 90 – 120 cm, rãnh phải dốc để thoát nước. Dùng 15 – 20 tấn phân
chuồng ủ với 1,4 – 2,8 tấn tro bếp, 270 kg supe lân để bón lót cho một heta. Tốt
nhất, nên bón theo hốc để tiết kiệm phân và hạn chế c dại. Hốc được chuẩn bị với
khoảng cách 30x30 cm.
2.4. KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO
2.4.1. Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trong sản xuất cây dƣợc liệu
Kỹ thuật nhân giống in vitro được áp dụng thành công trên nhiều đối tượng cây
dược liệu, cho phép cung cấp nguồn giống chất lượng một cách chủ động cho sản xuất.
Việt Nam một số tác giả đã tiến hành nhân giống in vitro thành công trên
một số cây dược liệu quan trọng khác, sử dụng chồi đỉnh lấy từ các cây Lô hội
(Aloe vera Linne.) và tiến hành nhân giống vô tính in vitro. Kết quả cho thấy, môi
trường nhân nhanh thích hợp là MS + 2,5 mg/l BAP + 0,6 mg/l α- NAA cho hệ số
nhân đạt 4,1 lần. Một đối tượng khác là cây ba kích (Morinda officinalis How)
cũng được tái sinh thành công với vật liệu ban đầu là đoạn thân mang chồi nách
trên môi trường thích hợp MS + 0,25 mg/l kinetin + 1 mg/l BA với tỷ lệ chồi tái
sinh sau 4 tuần nuôi cấy là 96,6%. Môi trường nhân nhanh thích hợp là MS + 3,0
mg/l BA + 0,2 mg/l IBA+ 10 mg/l riboflavin, sau 45 ngày đạt hệ số nhân là 10,13
lần (Hoàng Thị Thế và cs., 2013).
2.4.2. Ứng dụng công nghệ nhân giống in vitro trên cây Đan sâm
Nhiều công trình nhân giống vô tính cây Đan sâm với mục đích tạo ra giống
chất lượng cao đã được công bố bới một số tác giả như Feng et al. (2004); Xu et
al. (2008); Cai et al. (1991), Zhao et al. (2003.
Tại Việt Nam, trước nghiên cứu này, mới chỉ có duy nhất một nghiên cứu
liên quan đến nhân nhanh in vitro cây Đan sâm được thực hiện bởi Tạ Như Thục
Anh và cs. (2014). Tác giả đã khảo sát ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng
đến khả năng nhân in vitro cây Đan sâm sử dụng vật liệu là chồi mầm từ củ giống.
Nghiên cứu đã chỉ ra loại chất điều tiết sinh trưởng và nồng độ thích hợp cho quá
trình tái sinh chồi từ mầm ngủ, nhân nhanh và kích thích ra rễ cây Đan sâm trong
điều kiện in vitro.

- Hạt Đan sâm Salvia miltiorrhiza Bunge nhập từ tỉnh Tứ Xuyên – Trung Quốc.
- Chủng vi khuẩn A. rhizogenes ATCC15834 được cung cấp bởi Trung tâm
Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh.
3.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Nội dung 1- Xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm
- Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến tỷ lệ nảy mầm của hạt
Đan sâm
- Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi
Đan sâm
- Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân nhanh
chồi Đan sâm
- Thí nghiệm 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và kinetin đến hiệu
quả nhân nhanh chồi Đan sâm
- Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hiệu
quả nhân nhanh chồi Đan sâm
- Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng tạo rễ của chồi
Đan sâm
- Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ của chồi
Đan sâm
- Thí nghiệm 8. Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA đến khả năng tạo rễ của chồi
Đan sâm
- Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy cây Đan sâm
in vitro trên môi trường ra rễ đến tỷ lệ sống của cây ngoài vườn ươm
- Thí nghiệm 10. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể tới sự sinh trưởng và
phát triển của cây Đan sâm
7


3.2.2. Nội dung 2-Tạo dòng rễ tơ và nhân nuôi sinh khối rễ tơ in vitro cây Đan sâm
- Thí nghiệm 11. Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu lây nhiễm đến khả năng

tối, cường độ ánh sáng 2000 -2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C.
Các thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm của bộ môn CNSH
Thực vật, Khoa CNSH, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Các thí nghiệm được bố
trí hoàn toàn ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần mỗi công thức, mỗi lần 30 mẫu với các thí
nghiệm trong nội dung xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro cây Đan sâm, 100
mẫu đối với thí nghiệm chuyển gen và 9 mẫu đối với thí nghiệm nhân nuôi sinh
khối rễ Đan sâm.
3.3.1.1. Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành
Các thí nghiệm sử dụng môi trường nền MS hoặc B5 theo từng thí nghiệm +
30 g/l đường + 7,0 g/l agar. Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước
8


khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 20 phút (khối lượng agar có
thể thay đội cho phù hợp với yêu cầu từng thí nghiệm).
Điều kiện nuôi cấy in vitro: 16h sáng/8h tối, cường độ ánh sáng 2000-2500 lux,
nhiệt độ 25 ± 20C (thời gian chiếu sáng có thể thay đội cho phù hợp với yêu cầu từng
thí nghiệm).
3.3.1.2. Phương chuyển gen và kiểm tra mẫu chuyển gen
a) Chuẩn bị dịch khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Vi khuẩn A.rhizogenes chủng ATCC 15834 bảo quản ở -800C được hoạt hóa
bằng cách nuôi trải trên môi trường LB đặc trong 48h ở 280C trong điều kiện tối.
Sau đó, một khuẩn lạc đơn được chuyển sang nuôi cấy trong môi trường LB l ng,
lắc 200 vòng/phút ở 280C trong 16h. Dịch khuẩn được ly tâm thu sinh khối ở tốc độ
4000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút. Sinh khối vi khuẩn sau đó được hòa loãng
trong môi trường MS l ng và xác định mật độ vi khuẩn dựa trên giá trị mật độ
quang của dịch mẫu ở bước sóng 600 nm (OD600).
b) Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn
Lá, cuống lá và đoạn thân cây Đan sâm in vitro sinh trưởng phát triển tốt được
cắt và tạo vết thương bởi dao cấy đã nhúng vào dịch khuẩn A.rhizogenes và cấy trên

tháng bón 50% N + 30% K, đợt cuối cùng sau trồng 6 tháng bón nốt lượng phân N
và K còn lại. Làm c và quản lý nước, kiểm tra sâu bệnh thường xuyên đảm bảo
cây sinh trưởng, phát triển tốt.
Cây giống được trồng trong 3 thí nghiệm này là đều là cây có nguồn gốc
nuôi cấy mô. Tiêu chuẩn cây con khi trồng: Cây được giâm trên giá thể cát + xơ
dừa (tỷ lệ 1:1) trong thời gian 30 ngày, cây có chiều cao >4 cm, có 9 lá/cây, cây
sinh trưởng kh e.
3.3.2.1. Phương pháp xác định khối lượng rễ tươi
Kết thúc quá trình nuôi cấy, rễ tơ được thu nhận, rửa sạch môi trường và loại
b hoàn toàn nước bằng giấy thấm. Sau đó cân rễ bằng cân phân tích để xác định
khối lượng rễ tươi.
3.3.2.2. Phương pháp xác định khối lượng rễ khô
Rễ tơ sau khi thu sinh khối được sấy ở nhiệt độ 400C đến khối lượng không
đổi để xác định khối lượng rễ khô theo phương pháp của Ge et al. (2005).
3.3.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất mục tiêu
Ba hoạt chất mục tiêu gồm cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA
trong rễ tơ Đan sâm được xác định bằng phương pháp sắc ký l ng cao áp (HPLC)
tại Phòng Thí nghiệm Trung tâm – Khoa Công nghệ Thực phẩm – Học viện Nông
nghiệp Việt Nam.
3.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các chỉ tiêu được theo dõi và đo đếm sau 2-10 tuần tùy từng thí nghiệm. Số
liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel và IRRISTAT 5.0.
Mô hình thống kê sử dụng cho thí nghiệm
Yij = µij + aij + eij; Trong đó: i=1….I; j= 1……Ii
- Yij: Giá trị quan sát của chỉ tiêu theo dõi
- µij: Giá trị trung bình mẫu
- ai: Hiệu quả của công thức thí nghiệm i
- eij: Sai số ngẫu nhiên của các giá trị quan sát
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH IN VITRO CÂY ĐAN SÂM

7,40
2,3
0,21

Số lá/chồi
5,43
7,35
6,20
6,00
6,09
1,9
0,21

GA3 có tác dụng làm tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt Đan sâm trên môi trường MS.
Nồng độ bổ sung tối ưu nhất là 1,0 mg/l GA3, cho tỷ lệ hạt nảy mầm đạt 40,43%.
4.1.2. Nhân nhanh chồi
Trong nhân giống cây trồng in vitro, để có được hệ số nhân giống cao, số lượng
cây giống lớn, đồng nhất, cây có sức sinh trưởng tốt thì việc xác định được môi trường
nhân nhanh thích hợp có vai trò quyết định. Cytokinin là nhóm chất điều tiết sinh
trưởng đóng vai trò quan trọng trong việc điều khiển sự tái sinh mẫu cấy theo hướng
tạo chồi làm tăng hệ số nhân. Tuy nhiên, với mỗi loại chất kích thích sinh trưởng khác
nhau sẽ có hiệu quả khác nhau ở mỗi loài cây và giai đoạn nuôi cấy.
Bổ sung BA làm tăng hệ số nhân chồi Đan sâm so với công thức đối chứng.
Trong đó, môi trường MS+0,5mg/l BA cho hệ số nhân chồi (5,05 lần) và chiều cao
chồi (4,08 cm) đạt cao nhất (Bảng 4.2).
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của BA đến hiệu quả nhân nhanh chồi Đan sâm
sau 4 tuần nuôi cấy
BA (mg/l)
0,0
0,5

Kinetin (mg/l)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
CV%
LSD0,05

Hệ số nhân (lần)
1,08
2,58
2,58
2,62
3,04
7,1
0,3
11

Chiều cao chồi (cm)
3,13
3,83
3,24
3,42
3,67
10,1
0,3


Bổ sung kinetin (từ 0,1 – 0,5 mg/l) vào môi trường MS + 0,5 mg/l BA đã làm

3,15
2,67
3,11
3,36
5,2
0,11

Bổ sung kết hợp 0,5 mg/l BA và α-NAA ở nồng độ 0,01 – 0,1 mg/l đã làm
giảm hệ số nhân chồi cũng như chất lượng chồi Đan sâm. Trong các công thức kết
hợp giữa BA và α-NAA, hệ số nhân chồi đạt cao nhất là 3,37 lần ở công thức bổ
sung kết hợp 0,5 mg/l BA và 0,01 mg/l α-NAA, tuy nhiên, hệ số nhân này thấp hơn
công thức đối chứng chỉ bổ sung 0,5 mg/l BA (5,05 lần). Tương tự như trong
trường hợp bổ sung kết hợp BA và kinetin, bổ sung BA và α-NAA đã làm giảm
chiều cao chồi Đan sâm (Bảng 4.5).
Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp BA và α-NAA đến hiệu quả nhân nhanh chồi
Đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy
BA (mg/l)

0,5

α-NAA (mg/l)
0,00
0,01
0,025
0,05
0,075
0,10
CV%
LSD0,05


nuôi cấy chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin hoặc than hoạt tính cũng giúp
nâng cao hiệu quả ra rễ của chồi in vitro. Trong nghiên cứu này, các chồi Đan sâm
có chiều cao 2-3 cm, sinh trưởng phát triển bình thường được cấy chuyển sang môi
trường ½ MS bổ sung α-NAA, IAA, IBA để cảm ứng tạo rễ.
12


Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của α-NAA tới khả năng ra rễ của chồi Đan sâm
sau 4 tuần nuôi cấy
α-NAA (mg/l)
0,00
0,10
0,25
0,50
0,75
1,00
CV%
LSD0,05

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)
100,00
79,17
79,17
92,31
76,92
73,08

Số rễ (rễ)
2,40
2,84

0,75
1,00
CV%
LSD0,05

Tỷ lệ chồi ra rễ (%)
100,00
91,67
100,00
100,00
87,50
84,62

Số rễ TB (rễ)
2,40
3,50
3,88
3,65
3,45
3,10
4,2
0,25

Chiều dài TB rễ (cm)
4,23
6,30
5,26
7,24
4,16
6,30

2,40
3,71
3,69
4,25
6,19
5,62
2,8
0,22

Ghi chú: môi trường nền là ½ MS
13

Chiều dài TB rễ (cm)
4,23
8,63
9,65
11,03
9,29
9,02
1,2
0,19


Trên môi trường bổ sung IAA, tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100%, số rễ TB đạt 3,69 –
6,19 rễ và chiều dài rễ dao động từ 8,63 đến 11,03 cm sau 4 tuần nuôi cấy (Bảng 4.8).
Như vậy, môi trường thích hợp nhất để tạo rễ cho chồi là MS bổ sung 0,75 mg/l
IAA cho 100% với số rễ trung bình đạt 6,19 rễ/chồi và chiều dài rễ đạt 9,29 cm.
4.1.4. Thích nghi cây ngoài vƣờn ƣơm
Thời gian nuôi cấy trên môi trường ra rễ có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của cây
Đan sâm cấy mô khi ra cây ngoài vườn ươm. Cây in vitro nuôi cấy trên môi trường


9,33

40

100

5,93

9,40

3,4
0,38

3,6
0,89

CV%
LSD0,05

Chất lượng cây
Cây và lá nh , lá
màu xanh nhạt
Cây mập, lá to, lá
màu xanh đậm
Cây cao, mập, lá to,
lá màu xanh đậm

Tỷ lệ sống của cây Đan sâm dao động rất lớn giữa các giá thể khác nhau. Tỷ
lệ cây sống đạt cao nhất (100%) trên giá thể chứa 50% xơ dừa và 50% cát. Khi

3,40

Đất: cát (1:1)

36,67

3,33

2,87

3,34

9,27

5,31

9,07

3,0

4,0

Xơ dừa: cát
93,33
(3:7)
Xơ dừa: cát
100
(1:1)
CV%
LSD0,05

Mô lá
Cuống lá
Đoạn thân

Tỷ mẫu
tạo rễ (%)
53,85
0
0

Số rễ/mẫu
(rễ)
8,54
0
0

A

B

C

Hình 4.1. Ảnh hƣởng của vật liệu lây
nhiễm đến khả năng tạo rễ tơ cây Đan
sâm: A: mô lá; B: cuống lá; C: đoạn thân.
4.2.2. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A.rhizogenes đến khả năng tạo rễ tơ từ
mô lá Đan sâm
Có sự khác nhau về tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu khi lây nhiễm mô lá Đan
sâm với vi khuẩn ở các mật độ khác nhau tương ứng với các giá trị OD600 = 0,05;
0,1; 0,2 và 0,3. Tỷ lệ mô lá tạo rễ (53,85%) và số rễ/mẫu (8,54 rễ) đạt cao nhất khi

rễ tơ từ mô lá Đan sâm
Nghiên cứu đã thu được 4 dòng rễ tơ chuyển gen sau khi kiểm tra sự có mặt
của gen rolA và virD bằng phương pháp PCR trong 10 dòng rễ thu nhận được sau
lây nhiễm với vi khuẩn A.rhizogenes. Qua khảo sát nhận thấy, các dòng rễ tơ này
tăng sinh khối nhanh, ổn định trong môi trường nuôi cấy không chứa chất điều tiết
sinh trưởng.
4.2.3. Ảnh hƣởng của thành môi phần môi trƣờng đến sinh khối rễ tơ Đan sâm
dòng A5.14
Trong hai môi trường khảo sát là MS và B5, môi trường B5 là thích hợp để nhân
nuôi rễ tơ cây Đan sâm, cho sinh khối rễ cao hơn so với môi trường MS (Bảng 4.13).
15


Do vậy B5 được lựa chọn làm môi trường nên để nhân nuôi rễ tơ Đan sâm ở những thí
nghiệm sau.
Bảng 4.13. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ Đan sâm
dòng A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy
Môi trường
MS
B5
CV%
LSD0,05

Khối lượng rễ
ban đầu (g)
0,55
0,57

Khối lượng rễ tươi
sau 4 tuần (g)

Phân lớp
CV%
LSD0,05

Khối lượng rễ
ban đầu (g)
0,57
0,69
0,73
0,77

Khối lượng rễ tươi
sau 4 tuần (g)
4,34
2,53
2,25
2,18
4,2
0,33

Khối lượng rễ
tăng (lần)
7,67
3,67
3,08
2,83

Khối lượng
rễ khô (g)
0,37


Khối lượng rễ
tươi sau 10 tuần
(g)
11,97
13,12
8,25
12,95
1,5
0,38
16

Khối lượng
rễ tăng
(lần)
14,25
15,90
9,70
14,70

Khối lượng
rễ khô
(g)
0,703
0,837
0,547
0,757
4,3
0,06


11,80
10,67
14,82
7,55
10,63
9,62
13,19
8,61
11,96
3,6
0,58

Khối lượng
rễ khô (g)
0,573
0,643
0,530
0,660
0,580
2,8
0,03

Tuy nhiên, hàm lượng hoạt chất cryptotanshinone và tanshinone I tích lũy
trong rễ sau 8 tuần nuôi cấy đạt thấp ở CT2, tương ứng 0,061% và 0,056% chất khô.
Ngược lại, hàm lượng các hoạt chất này tích lũy cao nhất khi nuôi cấy rễ ở điều kiện
3 tuần 16h sáng/8h tối và 5 tuần tối hoàn toàn (CT3) với hàm lượng
cryptotanshinone đạt 0,754% và hàm lượng tanshinone I đạt 0,257% chất khô. Trong
khi đó, hàm lượng tanshinone IIA đạt cao nhất (0,145% chất khô) khi nuôi cấy ở
điều kiện 4 tuần 16h sáng/8h tối và 4 tuần tối hoàn toàn (CT4) và đạt thấp nhất
(0,072% chất khô) khi nuôi cấy rễ tơ 8 tuần trong tối hoàn toàn (CT1) (Bảng 4.17).

0,145
0,101

4.2.7. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối rễ tơ Đan sâm
Khối lượng rễ tơ Đan sâm tăng tuyến tính từ tuần thứ 2 và đạt cực đại vào tuần
thứ 8. Sau 8 tuần nuôi cấy, khối lượng rễ tươi tăng 13,96 lần. Tuy nhiên, sau 10 tuần
17


nuôi cấy, sinh khối rễ tươi giảm so với tuần thứ 8, chỉ còn 12,40 lần (Bảng 4.18). Như
vậy, thời điểm dừng nuôi cấy rễ tơ Đan sâm thích hợp là 8 tuần sau nuôi cấy.
Bảng 4.18. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến tốc độ tăng sinh khối
rễ tơ Đan sâm dòng A5.14
Thời gian
nuôi cấy
2 tuần
4 tuần
6 tuần
8 tuần
10 tuần
CV%
LSD0,05

Khối lượng rễ
ban đầu (g)
0,71
0,72
0,71
0,72
0,72

sự tích lũy hoạt chất mục tiêu của rễ tơ Đan sâm dòng A5.14
Kết quả sau 8 tuần nuôi cấy, tốc độ tăng trưởng của rễ Đan sâm trên môi
trường bổ sung phối hợp BA và TDZ/ABA thấp hơn so với tốc độ tăng trưởng của
rễ Đan sâm trên môi trường đối chứng (B5) (Bảng 4.19).
Bảng 4.1 . Ảnh hƣởng của tổ hợp của tổ hợp TDZ, ABA và BA đến sự tăng
sinh khối rễ tơ Đan sâm dòng A5.14
Môi trường
B5
B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l BA
B5 + 0,5 mg/l TDZ + 0,5 mg/l ABA
CV%
LSD0,05

Khối lượng Khối lượng rễ
rễ ban đầu tươi sau 8 tuần
(g)
nuôi cấy (g)
0,75
7,33
0,74
6,94
0,74
4,37
4,4
0,31

Khối
Khối
lượng rễ lượng rễ
tăng (lần) khô (g)

0,085

Tanshinone IIA
(% chất khô)
0,203
0,125
0,158


4.2.9. Ảnh hƣởng của một số yếu tố elicitor đến sự tổng hợp hoạt chất mục tiêu
của rễ tơ Đan sâm dòng A5.14
Sinh khối rễ tơ đạt được trên môi trường bổ sung elicitor cao hơn so với trên
môi trường đối chứng không bổ sung elicitor. Cụ thể, sinh khối rễ tươi Đan sâm
trên môi trường chứa elicitor tăng từ 7,37 đến 8,66 lần, trong khi đó sinh khối rễ
Đan sâm trên môi trường đối chứng tăng 7,13 lần. Sinh khối rễ Đan sâm đạt cao
nhất trong trường hợp bổ sung 100 mg/l YE + 0,1 mM ABA, tăng 8,66 lần sau 39
ngày nuôi cấy (Bảng 4.21).
Bảng 4.21. Ảnh hƣởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối rễ tơ
Đan sâm dòng A5.14 (sau 3 ngày nuôi cấy)
Khối lượng Khối lượng
Khối
Khối
Công thức
rễ ban đầu rễ tươi sau 39 lượng rễ lượng rễ
(g)
nuôi cấy (g) tăng (lần) khô (g)
B5
0,70
4,99
7,13

đã làm tăng hàm lượng hoạt chất mục tiêu tích lũy trong rễ tơ Đan sâm so với môi
trường đối chứng không bổ sung elicitor.
Bảng 4.22. Ảnh hƣởng của các elicitor đến sự tích lũy các hoạt chất mục tiêu
dòng A5.14 sau 39 ngày nuôi cấy
Tanshinone
Cryptotanshinone Tanshinone I
IIA
Môi trường
(% chất khô)
(% chất khô)
(% chất
khô)
B5
0,126
0,082
0,113
B5 + 100 mg/l YE + 50 g/l sorbitol
0,227
0,106
0,141
B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít salicylic
0,161
0,098
0,108
B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM Methyl Jasmonate
0,549
0,230
0,213
B5 + 100 mg/l YE + 0,1 mM axít abscisic
0,221

thấy, đối với cây đan sâm tỷ lệ tươi/khô biến động từ 3,4 - 4.
TV3 cây sinh
trưởng tốt nhất nên cho tỷ lệ tươi/khô cao nhất đạt 4 lần.
Bảng 4.23. Ảnh hƣởng của thời vụ đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng
suất dƣợc liệu Đan sâm
Thời vụ
TV1
TV2
TV3
TV4
TV5
TV6
CV%
LSD0,05

Số củ/cây Chiều dài
(củ có đường
củ
kính> 6 mm) (cm)
8,1
23,0
9,9
25,8
12,2
29,2
8,9
23,6
8,1
21,0
7,2

Tỷ lệ
Năng suất
tươi/khô thực thu
(%)
(tấn/ha)
3,4
2,76
3,8
3,11
4,0
3,35
3,5
2,52
3,4
2,25
3,4
1,92
5,0
0,24

Cả ba hoạt chất phân tích đều tích lũy cao nhất khi trồng cây ở thời vụ tháng
3. Cụ thể, hàm lượng cryptotanshinone đạt 0,221%, hàm lượng tanshinone đạt
0,070% và hàm lượng tanshinone IIA đạt 0,247% chất khô (Bảng 4.24).
20


Như vậy, trong sáu thời vụ trồng khảo sát, thời vụ trồng tháng 3/2014 cho
cây Đan sâm sinh trưởng, phát triển, năng suất và tích lũy hoạt chất mục tiêu cao
nhất. Do vậy, trong sáu thời vụ khảo sát, tháng 3 là thời vụ trồng cây Đan sâm thích
hợp tại Gia Lâm - Hà Nội.

32,2
7
11,5
31,5
CV%
5,3
4,9
LSD0,05
1,0
2,5

Đường
kính củ
(cm)
1,9
2,2
2,5
2,7
2,6
4,2
0,19

Khối lượng
củ/cây
(g)
231,7
279,3
315,7
327,3
337,6

sâm. Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.26
Số củ/cây (11,4 củ), chiều dài củ (25,4 cm), đường kính củ (2,3 cm) và khối
21


lượng củ (282,7 g) đạt cao nhất khi bón 2 tấn phân vi sinh, 90 kg N, 120 kg P2O5 và
90 kg K2O/ha (CT4). Đây cũng là công thức bón phân cho năng suất cao nhất, đạt
3,13 tấn/ha. Trong khi đó, nếu chỉ bón phân vi sinh mà không bón bổ sung phân
NPK, năng suất củ Đan sâm chỉ đạt 1,91 tấn/ha (Bảng 4.26).
Bảng 4.26. Ảnh hƣởng của phân bón đến năng suất dƣợc liệu Đan sâm
CT
CT1
CT2
CT3
CT4
CT5
CV%
LSD0,05

Số củ/cây (củ có
Chiều dài củ Đường kính
đường kính > 6 mm)
(cm)
củ (cm)
6,7
8,4
9,6
11,4
9,8
7,1

17,04

1,91
2,30
2,75
3,13
2,77
3,5
0,17

Từ kết quả trên có thể thấy, khi cây Đan sâm không được bón phân đầy đủ,
cây không được cung cấp đủ chất dinh dưỡng, cây sinh trưởng, phát triển kém dẫn
đến bộ rễ phát triển kém. Trong khi đó, nếu bón phân đầy đủ cho cây, cây phát triển
cân đối, tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển và hình thành củ, củ lớn nhanh. Tuy
nhiên, nếu bón phân quá nhiều sẽ thúc đẩy sự phát triển mạnh về thân lá, bộ rễ ăn
nông, do vậy mà ảnh hưởng đến năng suất củ.
Theo nghiên cứu của Chen et al. (1992), N, P, K đóng vai trò rất quan trọng
sinh trưởng, phát triển, năng suất và tích lũy hoạt chất mục tiêu của cây Đan sâm.
Hai thời điểm hấp thụ N và P cao nhất của cây Đan sâm là 90-100 ngày và 150-170
ngày sau khi trồng. Thời điểm đầu cây Đan sâm phát triển mạnh các bộ phận sinh
dưỡng, trong khi đó thời điểm thứ 2 là thời kỳ lan rộng của rễ cây Đan sâm. Theo
Han et al. (2005); Sheng (2006), Đan sâm là cây dược liệu có nhu cầu photpho cao,
khối lượng củ Đan sâm tăng tỷ lệ thuận với lượng phân bón chứa photpho do hàm
lượng photpho cao trong phân bón giúp hấp thu photpho từ trong đất. Trong khi đó
ảnh hưởng của N đến các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất dược liệu Đan
sâm là do N có tác dụng kích thích quá trình quang hợp của lá (Han and Liang,
2005) và kéo dài rễ (Sheng, 2007).
4.3.3.1. Ảnh hưởng của phân bón đến chất lượng dược liệu đan sâm
Hàm lượng cryptotanshinone đạt cao nhất (0,191%) khi bón phân ở liều
lượng 90 N, 120 P và 90 K cho cây Đan sâm. sự tích lũy của hai hoạt chất


Tanshinone IIA
(%)
0,199
0,183
0,191
0,245
0,218

4.3.3.2. Ảnh hưởng của phân bón đến hiệu quả kinh tế trồng cây đan sâm
Kết quả tính toán cho thấy, tại các công thức bón phân N, P, K cho lãi thuần
thu được sau 10 tháng trồng đều cao hơn công thức đối chứng. Cụ thể, ở công
thức chỉ bón 2 tấn phân vi sinh, thu nhập thuần là 123,245 triệu đồng, ở các công
thức bón phân N, P, K, thu nhập thuần dao động từ 148,478 triệu đồng (CT2) đến
240,810 triệu đồng (CT4). Từ đó cho thấy việc sử dụng phân bón trong quá trình
sản xuất dược liệu Đan sâm giúp nâng cao hiệu quả kinh tế một cách rõ rệt và liều
lượng phân bón ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả kinh tế trồng cây Đan sâm. Trong
các công thức bón phân, công thức bón 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg
P2O5 + 90 kg K2O/ha (CT4) cho thu nhập thuần đạt cao nhất (240,810 triệu đồng).
Như vậy, phân bón có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng, phát triển và
năng suất dược liệu Đan sâm. Xét về hiệu quả kinh tế, việc bón phân cũng giúp
làm tăng thu nhập thuẩn so với công thức không bón phân. Trong các công thức
bón phân, công thức bón 2 tấn phân vi sinh + 90 kg N + 120 kg P2O5 + 90 kg
K2O/ha là phù hợp nhất cho cây Đan sâm trong điều kiện Hà Nội.
Bảng 4.28. Ảnh hƣởng của liều lƣợng phân bón đến hiệu quả kinh tế
trồng cây Đan sâm
Đơn vị: 1000 đồng
Phân bón
CT


480 855 16.000 61.000 134.790
600 1.140 16.000 64.000 138.495

Năng
suất
thực thu
(tấn/ha)
1,91
2,30
2,75
3,13
2,77

Giá
bán
1 kg
khô
120
120
120
120
120

Tổng
thu

Thu
nhập
thuần