ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ KHÁNH TÂM

XÁC ĐỊNH VAI TRÒ GÂY TIÊU CHẢY
CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI TRÊN NGAN, VỊT
TẠI TỈNH BẮC GIANG VÀ BIỆN PHÁP ĐIỀU TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Thái Nguyên, năm 2010


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ KHÁNH TÂM

XÁC ĐỊNH VAI TRÒ GÂY TIÊU CHẢY
CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI TRÊN NGAN, VỊT
TẠI TỈNH BẮC GIANG VÀ BIỆN PHÁP ĐIỀU TRỊ

Chuyên ngành: Thú y
Mã số: 60.62.50

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Nguyễn Quang Tính



MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Trang
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài. ..................................................................................... 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................... 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 3
1.1. Một số hiểu biết về hội chứng tiêu chảy .................................................. 3
1.1.1. Khái niệm về hội chứng tiêu chảy ..................................................... 3
1.1.2. Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở vật nuôi ................................... 3
1.1.2.1. Ảnh hưởng của môi trường, khí hậu ........................................... 3
1.1.2.2. Nguyên nhân do vi sinh vật ........................................................ 4
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước.............................................. 6
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước....................................................... 6
1.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .................................................... 12
1.3. Một số đặc tính của vi khuẩn E. coli nói chung và các chủng gây
bệnh ở gia cầm nói riêng................................................................................ 13
1.3.1. Đặc điểm hình thái và sức đề kháng của vi khuẩn........................... 13
1.3.2. Đặc điểm nuôi cấy............................................................................ 14
1.3.3. Đặc tính sinh hoá học....................................................................... 15


2.2.2.3. Xác định khả năng sản sinh độc tố của một số chủng vi
khuẩn E. coli phân lập được................................................................... 34
2.2.2.4. Xác định serotype của một số chủng vi khuẩn E. coli phân
lập được.................................................................................................. 34
2.2.2.5. Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn E. coli phân
lập được trên động vật thí nghiệm. ........................................................ 35
2.2.2.6. Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của một số
chủng vi khuẩn E. coli phân lập được.................................................... 35
2.2.3. Thử nghiệm một số phác đồ điều trị tiêu chảy ở ngan, vịt. ............ 35
2.3. Nguyên liệu ............................................................................................ 35
2.3.1. Mẫu nghiên cứu................................................................................ 35
2.3.2. Động vật thí nghiệm......................................................................... 35
2.3.3. Môi trường, hoá chất........................................................................ 35
2.4. Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 36
2.4.1. Phương pháp chọn mẫu điều tra....................................................... 36
2.4.2. Phương pháp lấy mẫu và phân lập vi khuẩn .................................... 36
2.4.3. Xác định khả năng sản sinh độc tố của một số chủng vi khuẩn
E. coli phân lập được bằng phản ứng PCR ................................................ 38
2.4.4. Phương pháp xác định serotype kháng nguyên O của một số
chủng vi khuẩn E. coli phân lập được......................................................... 40
2.4.5. Phương pháp xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn E. coli
phân lập được ............................................................................................. 41
2.4.6. Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của
một số chủng vi khuẩn E. coli phân lập được. ........................................... 41
2.4.7. Xây dựng phác đồ điều trị tiêu chảy ở ngan, vịt .............................. 42
2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu................................................................ 43
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 44
3.1. Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng tiêu chảy ở ngan, vịt tại Bắc Giang....... 44




: Avian Pathogenic Escherichia coli

ATP

: Adenozin Triphosphat

ADN

: Acid Deoxyribonucleic

ARN

: Acid Ribonucleic

BHI

: Brain Heart Infusion

Bp

: Base pair

Cnf

: Cytotoxic necrotizing factor

ColV

: Colicin V

LPS

: Lipo polysaccharide

LT

: Heat- Labile- toxin

L

: Lít

MHSA

: Mannose Resistance Haemagglutination

MRSA

: Mannose Sensitive Haemagglutination

MR

: Methyl Red

NCCLS

: National Committee of Clinical Laboratory Satndards

Nxb



TT

: Thể trọng

TSB

: Tryptone soy broth

Tr

: Trang

UV

: Ultraviolet

VT

: Verotoxin

VP

: Voges Proskauer


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Ký hiệu chuỗi ADN của các cặp mồi dùng để xác định khả năng
sản sinh độc tố của vi khuẩn APEC và kích cỡ của các sản phẩm

chủng vi khuẩn E. coli phân lập được.........................................63


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, cùng với xu hướng phát triển của các
ngành, nghề khác, ngành chăn nuôi đã có những bước tiến không ngừng,
trong đó phải kể đến chăn nuôi vịt, ngan. Chăn nuôi vịt, ngan là một trong
những nghề truyền thống gắn bó với người nông dân Việt Nam. Hiện nay,
không chỉ dừng lại ở phương thức chăn nuôi tận dụng, nhỏ lẻ mà nó còn được
mở rộng ở những mô hình kinh tế trang trại với hình thức nuôi công nghiệp
và bán công nghiệp, mang lại một nguồn lợi đáng kể cho nền kinh tế quốc dân
nói chung và kinh tế gia đình nói riêng.
Đời sống con người ngày một nâng cao, đòi hỏi các sản phẩm chăn
nuôi không chỉ đáp ứng đủ, hàm lượng dinh dưỡng cao mà còn phải đảm bảo
không nhiễm độc tố, không tồn dư kháng sinh và không nhiễm các vi sinh vật
gây bệnh. Để làm được điều này, bên cạnh công tác giống thì công tác thú y
phòng bệnh và quy trình chăn nuôi cần phải được đặc biệt quan tâm. Tuy
nhiên, không phải người chăn nuôi nào cũng hiểu biết đúng đắn về thú y
phòng bệnh.
Ngoài các bệnh Cúm gia cầm, Dịch tả vịt, Viêm gan vịt, Tụ huyết
trùng... có thể làm thành dịch bệnh gây thiệt hại đáng kể về kinh tế cho người
chăn nuôi thì tiêu chảy cũng là một trong những bệnh thường gặp đối với
ngan, vịt. Bệnh xảy ra ở mọi nơi, mọi giống và mọi lứa tuổi. Ngan, vịt bị bệnh
thường kém ăn, tăng trưởng kém, ủ rũ, phân trắng xanh…
Tiêu chảy xảy ra do rất nhiều nguyên nhân: thức ăn, độc tố, virus, vi
khuẩn... Nguyên nhân tiêu chảy do vi khuẩn phải kể đến vai trò của vi khuẩn
Escherichia coli (E. coli). E. coli là vi khuẩn thường trực trong đường tiêu

1.1. Một số hiểu biết về hội chứng tiêu chảy
1.1.1. Khái niệm về hội chứng tiêu chảy
Tiêu chảy là triệu chứng chung, đặc trưng và thường xuất hiện trong
bệnh lý đường tiêu hoá.
Theo Blackwell T. E (1989) [39], tiêu chảy ở vật nuôi là một hiện
tượng bệnh lý phức tạp gây ra bởi sự tác động tổng hợp của nhiều yếu tố. Một
trong những nguyên nhân quan trọng là sự tác động bất lợi của ngoại cảnh,
gây ra các stress cho cơ thể. Mặt khác, chăm sóc nuôi dưỡng kém, chuồng trại
không vệ sinh sạch sẽ, thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn... cũng tạo điều
kiện thuận lợi cho sự xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là các vi
sinh vật gây bệnh đường tiêu hoá. Từ đó dẫn tới sự nhiễm và gây loạn khuẩn
đường ruột. Đây là nguyên nhân đóng vai trò quan trọng trong hội chứng tiêu
chảy. Bệnh lý xuất hiện ở thể cấp tính hoặc mãn tính, phụ thuộc vào tính chất
và nguyên nhân gây bệnh tác động. Đặc điểm của sự rối loạn về tiêu hóa
thường là gây tiêu chảy nhiều lần trong ngày, trong phân có nhiều nước so với
bình thường do tăng tiết dịch ruột.
Với bất kể nguyên nhân gây bệnh nào thì triệu chứng tiêu chảy vẫn
luôn được coi là đặc điểm phổ biến nhất trong các dạng bệnh của đường tiêu
hoá, xảy ra ở mọi lúc mọi nơi đặc biệt với gia súc non (Griffin. J. F. T, 1985)
[59], (Radostits. O. M et al, 1994) [84], với cùng một hậu quả: tiêu chảy dẫn
đến mất nước, thiếu hụt các chất địên giải, suy kiệt cơ thể, nếu trầm trọng dễ
bị trụy tim mạch và chết (Kaufmann. J, 1996) [68]
1.1.2. Một số nguyên nhân gây tiêu chảy ở vật nuôi
1.1.2.1. Ảnh hưởng của môi trường, khí hậu
Môi trường ngoại cảnh là yếu tố thường xuyên tác động và ảnh hưởng
rõ rệt đến sức đề kháng của cơ thể vật nuôi. Khi nhiệt độ, ẩm độ của tiểu khí


4
hậu chuồng nuôi thay đổi đều ảnh hưởng đến sức khoẻ của vật nuôi, đặc biệt

- Vi khuẩn phải có khả năng sản sinh các yếu tố gây bệnh, đặc biệt là
sản sinh độc tố, trong đó quan trọng là độc tố đường ruột Enterotoxin.
- Có khả năng xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô của niêm mạc ruột, từ
đó phát triển nhân lên.
Một số vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột là E. coli, Salmonella sp,
Shigella, Klebsiella, C. perfingens... Đây là những vi khuẩn quan trọng, gây rối
loạn tiêu hoá, viêm ruột tiêu chảy ở người và nhiều loài động vật khác.
* Tiêu chảy do virut
Có hơn 10 loại virut có tác động làm tổn thương đường tiêu hoá gây viêm
ruột ỉa chảy như: Enterovirus, Rotavirus, Coronavirus, Adenovirus type IV.
Nhiều virut gây bệnh đường tiêu hoá làm tổn thương các niêm mạc
ruột, phá huỷ quá trình hấp thu và điều tiết dịch dẫn đến tiêu chảy nặng như:
Coronavirus 1, Coronavirus 2, Rotavirus...Bệnh lý xuất hiện chủ yếu là viêm
ruột, viêm kết tràng, manh tràng, tiêu chảy cấp hoặc mãn tính, phân lỏng, màu
vàng, đôi khi lẫn máu, tỷ lệ mắc bệnh và chết trong đàn cao. Nguyên nhân rối
loạn tiêu hoá và tiêu chảy do Coronavirus 2 gây ra bệnh TGE (Transmissible
Gastro Enteritis) với triệu chứng nôn mửa kèm theo tiêu chảy có nhiều nước,
phân màu vàng hoặc hơi xanh, mùi hôi thối (Radostits O. M et al, 1994) [84]
* Tiêu chảy do ký sinh trùng
Các ký sinh trùng ký sinh trong đường tiêu hoá, ngoài tác động chiếm
đoạt chất dinh dưỡng của vật chủ còn có một tác hại lớn khác là gây tổn
thương niêm mạc ruột, tạo điều kiện cho các vi khuẩn xâm nhập gây bệnh làm
rối loạn quá trình phân tiết, viêm ruột và tiêu chảy cấp hoặc mãn tính.
Theo Nguyễn Thị Kim Lan và cs (2006) [12], cầu trùng và một số loại
giun tròn (giun đũa, giun tóc, giun lươn) là một trong những nguyên nhân gây
tiêu chảy ở lợn sau cai sữa nuôi trong các hộ gia đình tại Thái Nguyên.


6
* Tiêu chảy do nấm mốc

coli (45,63%) trong đó có 38 chủng phân lập từ gà và 9 chủng phân lập từ
trứng gà. 3 type E. coli đã xác định là O1: K1 (8,51%); O2: K1 (8,51%);
O78: K80 (12,76%).
Tác giả Nguyễn Thiên Thu và cs (2004) [28] nghiên cứu bệnh do E. coli
gây ra trên vịt nuôi tại một số tỉnh miền Trung. Trong tổng số 159.970 con vịt
điều tra thì có 17.056 con (10,11%) vịt chết nghi do E. coli. Vịt nuôi tại các tỉnh
Ninh Thuận, Phú Yên, Khánh Hoà, Quảng Ngãi có tỷ lệ chết ở độ tuổi dưới 1
tháng tuổi trung bình là 10,96% và từ 1- 2 tháng tuổi trung bình là 10,27%
Vũ Khắc Hùng và cs (2005) [7] bằng phản ứng PCR đã tiến hành xác
định các loại kháng nguyên bám dính ở vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con bị
tiêu chảy, cho kết quả như sau: trong số 220 chủng E. coli phân lập từ lợn con
theo mẹ bị tiêu chảy có 56,80% (125/220) chủng mang kháng nguyên bám dính
và Intimin. Tỷ lệ các chủng mang F4, F18, F5+ F41, F6, F17, F4+ F18 và Intimin
tương ứng là 37,70%; 8,60%; 3,20%; 2,70%; 1,40%; 0,40% và 3,20%.
Trong 218 chủng E. coli phân lập từ lợn con sau cai sữa bị tiêu chảy thì
có 59,00% số chủng mang kháng nguyên bám dính và Intimin; tỷ lệ các
chủng mang F4, F18, F6, F17, F5+ F41, F4+ F18 và Intimin tương ứng là 18,80%;
33,00%; 3,20%; 1,80%; 0,40% và 1,40%. Từ những kết quả này, tác giả đã
khẳng định kháng nguyên bám dính F4 đóng vai trò quan trọng trong bệnh
tiêu chảy ở lợn con theo mẹ.
Tác giả Trương Quang (2005) [17] khi nghiên cứu về vai trò gây bệnh
của vi khuẩn E. coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn từ 1- 60 ngày tuổi tại Hà
Nội và vùng phụ cận đã khẳng định tỷ lệ chủng E. coli có độc lực mạnh và
các yếu tố gây bệnh của lợn bị tiêu chảy cao hơn rất nhiều so với lợn không bị
tiêu chảy. Yếu tố bám dính, khả năng dung huyết, độc tố chịu nhiệt, độc tố
không chịu nhiệt, độc lực mạnh của các chủng phân lập từ lợn bị tiêu chảy và


8
không bị tiêu chảy là: 93,33%- 33,33%; 53,33%- 25,92%; 90,00%- 14,81%;

tiêu chảy tại trại giống lợn Văn Giang- Hưng Yên và trại giống lợn Trâu QuỳHà Nội, Phạm Thế Sơn và cs (2008) [19] đã kết luận: biến động tổng số vi
khuẩn /1g phân ở lợn khoẻ trung bình là 132,64 ×106, khi mắc tiêu chảy là
235,51×106. Bằng phương pháp PCR đã xác định được trong tổng số 25
chủng E. coli kiểm tra có tới 100% số chủng sinh độc tố STb; 62,56% số
chủng sinh STa; 44,15% số chủng sinh độc tố LT và 68,53% số chủng sinh cả
3 loại độc tố (STa +STb +LT). Ngoài ra, các tác giả cũng xác định được tỷ lệ
các gen sản sinh các kháng nguyên bám dính K88 và K99 từ các chủng E. coli
tại Hà Nội và Hưng Yên là 76%, 24% và 80%, 20%.
Võ Thành Thìn và cs (2008a) [25] đã ứng dụng phương pháp multiplex
PCR để phát hiện khả năng tranh giành sắt của vi khuẩn E. coli gây bệnh ở gà
tại Khánh Hoà và Phú Yên. Nghiên cứu đã thiết lập bốn phản ứng multiplex
PCR (fhuA/ iutA/ iron; fyuA/ fepA; chuA/ ireA/ fecA; fhuE/ cir) để phát hiện
gen quy định sinh tổng hợp cho iron receptor của các chủng vi khuẩn E. coli
gây bệnh ở gà. Mặt khác, nghiên cứu cũng cho biết về tỷ lệ các chủng vi
khuẩn mang gen fhuA, iutA, iron, fyuA, fepA, fhuE, cir, ireA, fecA và chuA
lần lượt là 50%, 90%, 75%, 25%, 100%, 95%, 95%, 55%, 45% và 45%.
Võ Thành Thìn và cs (2008b) [26] nghiên cứu một số yếu tố độc lực
của các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh ở gà. Từ 96 chủng E. coli phân lập
được bằng phản ứng ngưng kết với 25 kháng huyết thanh chuẩn, các chủng vi
khuẩn được xác định là thuộc 15 serotypes khác nhau. Trong đó O8 chiếm tỷ
lệ cao nhất là 10,42%, tiếp theo là O15 chiếm tỷ lệ 8,33%, O115 là 4,17%; O2,
O5, O17, O83 là 3,13%; O6, O20, O103 là 2,08%; O8, O9, O88, O102, O132 là
1,04%. Không có chủng E. coli nào thuộc O1, O78 và có tới 53,13% chủng vi


10
khuẩn không xác định được. Bằng phương pháp ức chế bổ thể đã xác định
được 85,90% chủng có khả năng đề kháng mạnh với huyết thanh gà, đây là
yếu tố độc lực quan trọng giúp các chủng APEC có thể tồn tại và nhân lên
trong máu. Từ đây vi khuẩn theo máu đến các khí quan trong cơ thể và gây

khuẩn coli ở một số giống gà hướng thịt tại Bắc Ninh. Theo dõi 10 đàn gà
giống ISA màu và Ross 308 thì thấy có 11,21% gà chết do trực khuẩn E. coli.
Khi mắc bệnh do E. coli thì 100% gà có biểu hiện ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn và ỉa
chảy; 85,39% biểu hiện chảy nước mắt, nước mũi; 78,76% biểu hiện khó thở
và 59,07% bị xệ bụng; hiện tượng sưng khớp, sưng đầu ít xuất hiện. Khi mổ
khám, có biểu hiện bệnh tích như sau: 100% gà bị viêm xoang bụng; 85,49%
bị viêm màng tim, gan sưng to, gan bị hoại tử, bao phủ lớp fibrin màu trắng
đục; 73,06% gà có lách sưng to; 68,39% gà bị viêm túi khí; hiện tượng hoại
tử da và viêm khớp ít khi xuất hiện. Gà mắc bệnh có biểu hiện đặc trưng ở
giai đoạn từ tuần tuổi thứ 3 đến thứ 5, ở các lứa tuổi khác những biểu hiện của
bệnh vẫn điển hình nhưng tần suất xuất hiện giảm đi.
Nguyễn Thị Liên Hương và cs (2010a) [10] đã gây nhiễm thử nghiệm
một số chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh cho ngan trên phôi trứng. Để kiểm tra
độc lực và đặc tính gây bệnh của 10 chủng vi khuẩn E. coli, tiêm liều 0,2ml
canh trùng pha loãng ở nồng độ 10-6 phôi (~400- 450 vi khuẩn/ phôi) vào
xoang niệu mô của các trứng thì thấy cả 10 chủng đều gây chết phôi ngan, vịt
trong vòng 1- 5 ngày sau khi tiêm và gây chết phôi gà từ 1- 10 ngày sau khi
tiêm. Các phôi chết được mổ khám đều có hiện tượng: bề mặt ngoài da xuất
huyết nặng, các cơ quan phủ tạng (tim, phổi, gan, dạ dày, ruột) cũng bị xuất
huyết thành từng đám.
Nguyễn Thị Liên Hương và cs (2010b) [11], khi ngan mắc bệnh trực
khuẩn coli thì thấy có biểu hiện: tiêu chảy phân xanh, nhày lẫn máu chiếm tỷ
lệ 65,62%; khó thở chiếm tỷ lệ 51,11%; bỏ ăn, ủ rũ chiếm tỷ lệ 47,66% và các


12
triệu chứng khác như thần kinh, viêm mắt chiếm tỷ lệ 8,44%. Khi mổ khám,
bệnh tích điển hình là viêm túi khí (52,67%), viêm ruột, mật sưng, gan sưng,
tích nước xoang bụng chiếm từ 40,41- 49,49%.
Tác giả Đỗ Ngọc Thuý và cs (2010) [32], bằng phản ứng PCR đã xác định

ruột của gà ở Bắc Algenria, Mellata et al (2001) [77] đã xác định được tỷ lệ
các chủng có khả năng kháng bổ thể trong huyết thanh là 46%, sản sinh
aerobactin là 12% và 38% các chủng có khả năng sản sinh ColV.
Còn theo nghiên cứu của McPeake et al (2005) [76] thì lại có tới
99,10% các chủng từ gia cầm bệnh và 82,20% từ gia cầm khoẻ có mang gen
CvaC mã hoá cho sự tổng hợp ColV.
1.3. Một số đặc tính của vi khuẩn E. coli nói chung và các chủng gây bệnh
ở gia cầm nói riêng
Trực khuẩn ruột già Escherichia coli có tên khoa học là Bacterium coli
commune hay Bacillus coli communis do Theodor Escherich phân lập được
lần đầu tiên vào năm 1885 từ phân trẻ em, năm 1986 gọi là Bacterium coli,
năm 1991 thống nhất toàn cầu gọi là Escherichia coli.
1.3.1. Đặc điểm hình thái và sức đề kháng của vi khuẩn
E. coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước 2-3 × 0,6µ. Trong
cơ thể có hình cầu, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Có khi trong
môi trường nuôi cấy thấy có những trực khuẩn dài 4- 8µ, những loại này
thường gặp trong canh khuẩn già. Phần lớn E. coli di động do có lông ở xung
quanh thân, nhưng một số không thấy di động. Vi khuẩn không sinh nha bào,
có thể có giáp mô. Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm
ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn.
Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy để nhuộm có thể thấy giáp mô,
còn khi soi tươi thì không nhìn thấy giáp mô. Nếu cố định bằng axit osmic
rồi quan sát dưới kính hiển vi điện tử thì thấy tế bào E. coli có nhân, đó là