1
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
---------

---------

NGUYỄN THỊ HẬU

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÔNG
LẠNH TINH DỊCH LỢN DẠNG CỌNG RẠ
PHỤC VỤ TẠO VÀ NHÂN GIỐNG LỢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

THÁI NGUYÊN - 2009


2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
---------

---------

NGUYỄN THỊ HẬU

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÔNG

cán bộ công nhân viên của Viện, đặc biệt các anh, các chị là cán bộ trong Bộ
môn Sinh lý sinh hóa và tập tính vật nuôi Viên chăn nuôi, Trung tâm thực
nghiệm và bảo tồn vật nuôi Viện chăn nuôi và Phòng thí nghiệm công nghệ tế
bào động vật Viện Chăn nuôi, những người luôn hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn
thành tốt đề tài này.
Xin bày tỏ lòng biết ơn tới người thân, bạn bè và đồng nghiệp luôn ở
bên tôi, luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện
tại trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên và thực tập tại Viện Chăn nuôi!
Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2009
Sinh viên

Nguyễn Thị Hậu


4

LI CAM OAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và cha từng
đợc ai công bố trong bất kì công trình nào khác.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn
đều đã đợc chỉ rõ nguồn gốc.

Tỏc gi

Nguyn Th Hu


5



: Độ dài đường thẳng

I ( Immotile)

: Tinh trùng không hoạt động

Motility

: Hoạt động của tinh trùng

NST

: Nhiễm sắc thể

L ( Local motility )

: Tinh trùng hoạt động tại chỗ

TTNT

: Thụ tinh nhân tạo

TTON

: Thụ tinh ống nghiệm

V

: Lượng tinh dịch trong một lần lấy tinh

giống lợn Duroc............................................................................................... 63
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến sức sống của tinh trùng……….65
Bảng 3.9. Sức sống tinh trùng sau ly tâm của các giống lợn .......................... 67
Bảng 3.10. Đặc điểm môi trường cân bằng (n= 60) ....................................... 68
Bảng 3.11. Chất lượng tinh dịch sau cân bằng của giống Landrace............... 69
Bảng 3.12. Chất lượng tinh dịch sau cân bằng của giống Yorkshire.............. 70
Bảng 3.13. Chất lượng tinh dịch sau cân bằng của giống Duroc.................... 70
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh đến sức sống của tinh trùng 71
(n= 70) ............................................................................................................. 71
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời gian giải đông đến sức sống tinh trùng ..... 73
(n=70) .............................................................................................................. 73
Bảng 3.16. Chất lượng tinh dịch đông lạnh sau giải đông của các giống lợn 75


7

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
Biểu đồ 3.1: Biểu đồ so sánh thể tích tinh dịch của các giống lợn ................ 53
Biểu đồ 3.2: Biểu đồ so sánh hoạt lực tinh trùng của các giống................... 54
Biểu đồ 3.3: Biểu đồ so sánh nồng độ C (tr/ml) của các giống ..................... 55
Biểu đồ 3.4: Biểu đồ so sánh VAC (tỷ) trong một lần lấy tinh ...................... 56
Biêủ đồ 3.5: Biêủ đồ so sánh Motility (%), A (Progressive.Motility %) tinh
trùng trong 2 môi trường ly tâm...................................................................... 61
Biêủ đồ 3.6: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng ở tinh nguyên và tinh
pha trong môi trường ly tâm (VCN). .............................................................. 64
Biêủ đồ 3.7: Biểu đồ so sánh hoạt lưc (A ) tinh trùng ở các chế độ ly tâm .... 66
Biêủ đồ 3.8: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng trước, và sau đông lạnh ở
thời gian đông lạnh 10 phút và 20 phút........................................................... 72
Biêủ đồ 3.5: Biểu đồ so sánh hoạt lưc (A) tinh trùng ở thời gian giải đông 30
giây và 45 giây ................................................................................................ 74

CHƯƠNG 2..................................................................................................... 45
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG ........................................................ 45
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................... 45
2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu........................................................................45
2.1.1. Tinh dịch lợn đực ..........................................................................................45
2.1.2. Hoá chất và các dụng cụ thí nghiệm. ..........................................................45
2.2. Yêu cầu..............................................................................................................45


9

2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................45
2.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...........................................................46
2.4.1. Nghiên cứu một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng của tinh dịch lợn trước
khi đông lạnh............................................................................................................47
2.4.3. Nghiên cứu sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh .............................................51
2.5. Phương pháp xử lý số liệu...............................................................................51
CHƯƠNG 3..................................................................................................... 52
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................................. 52
3.1. Kết quả nghiên cứu về một số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn trước khi
đông lạnh. .................................................................................................................52
3.2. Kết quả nghiên cứu về kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn..............................59
3.2.1.Kết quả nghiên cứu kỹ thuật ly tâm..............................................................59
3.2.2. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật cân bằng tinh dịch.......................................68
3.2.3. Kết quả nghiên cứu đông lạnh tinh dịch trong hơi nitơ.............................71
3.2.4. Kết quả nghiên cứu nhiệt độ và thời gian giải đông tinh dịch đông lạnh
...................................................................................................................................73
Như vậy kết quả sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái trong sản xuất
cần phải nghiên cứu sâu hơn nhằm nâng cao hiệu quả. Tuy nhiên với kết quả
bước đầu như trên cũng đã khẳng định được thành công của kỹ thuật đông

xuất, áp dụng rộng rãi trong sản xuất, tuy nhiên kỹ thuật đông lạnh tinh dịch
lợn mới bước đầu được nghiên cứu. Một số nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh
tinh dịch lợn theo công nghệ Nhật Bản và Mỹ đã được tiến hành, bước đầu có
kết quả nhưng chưa áp dụng trong sản xuất.
Để góp phần làm phong phú thêm các kỹ thuật và công nghệ mới trong
sinh sản và thụ tinh nhân tạo lợn, đồng thời áp dụng những kết quả nghiên
cứu vào sản xuất, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật
đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo và nhân giống lợn”.
Thuộc đề tài công nghệ sinh học cấp nhà nước:
“Nghiên cứu ứng dụng tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo
và nhân giống lợn”.


11

2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Xác định được kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ.
- Sử dụng tinh dịch đông lạnh dạng cọng rạ trong sản xuất và thụ tinh
trong ống nghiệm.
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Đề tài sẽ đề xuất được một kỹ thuật mới trong kỹ thuật thụ tinh nhân
tạo - công nghệ đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ.
- Phục vụ chương trình tạo và nhân giống lợn, làm cơ sở và góp phần
trong bảo tồn quỹ gen (bảo tồn tinh dịch những giống lợn quý hiếm).
- Bổ sung vào tài liệu và nghiên cứu khoa học.


12

13

1.2. Cơ sở của những nghiên cứu về tinh dịch và tinh trùng lợn
1.2.1. Sinh lý sinh dục gia súc đực
1.2.1.1. Sự thành thục tính dục
Sự thành thục về tính dục thường biểu hiện sớm hơn sự thành thục về thể
vóc. Lợn đực thành thục tính dục vào khoảng 8 tháng tuổi trở lên khi đó khối
lượng cơ thể đạt 90- 100kg (đối với lợn đực ngoại), từ 6 tháng tuổi trở lên và
khối lượng cơ thể đạt từ 70- 80kg (đối với lợn lai), từ 5 tháng tuổi trở lên và
khối lượng cơ thể đạt 45- 50kg (đối với lợn nội).
1.2.1.2. Cấu tạo bộ máy sinh dục lợn đực
Hệ sinh dục lợn đực gồm các bộ phận chủ yếu sau:
- Bao dịch hoàn: mỗi dịch hoàn được bao bọc bởi một bao sợi (màng
trắng), bên ngoài được phủ bằng một tinh mạc, bên trong được phủ bởi một
màng mạch máu.
- Dịch hoàn (testis) hay còn gọi tinh hoàn: vừa là tuyến nội tiết vừa là
tuyến ngoại tiết. Dịch hoàn sản sinh tinh trùng và tiết hormon sinh dục
testosteron có tác dụng phát triển đặc điểm giới tính.
Cấu tạo của dịch hoàn gồm:
+ Giáp mạc riêng (tunica vaginalis propria): cấu tạo bởi 1 lớp sợi bền, là
phần kéo dài của phúc mạc.
+ Màng trắng (tunica ablugine a): từ đây phát ra nhiều bức ngăn hình tia,
chia dịch hoàn thành nhiều múi. Mỗi múi đều chứa những ống sinh tinh uốn
khúc (tubuli abluginea) trong đó tinh trùng được hình thành. Tất cả các ống
sinh tinh đều hướng về vách giữa của dịch hoàn.
+ Mạng tinh (rate testis) và thể Haimo (Highmor): khi đi vào vách giữa
của dịch hoàn, những ống sinh tinh uốn khúc biến thành những ống sinh tinh
thẳng và đan chéo vào nhau tạo thành mạng tinh. Mạng tinh cùng với vách
giữa của dịch hoàn tạo thành thể Haimo.



Nếu có nhiều tinh trùng kỳ hình trong tinh dịch xuất ra, thể hiện chức
năng của dịch hoàn phụ kém.
Tinh trùng tại đuôi dịch hoàn phụ mới có khả năng gắn chặt vào vùng
trong suốt của tế bào trứng để thực hiện quá trình thụ tinh.
- Thừng dịch hoàn: thừng dịch hoàn gồm các động mạch và thần kinh đi
vào dịch hoàn, chúng cấu tạo bởi các mô liên kết, các hệ cơ vòng và cơ dọc
liên kết với nhau.
- Dương vật: dương vật nằm ở dưới vách bụng, được bắt đầu bằng một
trụ, hai đầu bám vào hai mẩu xương ngồi, hướng ra phía trước. Dương vật lợn
đực có một đoạn cong hình chữ S, nằm kín trong da, khi giao phối mới thò ra
ngoài. Đầu dương vật có hình xoắn như mũi khoan, cách đầu mút 0,5 - 0,7cm
có lỗ để phóng tinh ra ngoài. Khi giao phối hay lấy tinh, dương vật thò ra
ngoài 20 - 40 cm.
1.2.1.3. Các tuyến sinh dục phụ
- Tuyến tinh nang (Tiểu nang, vesicular semen gland): tuyến tinh nang
là một cái túi rỗng để chứa tinh trùng, gồm hai tuyến hình trứng, màu vàng
nhạt, nằm trong xoang chậu, trên bàng quang và ống dẫn tinh.
Tuyến tinh nang tiết ra một chất keo màu trắng hoặc vàng. Chất keo
này gặp dịch tiết của tuyến tiền liệt thì kết lại tạo thành một cái nút đóng cổ tử
cung sau giao phối, mục đích không cho tinh trùng chảy ngược ra ngoài. Chất
keo này còn có thành phần glucoza, axit béo tăng cường dinh dưỡng, hoạt lực
cho tinh trùng.
Tuyến này ở lợn có kích thước lớn nhưng kém đặc chắc. Ở lợn tuyến
tiểu nang dài tới 15 - 20 cm, nặng xấp xỉ 850 gam.


16

- Tuyến tiền liệt (Prostate gland): động vật nói chung và gia súc đực

này gồm tinh trùng và các chất phân tiết của các tuyến sinh dục như tiền liệt,
cowper, tinh nang.
- Giai đoạn thứ 3: là giai đoạn bài tiết chủ yếu của các tuyến sinh dục
phụ (150 - 200 ml). Số lượng tinh trùng ở giai đoạn này ít, giai đoạn này kéo
dài 4 - 5 phút.
Tinh dịch của lợn đực là một hỗn hợp bao gồm tinh trùng được sản sinh
ra từ dịch hoàn và các chất tiết của các tuyến sinh dục phụ như tuyến tinh
nang, tuyến cowper, tuyến tiền liệt và tuyến urethra của vùng bụng.
Trong tinh dịch, phần quan trọng nhất là tinh trùng, đây là yếu tố chính
làm cho lợn cái có thể thụ thai. Phần quan trọng thứ hai là tinh thanh, tinh
thanh là một hỗn hợp chất lỏng do các tuyến sinh dục phụ bài tiết ra. Ở các
loài gia súc khác nhau tuyến này phát triển không giống nhau. Ở lợn tuyến
tinh nang và tuyến cowper bài tiết nhiều, cho nên tinh dịch lợn thường nghèo
tinh trùng và fructose. Ở lợn tinh thanh gồm 56 - 70% do tuyến tinh nang tiết
ra, 15 - 18% do tuyến cowper tiết ra, 2 - 3% do dịch hoàn phụ tiết ra. Tinh
trùng trong tinh dịch chỉ chiếm 2 - 7%. Theo Ogiưn f.v (1977) và Levin K.L
(1980)( dẫn theo Nguyễn Tấn Anh (1984) [1].
Thành phần hoá học của tinh dịch lợn: tinh dịch lợn là một hỗn hợp các
chất lỏng phức tạp, cho nên một số chất chỉ được xác định ở mức định tính.
Các loài khác nhau thì thành phần hoá học của tinh dịch cũng khác nhau. Tác
dụng chủ yếu của tinh dịch là rửa đường niệu sinh dục, là môi trường để nuôi
sống tinh trùng ngoài cơ thể, kích thích tinh trùng hoạt động trong đường sinh
dục của con cái.


18

1.2.3. Một số đặc tính sinh lý của tinh trùng lợn
1.2.3.1. Sự hình thành và cấu tạo của tinh trùng lợn
Tinh trùng lợn chỉ chiếm 2 - 7% trong tổng số tinh dịch tiết ra. Tinh

+ Các ty thể chuyển tới vùng cổ thân, phần lớn các tế bào chất biến đi
chỉ còn lại một lớp mỏng bao quanh miền ty thể và đuôi.
+ Qúa trình biến thái xảy ra trên tế bào dinh dưỡng Sectoli trong lòng
ống sinh tinh, trong khoảng thời gian 14-15 ngày. Sau đó chúng trở thành tinh
trùng non và rơi vào ống sinh tinh, được đẩy về phía phụ dịch hoàn.


19
•

Giai đoạn phát dục: ở phụ dịch hoàn, tinh trùng non tiếp tục phát

dục và thành thục. Trong quá trình di chuyển từ đây đến cuối dịch hoàn phụ,
tinh trùng phải di chuyển với đoạn đường khá dài khoảng trên 100m nằm uốn
khúc quanh co. Trong quá trình này nhiều tinh trùng non bị phân hủy. Về hình
thái, tinh trùng có ba phần chính:
- Đầu tinh trùng là phần chứa các vật chất di truyền.
- Cổ thân.
- Đuôi tinh trùng là phần có liên quan đến chức năng vận động.
Đầu có hai phần cơ bản: nhân và acrosome Nhân chiếm 87% thể tích
của đầu và được nén chặt lại gần như tinh thể. Trong nhân có chứa Chromatin
đậm đặc cao độ gồm AND liên kết với một protein đặc biệt. Số lượng nhiễm
sắc thể trong nhân tinh trùng là đơn bội. Nhân của tinh trùng không có ARN.
Phần trước nhân được bao bọc bằng một acrosome, giống cái túi có hai
lớp màng và bọc sát vào nhân. Acrosome là một lyzosome đặc biệt.
Trong acrosome của tinh trùng có chứa enzym thuỷ phân
Hyaluronidaza có tác dụng phân giải axit Hyaluronic là chất keo gắn các tế
bào màng phóng xạ, làm cho chúng rời ra để lộ trứng ra ngoài cho tinh trùng
có thể dễ dàng tiếp cận với noãn hoàng trong quá trình thụ thai.
Cổ thân: là phần rất ngắn, hơi eo lại, cắm vào hốc ở đáy phía sau của

(chuyển động làn sóng). Đây là hiện tượng trượt theo vi ống.
- Theo I.I xôcôlôpskaya (1962) (dẫn theo Nguyễn Tấn Anh) [1] thì thân
tinh trùng lợn có 25% vật chất khô, 75% là nước. Trong vật chất khô: protein
82%, lipit 13%. Trong đuôi tinh trùng có: 76% protein, 23% lipit, 1% muối.
1.2.3.2. Hoạt động của tinh trùng
Khi còn trong dịch hoàn phụ, tinh trùng hoạt động rất yếu hoặc không
hoạt động. Khi được giải phóng ra ngoài, tinh trùng trở nên hoạt động mạnh
do tác động của dịch tiết do các tuyến sinh dục phụ tiết ra.


21

Trạng thái hoạt động của tinh trùng thể hiện chất lượng tinh dịch. Nếu
tinh trùng hoạt động càng mạnh thì chất lượng càng tốt. Tinh trùng có 3 hình
thức vận động cơ bản (Nguyễn Tấn Anh, 1985) [2]:
+ Vận động tiến thẳng: đây là những tinh trùng có khả năng thụ thai.
+ Vận động xoay tròn: những tinh trùng có dạng vận động này thường
là không có khả năng thụ thai.
+ Vận động tại chỗ: thường là những tinh trùng non hoặc bị dị tật,
những tinh trùng này không có khả năng thụ thai.
Với công nghệ kỹ thuật số (Phân tích theo phần mềm Sperm vision 3.0)
người ta có thể xác định được các dạng chuyển động, tốc độ chuyển động của
tinh trùng và xác định được khoảng cách tinh trùng chuyển động trong
khoảng thời gian nhất định đó là khoảng cách, vận tốc chuyển động theo
đường ziczăc, theo đường trung bình và theo đường thẳng.
+ DCL (Distance Curve Line): độ dài đường ziczăc (µm).
+ DAP (Distance Average Path): độ dài đường trung bình (µm).
+ DSL (Distance Straight Line): độ dài đường thẳng (µm).
Tương ứng với mỗi dạng chuyển động trên, người ta cũng đã xác định
được tốc độ chuyển động của tinh trùng ở 3 dạng đường đi là:

23

C6H12O6 + 6 O2 => 6CO2 + 6H2O + 679 Kcalo
Quá trình hô hấp xảy ra trong điều kiện có oxy và giải phóng nhiều
năng lượng hơn. Trong môi trường có oxy, quá trình hô hấp của tinh trùng
diễn ra mạnh mẽ hơn. Tuy nhiên lượng các chất dự trữ có trong tinh trùng
không nhiều vì vậy làm cho thời gian sống của tinh trùng ngắn. Do đó, muốn
kéo dài thời gian sống của tinh trùng ngoài cơ thể thì cần bảo quản tinh dịch
trong môi trường yếm khí.
Tinh dịch ở trâu, bò, dê rất đậm đặc, lượng oxy rất ít nên quá trình hô
hấp được thay bằng quá trình đường phân. Còn ở lợn, tinh dịch loãng, lượng
oxy đủ nên hô hấp là quá trình giải phóng năng lượng chủ yếu.
Khi hô hấp, không những chất đường được oxy hoá mà cả chất béo, các
axit amin cũng được oxy hoá. Quá trình hô hấp được tăng lên bởi nhiệt độ. Cứ
tăng lên 10oC thì quá trình hô hấp tăng lên 2 – 2,5 lần. Điều này có liên quan
đến việc bảo quản tinh dịch ở nhiệt độ phù hợp. Nếu nhiệt độ tăng quá cao, sự
hô hấp của tinh trùng tăng lên và làm chúng nhanh bị chết do đó không bảo
quản được lâu.
Trao đổi chất của tinh trùng luôn luôn biến động theo sự biến thiên của
môi trường ngoại cảnh, theo thời gian lượng Fructo giảm dần, axit lăctic tích
tụ lại rồi CO2 làm giảm pH. Từ đó tác động xấu đến quá trình trao đổi chất
của tinh trùng, làm tinh trùng già cỗi, sự tiêu thụ O2 chỉ đạt tối đa khi tinh
trùng còn tươi. Sự già cỗi của tinh trùng dần tạo lên nguy cơ về hình thái tinh
trùng, acrosome biến dạng và biến mất.
Tinh trùng có thể mất khả năng vận động và chết sau khi acrosome nổi lên
những mụn nước, làm vỡ màng sinh chất và chất liệu acrosome trào ra ngoài.


24



phần hóa sinh của tinh thanh rất ổn định cho mỗi lần xuất tinh và không phụ
thuộc vào tần số xuất tinh. Chất tiết của tiểu nang có chứa một vài nhân tố
không có lợi cho hoạt lực và sức sống của tinh trùng. Nhưng chất tiết của
tuyến tiền liệt lại kích thích sức hoạt động tinh trùng. Khi tiếp xúc với chất tiết
tuyến tiền liệt, tinh trùng được bảo vệ để tránh ảnh hưởng không có lợi của chất
tiết tuyến tiểu nang.
- Hoạt động tại chỗ: L (Local motility %) là tỷ lệ phần trăm số tinh
trùng có hoạt động vòng tròn, lắc lư tại chỗ.
1.2.4.3. Tinh trùng không hoạt động
I (Immotile %): là tỷ lệ phần trăm số tinh trùng không hoạt động (đã chết).
1.2.4.4. Nồng độ tinh trùng: C (triệu/ml)
Nồng độ tinh trùng là số tinh trùng có trong 1 ml tinh nguyên. Nồng độ
tinh trùng là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng tinh dịch, là cơ sở
để tính toán liều tinh sản xuất.
1.2.4.5. Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong tinh dịch: VAC ( tỷ/lần)
Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Tấn Anh (1984) [1] ở lợn Yorkshire có
chỉ số VAC là 45,1 ± 1,73 tỷ/lần, ở lợn Landrace có chỉ số VAC là 36,05 ±
1,24 tỷ/lần.
1.2.4.6. Độ pH của tinh dịch
pH được xác định bởi nồng độ ion H+ trong tinh dịch. pH của tinh dịch
liên quan đến khả năng sống và thụ tinh của tinh trùng. pH của tinh dịch toan
tính thì tinh trùng hoạt động yếu, thời gian sống kéo dài. Ngược lại, pH của
tinh dịch kiềm tính thì tinh trùng hoạt động mạnh, thời gian sống bị rút ngắn.
pH của tinh dịch giữa các loài gia súc khác nhau thì khác nhau. pH của
dịch tiết từ dịch hoàn phụ ở các loài gia súc luôn có tính chất toan tính, có tác