HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ THÙY LIÊN

THIẾT KẾ VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHỈ THỊ ADN
XÁC ĐỊNH CÁC GEN ỨNG VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU MẶN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA
VIỆT NAM ĐÃ GIẢI MÃ HỆ GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ THÙY LIÊN

THIẾT KẾ VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHỈ THỊ ADN
XÁC ĐỊNH CÁC GEN ỨNG VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN
TÍNH CHỊU MẶN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN
ĐỊA CỦA VIỆT NAM ĐÃ GIẢI MÃ HỆ GEN

Chuyên ngành

: Công nghệ sinh học

Mã số

: 60.42.02.01


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới TS. Khuất Hữu Trung, PGS. TS Nguyễn Thị Phương Thảo đã tận tình
hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ
môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt
Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức bộ môn Kỹ thuật di
truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Thùy Liên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp



viii

Thesis abstract

ix

Phần 1 Mở đầu

1

1.1

Tính cấp thiết của đề tài

1

1.2

Mục tiêu nghiên cứu

2

1.3

Yêu cầu của đề tài

2

1.4


4

2.2.2

Nghiên cứu di truyền phân tử về tính chống chịu mặn của cây lúa

5

2.3

Gen ứng viên

6

2.3.1

Các bước xác định gen ứng viên

6

2.3.2

Phương pháp tin sinh học xác định gen ứng viên chịu mặn

9

2.4

Chỉ thị adn trong xác định gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn


16

2.5.3

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế giới

17

2.5.4

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn tại Việt Nam

19

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

22

3.1

Địa điểm nghiên cứu

22


3.5

Phương pháp nghiên cứu

24

3.5.1

Phương pháp thiết kế chỉ thị ADN xác định các gen ứng viên dựa trên
trình tự genome

24

3.5.2

Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng

28

3.5.3

Phương pháp lai hữu tính – lai trở lại giữa các giống cho và nhận gen

28

3.5.4

Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

30

34

4.1.3

Kết quả phân tích thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA
Sequence) và thành phần amino acid của các gen ứng viên RSS1

38

4.1.4

Kết quả tầm soát và thiết kế mồi nhận dạng gen ứng viên RSS1 chịu mặn

42

4.2

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác đinh, chọn lọc cá thể và con lai mang
gen ứng viên chịu mặn

4.2.1

46

Kết quả xác định cá thể mang gen ứng viên chịu mặn trong tập đoàn 36
giống lúa bản địa

4.2.2

46

ADN

:

Axit Deoxyribonucleic

AFLP

:

Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các
đoạn được nhân bản chọn lọc

RAPD

:

Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN được
nhân bản ngẫu nhiên

RFLP

:

Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài
mảnh phân cắt giới hạn

STS

:

:

Complementary DNA – Thư viện ADN bổ trợ

cs

:

Cộng sự

ctv

:

Cộng tác viên

IRGSP

:

International Rice Genome Sequencing Project

dNTP

:

Deoxynucleotide triphosphate

MABC



:

Tris-Boric Acid-EDTA

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1

Danh sách 36 giống lúa bản địa đã giải mã

22

Bảng 3.2

Thành phần của một phản ứng PCR

31

Bảng 3.3

Các bước phản ứng PCR

31



38

Bảng 4.5

Thống kê tỉ lệ (%) amino acid của gen/gen ứng viên RSS1

40

Bảng 4.6

Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen ứng viên RSS1

Bảng 4.7

ở các giống lúa đã giải mã

43

Kết quả lai tạo con lai ở các thế hệ F1, BC1F1 và BC2F1

48

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC HÌNH


Kết quả điện di sản phẩm PCR 36 giống lúa bản địa với cặp mồi
RSS1del15

Hình 4.5

47

Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 với cặp mồi
49

SRWD5del200
Hình 4.6

Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC2F1 với cặp mồi
50

SRWD5del200
Hình 4.7

Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC1F1 với cặp mồi
RSS1del15

Hình 4.8

50

Kết quả điện di sản phẩm PCR các con lai BC2F1 với cặp mồi
RSS1del15

Hình 4.8


53

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Nhiễm mặn là một nhân tố phi sinh học làm giảm năng suất tại nhiều vùng trồng
lúa trên thế giới. Cải tiến tính chịu mặn của lúa tại các vùng nhiễm mặn là mục tiêu
quan trọng trong chương trình chọn tạo giống lúa. Dựa vào trình tự của 36 giống lúa bản
địa của Việt Nam đã được giải mã hệ gen đã xác định được 2 gen ứng viên liên quan
đến tính chịu mặn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã: SRWD5
(SRWD5 TOLERANCE) và RSS1(RICE SALT SENSITIVE 1). Dựa vào kết quả phân tích
thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence) và thành phần amino acid
của các gen ứng viên; kết quả tầm soát trình tự tương đồng của 36 giống lúa đã giải mã
và so sánh với locus gen có khả năng chịu mặn đã thiết kế được 2 chỉ thị ADN là
SRWD5del200 và RSS1del15 đặc trưng cho từng gen ứng viên chịu mặn. Thực hiện
phép lai trở lại (MABC) của 2 tổ hợp lai: Bắc thơm 7 x Coi ba đất và TSL1x OM6377
đã lai tạo được tổng số 16 hạt lai BC1F1 và 54 hạt lai BC2F1. Sử dụng 2 chỉ thị ADN đã
thiết kế để sàng lọc các cá thể từ thế hệ BC1F1 đến thế hệ BC2F1 xác định được 7 cá thể
BC1F1 và 27 cá thể BC2F1 mang gen ứng viên chịu mặn. Kết quả nghiên cứu là cơ sở
cho việc áp dụng các chỉ thị phân tử trong chương trình chọn tạo giống lúa chịu mặn.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii



không chỉ là nguồn lương thực tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất
khẩu quan trọng. Năng suất và sản lượng lúa luôn bị đe doạ bởi thiên tai, sâu
bệnh và các yếu tố môi trường. Trong đó, yếu tố đáng chú ý là hiện tượng đất
nhiễm mặn. Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam,
hàng năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm
thực của biển. Theo báo cáo mới nhất của Cục trồng trọt đến đầu tháng 3/2015,
tại Đồng bằng sông Cửu Long, xâm ngập mặn đã ảnh hưởng đến 620.000
ha/1.545.000 ha lúa đông xuân năm 2009 - 2010, chiếm 40% diện tích toàn vùng.
Hiện nước mặn đang xâm nhập sâu vào khu vực nội đồng ở các tỉnh ven biển
ĐBSCL, có nơi vào sâu đến 60km. Mức nhiễm mặn cao nhất tập trung ở các tỉnh
Kiên Giang, An Giang, Sóc Trăng bởi ảnh hưởng thủy triều từ biển Tây theo
kênh Long Xuyên - Rạch Giá và kênh Vĩnh Tế đổ vào vùng Thoại Sơn (tỉnh An
Giang) và khu vực Đông Hồ (tỉnh Kiên Giang) dù trước đó các cửa đập ngăn
mặn của vùng tứ giác Long Xuyên đã đóng lại. Diện tích có nguy cơ bị xâm ngập
mặn cao khoảng 100.000 ha/650.000 ha, chiếm 16% diện tích canh tác lúa của
các tỉnh trên. Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng
băng tan ở hai cực, nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven
biển. Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho
chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo, và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảm
bảo an ninh lương thực thế giới sẽ khó hoàn thành. Do đó, việc hạn chế mức độ
gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan
tâm nghiên cứu.
Để nhanh chóng tạo ra các giống lúa chịu mặn, hướng nghiên cứu ứng dụng
kỹ thuật chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa đang được sử dụng rộng rãi do
có thể rút ngắn thời gian chọn tạo, việc chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử hiệu quả hơn
và đáng tin cậy hơn chọn lọc kiểu hình (Liu et al., 2003; Pei et al., 2011; Miah et
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 1


giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã;
- Thiết kế được các chỉ thi ADN đặc trưng cho từng gen ứng viên chịu
mặn phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu mặn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


1.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Vì thời gian hạn chế nên đề tài chỉ tập trung các nội dung thiết kế chỉ thị
ADN nhận dạng gen ứng viên chịu mặn và ứng dụng trong lai tạo để chọn các cá
thể mang gen ứng viên chịu mặn đến thế hệ BC2F1. Đề tài được thực hiện tại Bộ
môn Kỹ thuật di truyền và khu ruộng thí nghiệm của Viện Di truyền Nông
nghiệp từ tháng 6/2014 đến tháng 11/2015.
1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
-

Kết quả đề tài sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu và vật liệu cho các nghiên cứu

khoa học về tính chịu mặn, đồng thời góp phần vào công tác nghiên cứu chọn tạo
giống lúa có khả năng chịu mặn phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng nhiễm
mặn ở Việt Nam.
- Những thành công bước đầu trong thiết kế các chỉ thị ADN xác định các
gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi
trong công tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ đối với khả năng chịu mặn mà
còn đối với nhiều khả năng kháng khác, đáp ứng nhu cầu lương thực con người.
- Những cá thể trong quần thể BC1F1, BC2F1 triển vọng được chọn lọc
trong đề tài này sẽ trồng thử nghiệm, đánh giá, chọn ra các dòng lúa mang gen
ứng viên chịu mặn để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.


glycophyte thực hiện hoạt động điều tiết áp suất thẩm thấu làm cản trở ảnh
hưởng gây hại của mặn. Hoạt động này sẽ giúp cây duy trì một lượng lớn K+
và hạn chế hấp thu Na+.
2.2 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VỀ GIỐNG LÚA CHỐNG CHỊU MẶN
2.2.1 Nghiên cứu di truyền số lượng về tính chống chịu mặn của cây lúa
Rất nhiều nghiên cứu cho rằng yếu tố di truyền tính chịu mặn biến động rất
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 4


khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa chịu mặn có hiệu
quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chịu mặn, từ đó loại bỏ ngay từ
những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn giống.
Nghiên cứu di truyền số lượng tính chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt
động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền
tính chịu mặn.
Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chịu mặn giai đoạn mạ của cây lúa
trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao (EC = 12
dS/m) trong môi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh, người ta thấy
rằng, tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, khối lượng
khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống chịu
và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do hoạt động của
một nhóm gen cộng tính. Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính
trạng này rất thấp.
Theo Mishra et al. (1990), trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính
trạng chiều cao cây, năng suất, trong điều kiện mặn được điều khiển bởi nhóm
gen cộng tính”.
Do ảnh hưởng rất lớn của môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là rất
thấp trong các tính trạng. Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ, Gregorio and

tính chịu mặn của cây lúa. Các dòng RI được thanh lọc mặn trong nhà lưới ở điều
kiện EC = 15 dS/m và điều kiện đồng ruộng. Phân tích RFLP với 5 enzyme phân
cắt hạn chế (DraI, EcoRV, HindIII, ScaI, XbaI) cho thấy trong 266 RFLP
marker, có 117 RFLP marker thể hiện đa hình (43,98%), phủ trên hệ gen cây lúa
với mật độ 15 cM/quãng. RG100 và RZ323 được ghi nhận cho đa hình rõ nhất.
Có 13 marker định vị gần RG100 và RZ323 trên nhiễm sắc thể số 3 cũng được sử
dụng để xem xét liên kết gen. Phân tích ANOVA một chiều chứng minh Nona
Broka mang allele kháng liên kết với RG100 và RZ323 tại các loci số lượng. Khi
phân tích ANOVA hai chiều, tác giả phát hiện thêm RZ323 (trên nhiễm sắc thể
số 3) và RG333 (trên nhiễm sắc thể số 8) liên kết với QTL chịu mặn. Các cá thể
tái tổ hợp mang allele từ Nona Broka ở locus RZ323 và từ IR29 ở locus RG333
có kiểu hình sống sót lâu hơn trong môi trường mặn so với những tổ hợp khác.
Bản đồ QTL (trên cơ sở AFLP và STS marker) cho thấy gen chủ lực
điều khiển tính trạng chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể số 1 (saltol). Bên
cạnh gen chủ lực, 3 QTL được ghi nhận có quan hệ với tính trạng hấp thu K
cao, 4 QTL có quan hệ với tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có quan hệ
với tính trạng tỷ số Na/K thấp. Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số
1, 3, 4, 10 và 12.
2.3 GEN ỨNG VIÊN
Gen ứng viên là các gen với các đa hình phân tử về mặt di truyền liên kết
với locus hoặc QTLs chính, hoặc là các gen với các đa hình phân tử về mặt
thống kê liên kết với các biến thể của tính trạng đang được nghiên cứu (Pflieger
et al., 2001).
2.3.1 Các bước xác định gen ứng viên
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


Gen ứng viên có thể được xác định bởi một số phương pháp, bao gồm kiến

của liên kết với các locus của tính trạng. Phương pháp này được ứng dụng rộng
rãi trong việc tách các dòng gen kháng bệnh ở thực vật. Phân tích bản đồ so sánh
cũng hỗ trợ việc chọn lựa các gen ứng viên vị trí. Bởi các loài có quan hệ họ
hàng thường bảo tồn các cấu trúc hệ gen. Việc bảo tồn các trình tự, thứ tự và
phân bố gen giữa các loài cũng hỗ trợ lựa chọn gen ứng viên vị trí giả định. Giải
trình tự hệ thống của các dòng cDNA cung cấp một số lượng expressed sequence
tags (ESTs) mà rất hiệu quả cho phân tích bản đồ so sánh. Bản đồ liên kết của
marker EST đã được xây dựng ở ngô và lúa.
2.3.1.2 Sàng lọc gen ứng viên
Một khi đã chọn một gen ứng viên, bước tiếp theo các nhà nghiên cứu phải
lựa chọn đa hình nào sẽ là hữu ích nhất để xác định vị trí của gen ứng viên trên
bản đồ di truyền liên kết giữa marker của gen ứng viên và locus đang được xác
định và để tính toán mối tương quan thống kê giữa đa hình của gen ứng viên và
biến thể kiểu hình trong một tập các cá thể không cùng phả hệ. Trong thực vật,
hai phương pháp đang được sử dụng là: vị trí bản đồ di truyền của các gen ứng
viên chức năng giả định và các locus mục tiêu liên quan trong tính trạng nghiên
cứu cần được so sánh.
2.3.1.3 Xác nhận gen ứng viên
Khi gen ứng viên và đa hình thích hợp được chọn, các nhà nghiên cứu
thường tiếp tục kiểm tra vai trò của gen này trong các mẫu bệnh và mẫu không
bệnh được chọn ngẫu nhiên. Việc chọn lọc thành các nhóm riêng biệt giúp cho
cách tiếp cận gen ứng viên có thể trả lời câu hỏi: Liệu có 1 alen của một gen ứng
viên biểu hiện thường xuyên hơn trong nhóm bệnh hay nhóm không bệnh?
Để xác nhận gen ứng viên, phân tích sinh lý bao gồm đo mức độ biểu hiện
của gen ứng viên ở mức độ mRNA (bằng RT-PCR số lượng hoặc northern
blotting) hoặc mức độ protein hoặc bằng xác định hoạt động enzyme của gen ứng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 8


Phương pháp này tạo ra khả năng kết hợp các dạng kiểu hình với các dạng chức
năng thông qua các dạng hóa học. Phương pháp G2D gần đây đã được mở rộng
với dữ liệu gắn trình tự được biểu hiện (expressed sequence tag - EST). Hệ thống
mới này làm cho đầu vào kiểu hình cũng đã được cải thiện, nghĩa là làm giảm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 9


những kiến thức lâm sàng có trước cần thiết để được nhập vào. Phiên bản mới
của G2D thực hiện tốt hơn, chủ yếu là vì nhiều cơ sở dữ liệu hơn được sử dụng
với bộ dữ liệu lớn hơn.
2.3.2.1 Phân tích microarray
Gần đây, phân tích microarray về phản ứng với stress mặn của nhiều loài
cây trồng đã được thực hiện, đánh giá trên nuôi cấy tế bào, cả cây hoặc từng cơ
quan riêng biệt. Một số nền tảng dựa trên microarray là có sẵn cho nghiên cứu
phiên mã ARN vô sinh căng thẳng liên quan đến stress phi sinh học của cây
trồng. Kim et al. (2013) đã kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ muối cao trên phản
ứng biểu hiện gen ở để hiểu rõ hơn các quy định di truyền của sự tăng trưởng và
sự trao đổi chất trong môi trường độ mặn cao. Thí nghiệm sử dụng các giống lúa
đột biến chịu mặn cao Salt10 và Salt23 và giống gốc không có khả năng chịu
mặn Dongjin. Sự biểu hiện gen được đánh giá bằng RNA, tách chiết từ mẫu lá ở
các giai đoạn xử lý muối khác nhau. Kết quả, quan sát được 8.275 gen ứng viên
liên quan đến chịu mặn. Trong đó, quan sát được 342 ortholog gen và 74
pathway gen gắn với sinh tổng hợp phản ứng với muối. Cuối cùng, xác định
được 6 gen biểu hiện một cách khác biệt giữa các giống chịu mặn tốt và chịu mặn
kém bằng cách so sánh gen pathway và gen ortholog. Trong số 6 gen, 3 gen là
up-regulated và 3 gen là down-regulated
Juexin Wang et al. (2011) đề xuất một quy trình hoàn chỉnh để lựa chọn và
cung cấp một nhóm gen đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát mặn từ phân tích

stress do mặn trong quần thể lai có 1782 transcript dẫn suất từ rễ của cây bị xử lý
mặn (NaCl ở nồng độ 150mM). Kết quả này cho thấy một tiến trình điều tiết gen
chức năng với nhiều mức đồ khác nhau của transcript. Trong giai đoạn đầu tiên,
đáp ứng của IR29 chậm hơn so với pokkali. Sau 3-6 giờ xử lý mặn, mức độ
phong phú của transcript thay đổi nhanh trong Pokkali, còn IR29 có sự suy giảm
trong vòng 3 giờ đầu gây nên cái chết của giống này ngay sau đó.
2.3.2.2 Phân tích cDNA
cDNA được nghiên cứu để xác định các gen mà các gen này biểu hiện một
cách khác biệt trong phản ứng với stress mặn. Nghiên cứu của Zahra et al. (2013)
đã xây dựng hai thư viện cDNA từ mRNA của mẫu chồi trong điều kiện mặn ở
giai đoạn I (24h) và II (10 ngày) đối với giống lúa At354 (một giống đã cải tiến
tính chịu mặn, nhưng chưa xác định gen). Tổng số 3192 và 960 dòng cDNA
được sàng lọc từ giai đoạn I và II tương ứng. Sau đó, các dòng cDNA được lai
khác biệt với mẫu dò được chuẩn bị từ mẫu chồi của At354 trong điều kiện ức
chế mặn và đối chứng (không bị ức chế mặn). Các dòng cDNA được xác định là
biểu hiện một cách khác biệt được tái khẳng định bằng RNA dot blot method.
RT-PCR (relative reverse transcription polymerase chain reaction) được thực
hiện để so sánh mức độ biểu hiện của các gen được xác định. Giải trình tự và tìm
kiếm tương đồng liên tiếp đã xác định 14 gen up-regulated và 17 gen downregulated trong giai đoạn I. Tương tự, 11 gen up-regulated và 2 gen downregulated được xác định trong giai đoạn II. Những gen này có thể cho phép khám
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


phá con đường mới cho việc thao tác chịu mặn ở lúa.
Nghiên cứu xác định số lượng các biểu hiện của gen SalT –gen được cho
rằng có khả năng chịu mặn, mô tả các vùng promoter của gen này và xác định
được các yếu tố cis- có thể sẽ tham gia vào việc biểu hiện gen có khả năng chịu
mặn. Kết quả đã tìm được promoter Os01g0348900-SalT không duy trì mối quan
hệ trực tiếp với khả năng chịu mặn nhưng với cơ chế cho phép thích nghi với

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


ADN (chỉ thị RFLP, RADP, SSR…).
2.4.2 Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử
Mồi là một chuỗi oligonucleotide sợi đơn ngắn (kích thước thường từ 18 –
24 nucleotide). Có hai loại mồi được sử dụng cho chẩn đoán bệnh cây:
- Mồi chung (universal/degenerate primers): được thiết kế trên các vùng
bảo thủ cao, có khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau (thường các đối
tượng của một chi, một họ).
- Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân
biệt được loài, thậm chí dưới loài như chủng/nòi/type sinh học…
Có được các mồi tốt là bước quan trọng nhất trong chẩn đoán bệnh cây. Có
2 cách để có thể nhận được các mồi tốt.
- Tham khảo và lựa chọn từ các nghiên cứu đã được công bố.
- Tự thiết kế mồi.
Để tự thiết kế mồi dựa trên các chuỗi gen sẵn có trên Genbank, người ta cần
sử dụng một phần mềm có khả năng căn trình tự đa chuỗi (multiple sequence
alignment), chẳng hạn ClustalX, Bioedit, MEGA 6. Ngay sau khi các chuỗi ADN
đã được căn trình tự, chúng ta có thể thiết kế các mồi chung hay mồi đặc hiệu tùy
theo yêu cầu.
Các chú ý khi thiết kế mồi
- Độ dài mồi: Nên nằm trong khoảng 18-22 nucleotide. Độ dài này đủ dài
để đảm bảo tính đặc hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn.
- Nhiệt độ tách chuỗi (Tm = Melting Temperature): Tm là nhiệt độ mà tại
đó 1/2 số sợi ADN kép tách thành sợi đơn. Tm của mồi nên nằm trong khoảng
52-580C.
- Nhiệt độ gắn mồi (Ta = annealing temperature): Ta được tính dựa trên Tm. Ta

vì có giá trị ∆G cao dễ dẫn tới bắt cặp không đặc hiệu vào khuôn. Trái lại nếu
đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A sẽ khó bắt cặp.
Vùng thiết kế mồi của khuôn
Vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa quá nhiều cấu trúc thứ cấp.
Nếu các cấu trúc thứ cấp này ổn định ở nhiệt độ gắn mồi thì mồi sẽ không thể bắt
cặp được.
2.5 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA
CHỊU MẶN
Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết
với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương
tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Ở đây, thay vì phải đánh giá
kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong
muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14