TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ NGÀNH: 52620301

TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT RỄ CỎ
XƯỚC (Achyranthes aspera L.)
VÀ LÁ SẦU ĐÂU (Azadirachta indica A.)
LÊN VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri và Aeromonas
hydrophilla
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Hoàng Dung
MSSV: 1153040014

Cần Thơ, 2015

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐÔ
KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
MÃ NGÀNH: 52620301

TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHIẾT RỄ CỎ XƯỚC
(Achyranthes aspera L.) VÀ LÁ SẦU ĐÂU
(Azadirachta indica A.) LÊN VI KHUẨN Edwardsiella

Cán bộ hướng dẫn 1

Sinh viên thực hiện

(chữ ký)

(chữ ký)

PGS.Ts. Nguyễn Văn Bá

Nguyễn Thị Hoàng Dung

Cán bộ hướng dẫn 2
(chữ ký)

iii


Ths. Trần Ngọc Huyền

iv


LỜI CẢM TẠ
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Cô Trần Ngọc Huyền và Thầy Nguyễn Văn Bá
đã chỉ bảo và hướng dẫn tận tình cho em những kiến thức cũng như các kỹ năng
trong thời gian thực hiện đề tài.
Em xin cảm ơn tất cả quý Thầy Cô Khoa Sinh học ứng dụng – Trường Đại học Tây
Đô đã tận tình dạy bảo, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt
thời gian học và tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này, những

vi


MỤC LỤC
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................ ix
DANH SÁCH BẢNG .............................................................................................x
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................1
1.1 Giới thiệu .......................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................................1
1.3 Nội dung nghiên cứu ......................................................................................2
CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................3
2.1 Cây cỏ Xước (Achyranthes aspera L.) ............................................................3
2.2 Cây Sầu đâu (Azadirachta indica A.) ..............................................................4
2.3 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri .................................................6
2.3.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ........................................................................6
2.3.2 Điều kiện sống và gây bệnh ......................................................................7
2.3.3 Dấu hiệu bệnh lý ......................................................................................7
2.3.4 Sự phân bố, khả năng gây bệnh và sự lan truyền bệnh Edwardsiella
ictaluri trên cá. ..........................................................................................7
2.4 Tổng quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila ...............................................8
2.4.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ........................................................................8
2.4.2 Điều kiện sống và gây bệnh ......................................................................8
2.4.3 Dấu hiệu bệnh lý ......................................................................................9
2.4.4 Sự phân bố, khả năng gây bệnh và sự lan truyền bệnh Aeromonas
hydrophila ................................................................................................9
2.4.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các loại thảo dược trong phòng trị bệnh
trên động vật thủy sản ...............................................................................9
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 12
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .......................................................... 12
3.1.1 Thời gian ................................................................................................ 12


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Hình thái bên ngoài của rễ cỏ Xước………...………….………………….2
Hình 2.2 Hình thái bên ngoài của lá Sầu đâu………..………….…………………...3
Hình 2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri………………….…………………...……5
Hình 2.4 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila có một tiêm mao….…………………....7
Hình 4.1 Vòng kháng khuẩn của dịch chiết rễ cỏ Xước đối với vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri……………………………………………………………….15
Hình 4.2 Vòng kháng khuẩn của dịch chiết cỏ Xước đối với vi khuẩn Aeromonas
hydrophila………………………………………………………………………….17
Hình 4.3 Vòng kháng khuẩn của dịch chiết lá Sầu đâu đối với vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri…………………………………….…………………………18
Hình 4.4 Vòng kháng khuẩn của dịch chiết lá Sầu đâu đối với vi khuẩn Aeromonas
hydrophila………………………………………………………………………....20

ix


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Thử nghiệm khả năng kháng Edwardsiella ictaluri của cỏ Xước với nước
cất và cồn 70%………………………………………………………..……………13
Bảng 3.2 Thử nghiệm khả năng kháng Aeromonas hydrophila của rễ cỏ Xước với
nước cất và cồn 70%…………………………………………………………….....14
Bảng 3.3 Thử nghiệm khả năng kháng Edwardsiella ictaluri của lá Sầu đâu với
nước cất và cồn 70%…………………………………………………………..…...14
Bảng 3.4 Thử nghiệm khả năng kháng Aeromonas hydrophila lá Sầu đâu với nước
cất và cồn 70%……………………………………………………………………..15
Bảng 4.1 Khả năng kháng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri của cỏ Xước với nước cất
ngâm, nước cất đun, cồn 70% ngâm, cồn 70% đun…………...…………………...15
Bảng 4.2 Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila của cỏ Xước với nước

thảo dược đã thực sự có những lợi ích thiết thực ví như chi phí thấp, dễ sử dụng,
không gây hại đến môi trường nuôi cũng như môi trường xung quanh, tạo ra sản
phẩm đạt tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm, người nông dân có thể tìm kiếm
ngoài tự nhiên hoặc có thể tự trồng được. Chính vì vậy hiện đã có rất nhiều nước
trên thế giới quan tâm nghiên cứu ứng dụng thảo dược vào trong lĩnh vực nuôi trồng
thuỷ sản.
Từ đó, đề tài “Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết rễ cỏ Xước (Achyranthes
aspera L.) và lá Sầu đâu (Azadirachta indica A.) lên vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri và Aeromonas hydrophila” được thưc hiện.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Nhằm đánh giá khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết rễ cỏ Xước và lá Sầu đâu
lên 2 loại vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila.

1


1.3 Nội dung nghiên cứu
Tách chiết dịch chiết rễ cỏ Xước và lá Sầu đâu với dung môi với tỷ lệ khác nhau và
theo 2 phương pháp ngâm hoặc đun.
Kiểm tra tính kháng của 2 loại thảo dược rễ cỏ Xước và lá Sầu đâu bằng phương
pháp đục lỗ thạch với vi khuẩn chỉ thị là Edwardsiella ictaluri và Aeromonas
hydrophila.

2


CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Cây cỏ Xước
Đặc điểm phân loại

nghiên cứu bào chế sử dụng cỏ Xước để phòng và trị bệnh cho gia súc (heo)
(theo Phạm Quang Trung, 2008).
2.2 Cây Sầu đâu
Đặc điểm phân loại
Theo Hutchinson J, 1975. Cây Sầu đâu được phân loại theo khóa sau:
Bộ: Rutales (bộ cam)
Họ: Meliaceae (họ xoan)
Chi: Melieae
Loài: Azadirachta indica A.

Hình 2.2 Hình thái bên ngoài của cây Sầu đâu
(Nguồn: tự chụp)

Tên gọi khác: Sầu đâu, Xoan Ấn Độ, Xoan ăn gỏi.
Sầu đâu là loại cây thường xuân, tán lá rộng, chiều cao trung bình từ 13 đến 20m,
cây trưởng thành có thể cao 30m, chu vi 2,5m. Nhánh cây trải rộng có thể vươn dài
đến 10m. Vào những mùa khô hạn, lá cây vẫn xanh tươi ngoại trừ bị rụng vào mùa
thu. Đặc điểm của lá: lá có dạng xẻ, lá kép lông chim lẻ, dài 20 – 38 cm, mọc nhiều
phía đầu nhánh, so le, dạng mác, xẻ răng cưa sâu và sắc cạnh, nhẵn cả trên hai bề
mặt, cân đối hai bên, nhọn, cuống rất ngắn. Lá thường xanh tốt quanh năm, không
có thời kỳ rụng lá. Kiểu phát hoa: hoa mọc ở nách lá, thường mọc thành cụm, hoa
4


có 5 cánh, cuống hoa ngắn, có màu trắng và mùi dễ chịu. Hoa lưỡng tính, có dạng
mác nhỏ, lá bắc rụng sớm. Đài hoa có phủ lớp lông mịn bên ngoài, có 5 thùy ở phần
nửa thấp, các thùy xếp lớp dạng trứng hoặc tròn, có lông mịn nhỏ. Hoa có 5 cánh
tràng, mọc xếp lớp, có dạng trứng ngược hoặc dạng thuôn, có lớp lông mịn phủ bên
ngoài. Ở nước ta, cây thường ra hoa từ tháng 3 đến tháng 5.
Vỏ cây: cây có vỏ dày trung bình, có các mấu nhỏ phân tán giữa các rãnh dọc và


5


ta đã chứng minh là Sầu đâu có khả năng ức chế hơn 400 loài dịch hại, bao gồm:
côn trùng, nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng.
Trong đó, azadirachtin, nimbin, salannin, nimbidin là những hoạt chất sinh học có
tác dụng phòng trị côn trùng, được chiết chủ yếu từ hạt của Sầu đâu (Dennis, 1992;
Gupta và Sharma, 1998)
Ở Ấn Độ các thầy thuốc dùng lá Sầu đâu để chữa các bệnh ngoài da, ngứa và sốt,
đặc biệt là sốt rét. Lá cũng dùng để sắc uống hay thoa ngoài da cho tất cả các dạng
nhiễm nấm hay nhiễm trùng khác. Một bác sĩ dùng dịch chiết đậm đặc lá Sầu đâu để
trị chứng ngứa nghiêm trọng, và các bệnh đường ruột liên hệ đến nấm Candida và
những bệnh nấm khác. Ngoài ra, ở Việt Nam Sầu đâu được sử dụng để điều trị một
số bệnh như bệnh vảy nến, chàm, trị mụn... Trong nuôi trồng thủy sản ở một số trại
sản xuất giống, người ta đã sử dụng chiết xuất của cây Sầu đâu để xử lý nước, hoặc
trộn vào thức ăn để ngăn ngừa bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra.
2.3 Tổng quan về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Giống: Edwardsiella
Loài: Edwardsiella ictaluri

Hình 2.3 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri nhuộm Gram
(Nguồn: tự chụp)

2.3.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Vi khuẩn Edwardstella ictaluri là loài vi khuẩn Gram âm, hình que mảnh, kích
thước 1 x 2 – 3µm, không sinh bào tử, là vi khuẩn yếm khí tùy tiện. Di động yếu
hoặc không di động. Catalase dương tính, oxidase âm tính và lên men glucose,

Mỹ (Ictalurus puntatus) bởi Hawke, 1979.
Năm 1985, Boonyaratpalin cũng đã phát hiện E. ictaluri gây bệnh trên cá trê trắng
(Clarias batrachus) và trong môi trường nước ở Thái Lan (Trích dẫn bởi Từ Thanh
Dung, 2004) Ngoài ra, mầm bệnh này cũng được công bố ở hầu hết Bắc Mỹ và các
tiểu bang khác như Indiana, Idaho, California, Arizona và New Mexico (Inglis et al,
1994)
Ở Việt Nam, bệnh trắng gan hay còn gọi là bệnh mủ gan được ghi nhận lần đầu tiên
xuất hiện trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 với tên gọi BNP (Bacillary
Necrosis of Pangasius) và trở nên trầm trọng vào năm 1999 (Ferguson et al, 2001).
Theo Brown và Cratzek (1980), mật độ ương nuôi cao sẽ làm tăng khả năng tiếp
xúc giữa ký chủ và mầm bệnh. Do đó, tình hình dịch bệnh ngày càng tăng với nhiều
dạng bệnh khác nhau và nguyên nhân gây bệnh ngày càng phức tạp hơn. Theo Từ
7


Thanh Dung (2004) khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10 – 90% tùy thuộc
vào cách quản lý và cỡ cá nuôi. Đồng thời trên gan, thận và tỳ tạng xuất hiện nhiều
đốm trắng đường kính 1-3 mm, bên trong chứa dịch màu trắng đục nên người dân
thường gọi là bệnh mủ gan, không có những biểu hiện bất thường bên ngoài.
2.4 Tổng quan về vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Bộ: Aeromonadales
Họ: Aeromonadaceae
Giống: Aeromonas
Loài: Aeromonas hydrophila

Hình 2.4 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila nhuộm Gram
(Nguồn: tự chụp)

2.4.1 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Aeromonas hydrophila là một loài vi khuẩn Gram âm dị dưỡng, hình que chủ yếu

nguyên nhân gây sự hư thối trên thực phẩm tươi sống bao gồm cả cá và hải sản. Vi
khuẩn A. hydrophila hiện diện trong môi trường nước chảy nhiều hơn trong môi
trường nước.
Bệnh cá là một trong những nhân tố gây rủi ro trong ngành nuôi trồng thủy sản quy
mô công nghiệp với sự thất thoát hàng tỷ đô la (Boulanger et al., 1977). Sự lây
nhiễm A. hydrophila là hậu quả của việc nuôi cá nước ngọt trên những khu vực có
khí hậu ấm áp (Torres et al., 1990) đặc biệt là ở Trung Quốc và Ấn Độ
(Karunasagar et al., 1989). Đây cũng là tác nhân gây bệnh quan trọng cho những
người tiêu thụ các sản phẩm cá và giáp xác bị nhiễm A. hydrophila (Vivekanandhan
et al., 2005).
2.4.5 Tình hình nghiên cứu và sử dụng các loại thảo dược trong phòng trị bệnh
trên động vật thủy sản
Những hợp chất hóa học, dược học luôn tồn tại những hạn chế hay nói cách khác
chúng có thể gây nên tác dụng phụ đối với sức khỏe người nuôi cũng như người tiêu
dùng các sản phẩm thủy sản. Vì thế, xu hướng tìm về những “sản phẩm sạch”,
những sản phẩm an toàn có nguồn gốc từ thảo dược đang được sử dụng rộng rãi đặc
biệt tại các quốc gia có nền công nghệ kỹ thuật phát triển. Theo định nghĩa của cơ
quan Y Tế Thế Giới, một sản phẩm được coi là thảo dược khi “thành phần chủ yếu
gồm một bộ phận của thảo dược nằm trên không hay dưới đất, trong hình dạng
nguyên thủy hay được chế biến”. (Nguyễn Ngọc Phước và ctv, 2007; Phạm Thiệp,
Vũ Ngọc Thuý, 2001; Bùi Quang Tề và ctv, 2006.)
Hiện nay việc chữa bệnh cho tôm, cá bằng thảo dược đang trở thành xu hướng của
giới nuôi trồng thuỷ sản, khắc phục tình trạng lệ thuộc vào dùng hóa chất, kháng
9


sinh phòng trị bệnh cho cá nuôi, tiến tới phát triển nuôi theo hướng tạo sản phẩm
bảo đảm an toàn thực phẩm, tiết kiệm kinh tế, dễ thực hiện, bảo vệ môi trường đồng
thời nâng cao sản lượng xuất khẩu theo đúng tiêu chuẩn.
2.4.5.1 Tình hình nghiên cứu thảo dược trong phòng trị bệnh ở động vật thủy

Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch triết lá
trầu và cũng đạt được những kết quả nhất định.Tuy nhiên đó mới chỉ là những
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.
10


2.4.5.2 Tình hình nghiên cứu thảo dược trong phòng trị bệnh ở động vật thủy
sản tại Việt Nam
Năm 1995, Hà Ký cùng cộng sự đã nghiên cứu một số loài thảo dược dùng để
phòng trị bệnh trên cá trắm ở Miền Bắc. Bước đầu chọn được 9 loài cây thuốc: rau
nghể (Polygonum hydropiper), rau sam (Portulaca cleracea), cây cỏ sữa lá to
(Euphorbia hirta), cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendu
lacae), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi
(Heliotropium indicum) và cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) có thể sử
dụng trong phòng trị bệnh đốm đỏ ở cá trắm cỏ (Hà Ký và ctv., 1995).
Năm 2000, Nguyễn Ngọc Hạnh cùng cộng sự tiến hành nghiên cứu thử nghiệm
thành công các hợp chất chiết xuất từ thảo dược, như Hepato, Alixin với tác
dụng hỗ trợ tiêu hoá tốt, giúp tôm khoẻ mạnh, sinh trưởng bình thường, chống
nhiễm bệnh đặc biệt các bệnh về gan. Ngoài ra, Hepato có thể sử dụng phòng
bệnh cho cá (Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám, 1999).
Năm 2002, Phan Xuân Thanh và cộng tác viên đã xác định được chất: 2 - hydroxy6-pentandecatrienilbenzoat có nguồn gốc từ thảo dược, có tác dụng phòng trừ các
bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra. Nhằm mục đích sử dụng các hoạt chất sinh học
thay thế các kháng sinh, hoá chất độc trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản (Phan
Xuân Thanh và ctv., 2002).
Năm 2007, chế phẩm sinh học bokashi được chiết xuất từ lá trầu của Nguyễn Ngọc
Phước được xem như một trong những hướng nghiên cứu đột phá trong phòng và trị
bệnh cho thủy sản, dùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn gây ra trên động vật thủy
sản mà không sử dụng kháng sinh và thân thiện với môi trường.
Về vấn đề chế tạo những sản phẩm thuốc nam ở dạng sản phẩm công nghiệp đã
được các nhà nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản cũng đã có sự quan tâm bước đầu.

trùng, cồn 70%, nước muối sinh lý 0,9%. (Phụ lục A)
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp tiến hành thí nghiệm
* Phương pháp ly trích dược thảo:
Dùng rễ cỏ Xước và lá Sầu đâu rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng,
cho vào máy xay nhuyễn, sau đó tiến hành làm theo 2 phương pháp như sau:
 Phương pháp ngâm: cho thảo dược vào nước cất và cồn 70% ngâm trong 3
giờ ở nhiệt độ phòng.
 Phương pháp đun: cho thảo dược vào nước cất và cồn 70% đun ở nhiệt độ
980C trong thời gian 3 giờ.
12


Tỷ lệ giữa mỗi loại thảo dược và dung môi lần lượt là 1:1, 1:2, 1:3. Sau đó lọc qua
giấy lọc được dung dịch chiết. Đun dịch chiết ở 700C để cồn bốc hơi khi ngửi thấy
hết mùi cồn thì bổ sung nước cất cho cân bằng thể tích, bảo quản ở nhiệt độ 4 - 60C.
*Phương pháp lập đĩa thảo dược
Sau khi thu được các dung dịch từ các phương pháp ly trích trên, tiến hành xác định
hiệu quả kháng khuẩn trên vi khuẩn theo phương pháp đục lỗ thạch (Sarkar &
Banerjee, 1996). Các thao tác được thực hiện trong điều kiện vô trùng:
Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila sau khi được tách ròng và
định danh, tiến hành đổ 20ml dung dịch môi trường trên mỗi đĩa, khi môi trường đã
khô, tiếp tục lấy 50µl dung dịch ở ống nghiệm chứa vi khuẩn có mật độ 106 cfu/ml
cho vào đĩa và dàn đều trên mặt thạch bằng que trải vi khuẩn, để khô tự nhiên. Mỗi
đĩa thạch đục 4 lỗ trên mặt thạch với đường kính 6 mm/lỗ. Nhỏ vào mỗi lỗ 100µl
dịch chiết dược liệu rồi giữ ở nhiệt độ 30 – 320 C trong tủ ấm.
*Xác định và chọn lọc tính kháng khuẩn của vi khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn phân lập được tính bằng đường
kính vòng kháng khuẩn quanh khuẩn lạc hay quanh miệng giếng trên đĩa
(Schillinger và Luke, 1989). So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng và chọn


1:1

100

3

106

1:2

100

3

106

1:3

100

3

106

Đối chứng

100

3


1:3

100

3

106

Đối chứng

100

3

106

3.4.2 Thí nghiệm với lá Sầu đâu.
Bảng 3.3: Thử nghiệm khả năng kháng Edwardsiella ictaluri của dịch chiết
lá Sầu đâu với nước cất và cồn 70%
Nghiệm thức

Thể tích dịch chiết
(µl)

Số lần lặp lại

Mật độ vi khuẩn
(cfu/ml)


106

14


Bảng 3.4: Thử nghiệm khả năng kháng Aeromonas hydrophila của dịch chiết
lá Sầu đâu với nước cất và cồn 70%
Nghiệm thức

Thể tích dịch chiết
(µl)

Số lần lặp lại

Mật độ vi khuẩn
(cfu/ml)

1:1

100

3

106

1:2

100

3