BƯỚC ÐẦU NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN Helicobacter pylori -CỦA CHITOSAN
NguyỄn HỮu ÐỨc* HỒ thỊ Tú Anh**
ÐẶT VẤN ÐỀ
Năm 1983, Marshall và Warren phát hiện một loại vi khuẩn hiện diện ở niêm mạc
dạ dày
(1)
trước đặt tên là Campylobacter pylori sau đặt tên là Helicobacter pylori.
Người ta đã xác lập mối liên hệ giữa vi khuẩn này với bệnh viêm loét dạ dày-tá
tràng, và đặt vấn đề tiệt trừ H. pylori như liệu pháp quan trọng trong điều trị viêm
loét. Ðã có một số phác đồ điều trị kết hợp thuốc chống tiết acid hoặc thuốc bảo
vệ tế bào với các kháng sinh như: amoxycillin, tetracyclin, metronidazol,
clarithromycin.
(2,3)
Tuy số lượng thuốc dùng trong điều trị viêm loét dạ dày-tá tràng có khá nhiều, đa
dạng và có nhiều tiến bộ trong điều trị nhưng việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới,
đặc biệt từ các hợp chất thiên nhiên nhằm khắc phục các tác dụng phụ do thuốc
là hóa chất tổng hợp vẫn được đặt ra.
-Chitosan, hợp chất được điều chế từ nguồn thiên nhiên là vỏ tôm cua, đã được
nghiên cứu sử dụng trong lĩnh vực y dược. Chitosan đã được ghi nhận có tính
bảo vệ niêm mạc.
(4)
Ðặc biệt, ở nước ta chitosan đã được nghiên cứu về tác
dụng kháng khuẩn.
(5)
Trong công trình nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu điều
chế chitosan theo phương pháp thủy nhiệt có sửa đổi và thử tác dụng ức chế
pepsin (in vitro), tác dụng bảo vệ tế bào (in vivo) của sản phẩm điều chế. Kết
quả cho thấy, cùng sử dụng lượng giống nhau (100mg), chitosan có tác dụng ức
chế pepsin tốt hơn sucralfate, trên mô hình ethanol chitosan dùng liều 500mg/kg
có tác dụng chống loét tương đương với sucralfate dùng liều 60mg/kg.
(6)

(7)
Columbia agar,
7% máu cừu, 4% huyết thanh bào thai bê, amphotericin B (20 µg/ml), acid
nalidixic (10 µg/ml) , vancomycin (3µg/ml). Các hộp thạch được đem ủ ở nhiệt
độ 37
o
C trong điều kiện vi hiếu khí được tạo bởi bao tạo khí Campy-Pak. Ðọc kết
quả sau 5-7 ngày, khuẩn lạc là những khúm nhỏ, đường kính 1-2 mm, màu xám
trong suốt. Thử các phản ứng để định danh vi khuẩn: urease, catalase, oxidase.
Chọn khuẩn lạc mọc tốt, nhiều, đem hoạt hóa trong môi trường lỏng để làm thử
nghiệm.
2.2. Thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn:
- Thử trên E. coli và P. aeruginosa:
Chitosan HD 2% và dd chitosan gel 1,7% pH6 được pha trong môi trường thạch
dinh dưỡng (2ml dd chitosan pha trong 8ml thạch dinh dưỡng). Vi khuẩn được
pha thành huyền dịch trong canh cấy lỏng dinh dưỡng với đậm độ 10
6
vi
khuẩn/ml, được cấy trên dĩa thạch, đem ủ 37
o
C/24giờ. Xác định vi khuẩn mọc
nhiều, ít hay không mọc để kết luận vi khuẩn có nhạy cảm với chế phẩm.
- Thử trên H. pylori:
Chế phẩm chitosan được pha loãng trong môi trường thạch máu với các nồng
độ như sau (Bảng 1):
H. pylori -được pha thành huyền dịch trong canh cấy lỏng dinh dưỡng với đậm
độ 10
6
vi khuẩn/ml và được cấy trên dĩa thạch có chứa chitosan. Các hộp thạch
được ủ ở môi trường vi hiếu khí tạo bởi Campy-Pak ở 37

pH6
+++ +++
Ghi chú: +++: vi khuẩn mọc mạnh
: vi khuẩn bị ức chế hoàn toàn
2. Thử trên H. pylori: (Bảng 3)
Bảng 3. Phân bố độ nhạy cảm của 20 chủng H. pylori -đối với chế phẩm chitosan ở các nồng độ
khác nhau
MIC của chitosan
(mg/ml)
0,85 1,7 3,4 6,8 >6,8
Số chủng H.
pylori thử nghiệm
(n=20)
1 3 2 5 9
Bàn luận
1. Trước khi xác định sự nhạy cảm của H. pylori đối với chitosan, tiến hành thử
nghiệm trên E. coli và P. aeruginosa là 2 loại vi khuẩn Gram (-) điển hình. Do
chitosan là một polymer không tan trong nước nên được điều chế thành 2 dạng:
dạng hỗn dịch trong nước 2% và dạng dung dịch gel 1,7% pH6. Kết quả của
Bảng 2 cho thấy chitosan ở dạng dd gel 1,7% pH6 được pha loãng nồng độ 3,4
mg/ml ức chế E. coli và P. aeruginosa trong khi chitosan dạng hỗn dịch không
cho tác dụng này.
Trong một công trình khảo sát tác dụng kháng khuẩn của chitosan thực hiện
trong nước trước đây, các tác giả cho biết đã dùng dung dịch chitosan 4% và
xác định nồng độ ức chế tối thiểu đối với E. coli và P. aeruginosa là 2/1000.
(5)
Như vậy, để có tác dụng kháng khuẩn, chitosan cần ở trạng thái phân tán tốt
trong môi trường và theo thử nghiệm này, chitosan được điều chế ở dạng dd gel
pH6. Chúng tôi đã chọn pH6 vì theo một số tác giả nước ngoài, niêm mạc dạ
dày là nơi ẩn trú của H. pylori có pH từ 5 đến 6, một chất kháng H. pylori tốt khi

có sẵn ở nước ta, hy vọng chitosan sẽ ít gây các tác dụng phụ bất lợi như các
hóa chất tổng hợp. Chitosan rất có triển vọng trở thành tác nhân có tác dụng tại
chỗ phối hợp với các thuốc khác để điều trị viêm loét dạ dày-tá tràng.
KẾT LUẬN
Từ kết quả thử có tác dụng ức chế trên E. coli và P. aeruginosa, chitosan ở
dạng dd gel 1,7% pH6 được chọn để thử tính kháng khuẩn H. pylori.
Khảo sát 20 chủng H. pylori được phân lập và nuôi cấy, chitosan dùng ở dạng
dd gel 1,7% pH6 có tác dụng ức chế một số chủng H. pylori với khoảng MIC từ
0,85 đến 6,8mg/ml.
Ðây chỉ là các kết quả bước đầu, chúng tôi còn tiếp tục nghiên cứu kỹ hơn vấn
đề này.
Tóm tắt
Bước đầu thử nghiệm in vitro xác định tính nhạy cảm của các chủng H. pylori
phân lập được tại TP. Hồ Chí Minh đối với chitosan qua 2 giai đoạn:
1. Thử trên E. coli và P. aeruginosa để xác định dạng bào chế thích hợp của
chitosan dùng khảo sát tính kháng khuẩn là dung dịch gel 1,7% pH6.
2. Thử trên 20 chủng H. pylori phân lập được tại TP. Hồ Chí Minh theo phương
pháp pha loãng trong thạch (5) cho thấy chitosan ở dạng dung dịch gel 1,7%
pH6 có tác dụng ức chế một số chủng H. pylori với khoảng nồng độ ức chế tối
thiểu từ 0,85 đến 6,8mg/ml.
Summary
PRELIMINARY STUDY ON EFFECT AGAINST HELICOBACTER PYLORI OF CHITOSAN
The preliminary in vitro susceptibilities of clinical isolates of Helicobacter pylori to
chitosan were determined in 2 stages:
1. By testing for inhibitory activity against E. coli and P. aeruginosa, we have
determined the suitable form of chitosan producing antibacterial activity was 1.7%
transparent chitosan gel solution pH6.
3. The in vitro susceptibilities of 20 clinical H. pylori isolates to 1.7% transparent
chitosan gel solution pH6 were determined by an agar dilution technique. The MIC
values of chitosan against some H. pylori isolates ranged from 0.85 to 6.8mg/ml.