Luận văn Thạc sĩ 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------O0O--------------

TRẦN THU TRANG

NGHIÊN CỨU CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÂY CÔM (ELAEOCARPUS GRIFFITHI)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TSKH. Phạm Văn Cường

Hà Nội, Năm 2013

1


Luận văn Thạc sĩ 2013
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến TSKH. Phạm Văn Cường người đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản
luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ tại phòng Tổng hợp Hữu
cơ -Viện Hóa sinh biển và ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã động viên và giúp
đỡ tôi rất nhiều trong việc hoàn thành bản luận văn này.

13

Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy

C-NMR

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon)
d

Dublet

dd

Dublet của dublet

dt

Dublet của triplet

dq

Dublet của quartet

DMSO

Dimethyl sulfoxyd

DEPT

Distortionless Enhancement By Polarization Transfer (Phổ DEPT)


1

H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton)

IR

Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

IC50

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của cá thể nghiên cứu

KB

Tế bào ung thư biểu mô

MCF-7

Tế bào ung thư vú

m

Multiplet

MS

Mass spectrometry

3

Singulet

q

Quartet

J(Hz)

Hằng số tương tác tính bằng Hz

δ (ppm)

Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm

4


Luận văn Thạc sĩ 2013
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae) ...........3
Hình 2. Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandis
Hình 3. Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus fuscoides..............................5
Hình 4. Một số hợp chất phân lập từ loài E. parvifolius và E. mastersi...................6
Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis......................................6
Hình 6: Chu kỳ tế bào................................................................................................8
Hình 7: Các tác nhân alkylants .................................................................................9
Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất........................................10
Hình 9: Ức chế tổng hợp protein...............................................................................11
Hình 10: Các chất đan xen chuỗi ADN.....................................................................11
Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II.......................................................12

của chất F4


Luận văn Thạc sĩ 2013

MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với công cuộc phát triển kinh tế thì việc chăm sóc sức khỏe ban
đầu và bảo vệ sức khỏe cộng đồng trở nên cấp thiết đối với mọi quốc gia trên thế giới.
Do vậy, nhu cầu về sử dụng thuốc để phòng ngừa và chữa trị những căn bệnh nan y,
đặc biệt là ung thư ngày càng cao. Hiện nay, một trong những hướng chính để phòng
ngừa và chữa trị bệnh ung thư là nghiên cứu tìm các hợp chất có nguồn gốc từ thiên
nhiên. Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), 80% dân số trên toàn thế giới
vẫn tin dùng các loại thảo dược cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và khoảng hơn
60% các tác nhân hóa trị liệu dùng trong điều trị ung thư có nguồn gốc từ các hợp chất
tự nhiên.[9,15,20].
Nước ta có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo các số liệu
thống kê của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), thì thảm thực vật Việt
Nam có trên 12.000 loài, trong đó có khoảng 3.200 loài được sử dụng trong dân gian
làm thuốc mới có hoạt tính cao, đã được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh [34].
Ví dụ nổi bật là việc phát hiện ra hai loại hoạt chất tự nhiên Vinblastine và Vincristine
từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don), họ Trúc đào (Apocynaceae) [19]
và Taxol từ cây thông đỏ (Taxus brevifolia), họ Thông (Pinaceae) [31], cùng với các
dẫn xuất bán tổng hợp như Taxotere từ 10-deacetyl bacatin III hay gần đây hoạt chất
Vinflunine từ Vinorelbine cũng đã chính thức được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân
ung thư. Tuy nhiên, còn phần lớn các cây thuốc dân gian vẫn chưa được nghiên cứu
một cách hệ thống. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học
không những giúp sử dụng các cây thuốc một cách hiệu quả mà trên cơ sở đó còn phân
lập được các hoạt chất để từ đó tiến hành tổng hợp hoặc bán tổng hợp ra các hoạt chất
mới có hoạt tính cao hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị.
Mô hình nghiên cứu “Sinh học dẫn đường” nhằm tìm kiếm những chất có hoạt

8


Luận văn Thạc sĩ 2013
Côm (Elaeocarpus griffithii) là loại cây đại mộc cao khoảng 10-25m, thân
thẳng, gốc có bạnh bè thấp, cành non màu nâu nhạt, nhánh non có lông mịn. Lá có
phiến mỏng hình mác dài 7-10 cm, rộng 2,5-3,5 cm, đầu có mũi nhọn, mép lượn
sóng, có răng cưa mềm, hoa mọc thành từng chùm ở nách hay đầu cành, đài hoa có
năm lá đài hình tam giác, nhị nhiều. Quả hình thận dài 1,5 cm, đường kính 0,8 – 1cm,
khi chín có màu đen. Gỗ cây màu trắng vàng có thể dựng làm nhà, đóng đồ mộc
thông thường xẻ ván. Nhân dân nhiều nơi thường chặt hạ cây này để mục trong rừng
để gây trồng nấm hương [1,2].

Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae)
1.1.2. Phân bố sinh thái

Côm (Elaeocarpus griffithii) là loại cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, với một
ít là cây ôn đới. Phần lớn các loài cây thường xanh. Cây mọc rải rác trong rừng
thứ sinh ở độ cao từ 400 m trở xuống. Cây ưa sáng, mọc nhanh, thích hợp với đất
sét pha. Tái sinh hạt tốt, ra hoa vào tháng 8-9, có quả chín tháng 12 đến tháng 1
năm sau. [1,2]

9


Luận văn Thạc sĩ 2013
Chúng được tìm thấy ở Madagascar, Đông Nam Á, Malaysia, miền đông
Australia, New Zealand, Tây Ấn và Chile. Họ này chứa khoảng 605 loài cây thân gỗ và
cây bụi trong 12 chi. Ở Việt Nam có 38 loài phân bố từ Tuyên Quang đến Phú Quốc.
Các loài trong họ Elaeocarpaceae phần lớn loài cây này có hoa lưỡng tính hoặc

của chi Elaeocarpus. Khi nghiên cứu về loài Elaeocarpus parvifolius, K. Nabeta và
cộng sự đã phân lập được các hợp chất là 4-O-methylellagic acid 3 0-(200,300 -diO-acetyl)-a-rhamnoside(13), 4-O-methylellagic acid 3 0 -a-rhamnoside (14), 4-Omethylellagic acid 3 0 -(300 -O-acetyl)-a-rhamnoside (15), and 4-O-methylellagic
acid 3 0 -(400 -O-acetyl)-a-rhamnoside (16)[10]. Trong đó, hợp chất 13 và 15 cho
hoạt tính kháng ký sinh trùng babesia rất đáng quan tâm. Các dẫn xuất của axit
ellagic cũng được tìm thấy trong loài Elaeocarpus mastersii như hợp chất 4,40-Odimethylellagic acid 3-(200,300-di-O-acetyl)-a-l-rhamnoside (17).
Mặt khác, cũng từ loài này, các nhà khoa học đã phân lập được hai hợp chất
triterpen cucurbitacin D (18) và cucurbitacin F (19) có hoạt tính gây độc tế bào rất

11


Luận văn Thạc sĩ 2013
khả quan trên các dạng tế bào ung thư khác nhau với các giá trị ED 50 trong khoảng
0,01 – 1,9 g/ml [5]

Hình 4. Một số hợp chất phân lập từ loài E. parvifolius và E. mastersi
Từ dịch chiết vỏ cây của loài Elaeocarpus habbemensis, thu thập ở phía
nam tỉnh Papua New Guinea, tháng 01 năm 1999. Peter L. Katavic và các cộng sự
đã phân lập được hai hợp chất alkaloid pyrrolidine mới đó là habbemines A (20)
and B (21) như là một đồng phân quang học của nhau. hỗn hợp đồng phân
habbemines A and B cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ quan thụ cảm δopioid của người với IC50 là 32,1 M. [24]

12


Luận văn Thạc sĩ 2013

Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis

1.3 Tổng quan về bệnh ung thư

bệnh nhân ung thư ngày càng tăng.
1.3 .2 Chu kỳ tế bào

Các tế bào của sinh vật Eukaryotae trải qua nhiều giai đoạn nối tiếp nhau và
kết thúc bằng sự phân chia tạo ra tế bào mới. Toàn bộ quá trình tế bào đến tế bào
thế hệ kế tiếp được gọi là chu trình tế bào, gồm 4 giai đoạn: M, G 1, S và G2. Nếu tế
bào có chu kỳ bị tạm thời ngưng trệ hay bị đảo ngược thì được xem như lâm vào
một trạng thái tĩnh lặng gọi là pha G0. [3]

Hình 6: Chu kỳ tế bào
Pha G0 (hay là thời kỳ sau nguyên phân) trong pha này tế bào không tham gia vào
chu kỳ và ngừng phân chia.
Pha G1: Kéo dài từ sau khi tế bào phân chia đến bắt đầu sao chép vật chất di
truyền. Sự tích lũy vật chất nội bào đến một điểm nào đó đạt điểm tới hạn thì tế bào
bắt đầu tổng hợp ADN.
Pha S: là giai đoạn tổng hợp ADN

14


Luận văn Thạc sĩ 2013
Pha G2: Trong suốt giai đoạn này số lượng ADN tăng gấp đôi cho đến khi tế bào
phân chia.
Pha M: là giai đoạn nguyên phân
Các thuốc chống ung thư thường được phân loại theo phương thức hoạt động
của chúng. Nhiều tác nhân chống ung thư hoạt động theo cách thức phụ thuộc vào
chu kỳ tế bào.
• Tác nhân alkyl hóa (alkylants)
• Tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất
• Tác nhân ức chế tổng hợp protein ở tiểu đơn vị ribosome

5-flourouracile là một trong những chất điển hình của lớp chất chống ung thư loại
này. Hoạt tính chống ung thư của 5-fluorouracile nhờ chuyển hóa thành 5fluorodesoxyuridine monophosphate. Hợp chất này chính là chất ức chế đặc hiệu
đối với thymidilate-synthetase – chất chịu trách nhiệm xúc tác quá trình methyl hóa
axit desoxyuridilique thành axit thymidilic.

16


Luận văn Thạc sĩ 2013

Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất
1.3.2.3 Tác nhân ức chế tổng hợp protein ở tiểu đơn vị ribosome
Girolline là một dẫn xuất 2-aminoimidazole. Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng
girolline có tác dụng ức chế tổng hợp protein và làm ngừng chu kỳ tế bào ở giai
đoạn G2.
Homoharringtonine là một alkaloid được phân lập từ cây Cephalotaxus
harringtonia, thuộc họ (Cephalotaxaceae). Hợp chất này có khả năng ức chế tổng
hợp protein bằng cách tác động sớm vào giai đoạn kéo dài peptide [30].

Hình 9: Ức chế tổng hợp protein
1.3.2.4 Các chất tương tác với ADN và phức hệ enzyme topoisomerase I và II

17


Luận văn Thạc sĩ 2013
Tác nhân đan xen vào chuỗi AND
Doxorubicin tương tác với ADN bằng cách đan xen và ức chế sinh tổng hợp đại
phân tử. [11] [18] Nhờ vào cấu trúc phẳng, doxorubicine có khả năng xen vào giữa
các vòng xoắn được tạo thành giữa các bazơ của chuỗi ADN và như vậy ngăn chặn

Vincristine và Vinblastine là alkaloid chiết xuất từ cây dừa cạn Catharanthus
roseus (L.)G.Don. Chúng ngăn chặn nhưng có thể phục hồi được sự phân chia gián
phân ở giai đoạn trung kỳ. Nhờ sự liên kết của thuốc với các vi cấu trúc hình ống
khi gián phân, vincristine ức chế được sự tạo thành thoi gián phân. Trong tế bào ung
thư, vincristine ức chế một cách chọn lọc cơ chế sửa đổi ADN ; và bằng cách ức chế
ARN-polymerase phụ thuộc ADN, vincristine ức chế được sự tổng hợp ARN. Ở
nồng độ cao vinblastine có thể hiện nhiều tác dụng phức tạp tổng hợp acid nucleic
và protein [37].

19


Luận văn Thạc sĩ 2013

Hình 12: Các tác nhân chống lại quá trình phân bào
1.3.2.6 Vacxin và kháng thể
Một cách tiếp cận trong cuộc chiến chống lại ung thư là nghiên cứu vaccin
hoặc các kháng thể đặc hiệu cho các thụ thể của tế bào ung thư. Phát triển trong lĩnh
vực sinh học và công nghệ sinh học để xác định các yếu tố chịu trách nhiệm cho sự
gia tăng của các tế bào khối u và sản xuất kháng thể đặc hiệu.
Vaccin CDX-110 phòng chống các bệnh u thần kinh đệm, một loại u não ác
tính và thường gặp nhất. Vaccin nhắm vào khối u, gây ra một phản ứng miễn dịch
đặc hiệu để chống lại một loại protein ở trên bề mặt của các tế bào ung thư não,
protein này là dạng thụ thể màng tế bào đột biến, có tên gọi là EGFRvIII, liên quan
đến sự tăng trưởng của ung thư.
Các nhà khoa học thuộc Trường Đại học Gorgia Mỹ vừa nghiên cứu một loại
vaccin mang tên Herceptin khả năng phòng ngừa tổng hợp lên tới khoảng 7 loại
ung thư có tỷ lệ tử vong cao như hiện nay: ung thư tiền liệt tuyến, ung thư tụy, ung
thư đường ruột và ung thư buồng trứng…Vaccin này có chứa một lượng nhỏ các
protein có tên là MUC1, có tác dụng luyện tập cho hệ miễn dịch cơ thể, từ đó hệ

pháp điều trị hiện nay như hóa trị, xạ trị, phẫu thuật...đều để lại tác dụng xấu, nhiều
bệnh nhân Ung thư chết do suy kiệt trước khi chết vì ung thư
Trong hành trình đó, các nhà nghiên cứu đã tách chiết các hợp chất hóa học
và trên cơ sở đã bán tổng hợp và tổng hợp ra rất nhiều hợp chất có khả năng ức chế
sự phát triển và diệt tế bào ung thư như
Các nhà nghiên cứu tại Viện nghiên cứu Y khoa Sanford-Burnham, đứng đầu
là Kristiina Vuori, MD, Ph.D., đã phát hiện ra một hợp chất tự nhiên là sceptrin

21


Luận văn Thạc sĩ 2013
được tìm thấy trong các loài bọt biển, làm giảm sự di chuyển của các tế bào ung thư
và có độc tính rất thấp.
Những nghiên cứu lâm sàng bước đầu đã chỉ ra rằng Curcumin có tác dụng
tốt với một số bệnh ung thư như: ung thư tuyến tụy, ung thư vú, ung thư da, ung thư
trực tràng…
Một nghiên cứu của Đại học Missouri, Mỹ cho thấy, resveratrol-một hợp
chất được tìm thấy trong quả nho và rượu vang đỏ có thể khiến một số tế bào ung
thư như nhạy cảm hơn với xạ trị.
Ngày nay, các nhà khoa học vẫn đang miệt mài nghiên cứu nhằm tìm được
những hợp chất có hoạt tính cao trong điều trị ung thư
1.4 Các phương pháp nghiên cứu độ độc tế bào
Một vài phép so màu nhanh đã được miêu tả trong thử nghiệm trên các dòng tế bào
ung thư ở mức độ in vitro, trong đó hiện nay người ta thường sử dụng hai phương
pháp là: phương pháp MTT và phương pháp SRB.
1.4.1 Phương pháp MTT
Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ
biến. Phương pháp này lần đầu tiên được miêu tả bởi Tim Mosmann trên tạp chí
Immunological Methods năm 1983 [1]. Theo tác giả, muối tetrazolium được dùng


23


Luận văn Thạc sĩ 2013
từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20. Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba
nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside.
Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý
trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm:
codein, caffeine và morphine. Một số loài thực vật chứa nhiều alkaloid như: cây
thuốc phiện (họ Papaveraceate; cây canh kin a (họ Rubiaceae); cây cà độc dược,
thuốc lá và khoai tây. Người ta thường gặp trong một cây tập hợp alkaloid có cấu
trúc hóa học gần giống nhau. Đôi khi toàn cây chứa alkaloid, đôi khi chỉ tập trung
trong lá. Các alkaloid có hoạt tính sinh học rất khác biệt, một số tác dụng lên hệ
thần kinh (caffeine, atropine, strychnine…), một số tác dụng lên các cơ (veratrin,
atropine…), một số tác dụng lên mạch máu, một số khác tác dụng lên bộ máy hô
hấp. Alkaloid thường độc với liều lượng lớn nhưng với liều lượng nhỏ, chúng được
sử dụng làm thuốc chữa bệnh.
Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và
dung môi. Giống như những lipid khác, các terpenoid không tan trong nước. Terpên
được xây dựng từ những đơn vị 5 carbon và được thiết lập từ nhiều đơn vị isoprene,
ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene.
Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các
cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất
mùi thực phẩm và dược phẩm.

24


Luận văn Thạc sĩ 2013


25