Luận văn Thạc sĩ 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------O0O--------------

TRẦN THU TRANG

NGHIÊN CỨU CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH
GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CÂY CÔM (ELAEOCARPUS GRIFFITHI)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TSKH. Phạm Văn Cường

Hà Nội

1


Luận văn Thạc sĩ 2013
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
đến TSKH. Phạm Văn Cường người đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản
luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ tại phòng Tổng hợp Hữu
cơ -Viện Hóa sinh biển và ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đã động viên và giúp
đỡ tôi rất nhiều trong việc hoàn thành bản luận văn này.


Carbon Magnetic Resonance Spectroscopy

C-NMR

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon)
d

Dublet

dd

Dublet của dublet

dt

Dublet của triplet

dq

Dublet của quartet

DMSO Dimethyl sulfoxyd

DEPT

Distortionless Enhancement By Polarization Transfer (Phổ DEPT)

ED50


H-1H Correlated Spectroscopy (Phổ tương tác proton-proton)

IR

Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

IC50

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của cá thể nghiên cứu

KB

Tế bào ung thư biểu mô

MCF-7

Tế bào ung thư vú

m

Multiplet

MS

Mass spectrometry

3


Luận văn Thạc sĩ 2013


Quartet

J(Hz)

Hằng số tương tác tính bằng Hz

δ (ppm)

Độ chuyển dịch hóa học tính bằng ppm

4


Luận văn Thạc sĩ 2013
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Cây Côm (Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae) ..................3
Hình 2. Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus grandis.................................4
Hình 3. Một số hợp chất alkaloid từ loài Elaeocarpus fuscoides..............................5
Hình 4. Một số hợp chất phân lập từ loài E. parvifolius và E. mastersi...................6
Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis......................................6
Hình 6: Chu kỳ tế bào................................................................................................8
Hình 7: Các tác nhân alkylants .................................................................................9
Hình 8: Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất........................................10
Hình 9: Ức chế tổng hợp protein...............................................................................11
Hình 10: Các chất đan xen chuỗi ADN.....................................................................11
Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II.......................................................12
Hình 12: Cấu trúc hóa học của hợp chất F1........................................................................13
Hình 13: Cấu trúc hóa học của chất F2................................................................................26



6


Luận văn Thạc sĩ 2013
đặc biệt là ung thư ngày càng cao. Hiện nay, một trong những hướng chính để phòng
ngừa và chữa trị bệnh ung thư là nghiên cứu tìm các hợp chất có nguồn gốc từ thiên
nhiên. Theo đánh giá của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), 80% dân số trên toàn thế giới
vẫn tin dùng các loại thảo dược cho việc chăm sóc sức khỏe ban đầu và khoảng hơn
60% các tác nhân hóa trị liệu dùng trong điều trị ung thư có nguồn gốc từ các hợp chất
tự nhiên.[9,15,20].
Nước ta có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo các số liệu
thống kê của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), thì thảm thực vật Việt
Nam có trên 12.000 loài, trong đó có khoảng 3.200 loài được sử dụng trong dân gian
làm thuốc mới có hoạt tính cao, đã được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh [34].
Ví dụ nổi bật là việc phát hiện ra hai loại hoạt chất tự nhiên Vinblastine và Vincristine
từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don), họ Trúc đào (Apocynaceae) [19]
và Taxol từ cây thông đỏ (Taxus brevifolia), họ Thông (Pinaceae) [31], cùng với các
dẫn xuất bán tổng hợp như Taxotere từ 10-deacetyl bacatin III hay gần đây hoạt chất
Vinflunine từ Vinorelbine cũng đã chính thức được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân
ung thư. Tuy nhiên, còn phần lớn các cây thuốc dân gian vẫn chưa được nghiên cứu
một cách hệ thống. Việc nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học
không những giúp sử dụng các cây thuốc một cách hiệu quả mà trên cơ sở đó còn phân
lập được các hoạt chất để từ đó tiến hành tổng hợp hoặc bán tổng hợp ra các hoạt chất
mới có hoạt tính cao hơn và ít tác dụng phụ hơn trong điều trị.
Mô hình nghiên cứu “Sinh học dẫn đường” nhằm tìm kiếm những chất có hoạt
tính sinh học là mô hình nghiên cứu tiên tiến, có định hướng cao, nhằm làm sáng tỏ
bản chất khoa học của nguồn tài nguyên thiên nhiên, góp phần đưa nhanh các kết quả
nghiên cứu vào áp dụng thực tiễn. Việc nghiên cứu kế thừa và phát huy vốn quí của
dân tộc đặt ra trong lúc này vừa là vận hội và cũng là thách thức đối với những nhà

Luận văn Thạc sĩ 2013
khi chín có màu đen. Gỗ cây màu trắng vàng có thể dựng làm nhà, đóng đồ mộc
thông thường xẻ ván. Nhân dân nhiều nơi thường chặt hạ cây này để mục trong rừng
để gây trồng nấm hương [1,2].

Hình 1:
Cây Côm

(Elaeocarpus griffithi) thuộc họ Côm (Elaeocarpaceae)
1.1.2. Phân bố sinh thái
Côm (Elaeocarpus griffithii) là loại cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, với một

ít là cây ôn đới. Phần lớn các loài cây thường xanh. Cây mọc rải rác trong rừng
thứ sinh ở độ cao từ 400 m trở xuống. Cây ưa sáng, mọc nhanh, thích hợp với đất
sét pha. Tái sinh hạt tốt, ra hoa vào tháng 8-9, có quả chín tháng 12 đến tháng 1
năm sau. [1,2]
Chúng được tìm thấy ở Madagascar, Đông Nam Á, Malaysia, miền đông
Australia, New Zealand, Tây Ấn và Chile. Họ này chứa khoảng 605 loài cây thân gỗ và
cây bụi trong 12 chi. Ở Việt Nam có 38 loài phân bố từ Tuyên Quang đến Phú Quốc.
Các loài trong họ Elaeocarpaceae phần lớn loài cây này có hoa lưỡng tính hoặc
khác gốc và chúng mọc thành cụm [1,2].
1.2 Những nghiên cứu trước đây về cây Côm (Elaeocarpus griffithii)
Cho đến nay, chưa có công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học nào được công bố về loài thực vật này.

9


Luận văn Thạc sĩ 2013
Các nghiên cứu về các loài khác thuộc chi này cho thấy thành phần hóa học của


kháng ký sinh trùng babesia rất đáng quan tâm. Các dẫn xuất của axit ellagic cũng
được tìm thấy trong loài Elaeocarpus mastersii như hợp chất 4,40-Odimethylellagic acid 3-(200,300-di-O-acetyl)-a-l-rhamnoside (17).
Mặt khác, cũng từ loài này, các nhà khoa học đã phân lập được hai hợp chất
triterpen cucurbitacin D (18) và cucurbitacin F (19) có hoạt tính gây độc tế bào rất
khả quan trên các dạng tế bào ung thư khác nhau với các giá trị ED 50 trong khoảng
0,01 – 1,9 g/ml [5]

11


Luận văn Thạc sĩ 2013

Hình 4. Một số hợp chất phân lập từ loài E. parvifolius và E. mastersi
Từ dịch chiết vỏ cây của loài Elaeocarpus habbemensis, thu thập ở phía
nam tỉnh Papua New Guinea, tháng 01 năm 1999. Peter L. Katavic và các cộng sự
đã phân lập được hai hợp chất alkaloid pyrrolidine mới đó là habbemines A (20)
and B (21) như là một đồng phân quang học của nhau. hỗn hợp đồng phân
habbemines A and B cho thấy khả năng liên kết mạnh với cơ quan thụ cảm δopioid của người với IC50 là 32,1 M. [24]

12


Luận văn Thạc sĩ 2013

Hình 5: Một số hợp chất từ loài Elaeocarpus habbemensis
1.3 Tổng quan về bệnh ung thư
1.3.1 Cơ sở khoa học của bệnh ung thư
Ung thư là một tên chung dùng để gọi một nhóm bệnh trên 200 loại khác nhau về
nguồn gốc của tế bào, căn nguyên, tiên lượng và cách thức điều trị nhưng có những đặc

thúc bằng sự phân chia tạo ra tế bào mới. Toàn bộ quá trình tế bào đến tế bào thế hệ kế tiếp
được gọi là chu trình tế bào, gồm 4 giai đoạn: M, G1, S và G2. Nếu tế bào có chu kỳ bị tạm
thời ngưng trệ hay bị đảo ngược thì được xem như lâm vào một trạng thái tĩnh lặng gọi
là pha G0. [3]
Hình 6: Chu kỳ tế bào
Pha G0 (hay là thời kỳ
sau nguyên phân) trong
pha này tế bào không
tham gia vào chu kỳ và
ngừng phân chia.
Pha G1: Kéo dài từ sau
khi tế bào phân chia đến
bắt đầu sao chép vật chất di truyền. Sự tích lũy vật chất nội bào đến một điểm nào đó đạt
điểm tới hạn thì tế bào bắt đầu tổng hợp ADN.
Pha S: là giai đoạn tổng hợp ADN
Pha G2: Trong suốt giai đoạn này số lượng ADN tăng gấp đôi cho đến khi tế bào phân

14


Luận văn Thạc sĩ 2013
chia.
Pha M: là giai đoạn nguyên phân
Các thuốc chống ung thư thường được phân loại theo phương thức hoạt động của
chúng. Nhiều tác nhân chống ung thư hoạt động theo cách thức phụ thuộc vào chu kỳ tế
bào.
•

Tác nhân alkyl hóa (alkylants)



Hình 7: Các tác nhân alkylants
1.3.2.2 Những tác nhân chống lại quá trình trao đổi chất (ức chế quá trình tổng hợp acid
nucleic).

Cytosine arabinoside là chất can thiệp vào quá trình tổng hợp ADN và chuyển đổi
nhanh chóng vào triphosphate arabinoside cytosine gây tổn thương ADN trong
pha S. Cytosine arabinoside ức chế enzyme ADN, ARN polymerase và enzyme
nucleotide reductase cần thiết để tổng hợp ADN. Khi được sử dụng như là một chức
năng kháng virus thì cytarabine sẽ ức chế deoxycytidine [16].
Methotrexate có khả năng ức chế dihydrofolate reductase (DHFR), một loại enzyme
tham gia vào quá trình sinh tổng hợp axit fonic.[25] Ái lực của methotrexate với
DHFR gấp 1000 lần so với folate. DHFR xúc tác chuyển đổi dihydrofolate đến
hoạt động tetrahydrofolate. Axit folic là cần thiết cho tái tổng hợp nucleoside
thymidine và tổng hợp ADN. Ngoài ra, folate là cần thiết để tổng hợp purine. Do

đó, tất cả tổng hợp purine sẽ bị ức chế. Methotrexate ức chế sự tổng hợp của DNA,
RNAs, và proteins.

16


Luận văn Thạc sĩ 2013
5-flourouracile là một trong những chất điển hình của lớp chất chống ung thư loại này.
Hoạt tính chống ung thư của 5-fluorouracile nhờ chuyển hóa thành 5-

fluorodesoxyuridine monophosphate. Hợp chất này chính là chất ức chế đặc hiệu
đối với thymidilate-synthetase – chất chịu trách nhiệm xúc tác quá trình methyl hóa
axit desoxyuridilique thành axit thymidilic.



Luận văn Thạc sĩ 2013
Hình 10: Các chất đan xen chuỗi AND

Ức chế enzyme topoisomerase I và II
Topotecan là một dẫn xuất bán tổng hợp của camptothecin. Camptothecin là một sản phẩm
tự nhiên được chiết xuất từ vỏ cây của loài Camptotheca acuminata. Topoisomerase-I là
một enzyme có chức năng tháo xoắn một mạch. Khi topoisomerase-I tháo xoắn sợi đơn,
topotecan xen giữa các bazơ của ADN. Sự đan xen này sẽ phá vỡ quá trình sao chép ADN
và cuối cùng dẫn đến cái chết của tế bào. Các tế bào động vật có vú không thể sửa chữa
những sợi đôi bị phá vỡ này.[26] Trong nhóm ức chế enzyme topoisomerase-I, Irinotecan
cũng là một trong những chất điển hình của nhóm này.
Etoposide tạo thành một phức hợp với ADN và enzyme topoisomerase II, ngăn ngừa sự co
xoắn của sợi ADN và dẫn đến phá vỡ sợi ADN.[13,12].

Hình11: Ức chế enzyme topoisonmerase I và II
1.3.2.5 Gây độc trong quá trình phân bào
Colchicine ức chế vi ống trên thoi gián phân bằng cách liên kết với tubulin, một trong

19


Luận văn Thạc sĩ 2013
những thành phần chính của vi ống. Tubulin là cần thiết để điều khiển quá
trình phân bào và do đó colchicine có chức năng như một “chất độc phân bào hoặc
chất độc của thoi” [36].

Vincristine và Vinblastine là alkaloid chiết xuất từ cây dừa cạn Catharanthus roseus
(L.)G.Don. Chúng ngăn chặn nhưng có thể phục hồi được sự phân chia gián phân ở


dòng gây ra một phản ứng miễn dịch với CEA (Carcino Embryonic Antigen). Kháng
nguyên CEA này hiện diện trong ung thư ruột.
Mặt khác, việc điều trị kết hợp các loại vaccin với thuốc hóa trị liệu làm tăng tỷ lệ
sống sót: Herceptin thường gắn liền với taxol và ceavac được dùng cho bệnh nhân kết hợp
với fluorouracil-5 và leucovorin.
Đề kháng với các chất chống ung thư là một trong những thách thức lớn của hóa trị
liệu. Sự đề kháng này được gây ra bởi nhiều yếu tố và cơ chế vẫn chưa được hiểu rõ. Yếu
tố có thể là do:
- Gây ra từ sự sửa chữa ADN giống như polymerase-β.
- Giảm sự xâm nhập của thuốc vào trong tế bào (làm giảm nồng độ của thuốc trong các tế
bào).
- Sự gia tăng từ trong ra ngoài của các khối u tế bào đa kháng .
- Hấp thụ thuốc trong tế bào ngăn, ngăn cản tiếp xúc của thuốc với tế bào mang bệnh.
- Sự biến đổi hoặc thay đổi enzyme đích.
Điều trị ung thư bằng vaccin cũng có nhiều tác dụng phụ và đôi khi còn gây chết
người. Với những thách thức này, việc tìm kiếm các loại thuốc mới chống ung thư là cần
thiết và các phân tử từ tự nhiên luôn là nguồn tài nguyên quý giá.
1.3.3 Ứng dụng của các hợp chất tự nhiênt trong điều trị ung thư
Hiện nay, ung thư vẫn là bài toán khó đối với y học và là căn bệnh đáng sợ nhất
của con người do chưa có thuốc đặc trị. Vì thế, các nhà khoa học vẫn không ngừng
kiếm tìm các hợp chất mới để tiêu diệt căn bệnh của thời đại, nhất là khi các phương pháp
điều trị hiện nay như hóa trị, xạ trị, phẫu thuật...đều để lại tác dụng xấu, nhiều bệnh nhân
Ung thư chết do suy kiệt trước khi chết vì ung thư

21


Luận văn Thạc sĩ 2013
Trong hành trình đó, các nhà nghiên cứu đã tách chiết các hợp chất hóa học và




Luận văn Thạc sĩ 2013

1.4.2 Phương pháp SRB
Phép thử SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm 1990 để đánh giá
độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế bào trong ứng dụng sàng
lọc thuốc ở qui mô lớn. Nguyên tắc của phép thử là khả năng nhuộm màu của SRB
lên protein¸ SRB nhuộm bằng cách phá vỡ màng tế bào, những mảnh vỡ tế bào
không bị nhuộm, do đó không ảnh hưởng đến số liệu thực nghiệm. Phương pháp
SRB dựa trên khả năng liên kết tĩnh điện và sự phụ thuộc vào pH của các dư lượng
amino acid của các protein. Dưới các điều kiện môi trường axit nhẹ, SRB liên kết
với các dư lượng amino acid trên các protein của các tế bào đã được cố định bằng
trichloroacetic acid (TCA) và sử dụng bazơ yếu như Tris-base để hòa tan và đo mật
độ quang của dịch chiết từ tế bào một cách định lượng.
1.5 Phân loại các hợp chất thứ cấp trong thực vật
Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực
phẩm có giá trị. Nhữn sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường
được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được viết
đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi
trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về

23


Luận văn Thạc sĩ 2013
các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ
20. Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và
glycoside.
Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên tất cả

Luận văn Thạc sĩ 2013
Công nghệ Việt Nam.
Vỏ cây tươi sau khi sấy khô, xay nhỏ thu được 1,4 kg nguyên liệu.
2.1.2. Các dạng tế bào
Các dạng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: KB (Human
epidermic carcinoma) – ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các
phép thử độ độc tế bào; và MCF-7 (Human breast carcinoma) – ung thư vú.
2.1.3 Thiết bị và hóa chất tách chiết mẫu thực vật
Sắc ký bản mỏng phân tích: sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60
F254 Merk, độ dày 0,2mm.
Sắc ký cột tổng sử dụng silica gel cỡ hạt 63- 100 mm
Sắc ký cột thường sử dụng silica gel cỡ hạt 40µm - 63 µm
Các loại cột sắc ký với kích cỡ khác nhau.
Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254, 365nm sau đó
hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4); thuốc thử vanilin-H2SO4 (vanillin 1,2g; MeOH
200ml, CH3COOH 25ml; H2SO4 11ml)
Điểm nóng chảy đo trên máy BUCHI Melting Point B545 (Thụy Sĩ) của viện
Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Brucker Avance
500MHz viện Hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Các dung môi như n-hexan, etyl axetat, diclometan, metanol, aceton, etanol
đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.
2.1.4 Thiết bị và hóa chất thử hoạt tính gây độc tế bào
Môi trường nuôi cấy tế bào: AMEM và AMEM có bổ sung 1% insulin,
trypsin-EDTA (Gibco, Hoa kỳ)
Dung môi để hòa tan chất cần thử hoạt tính: DMSO
Tủ ấm CO2 (Innova CO-170); Tủ cấy vô trùng cấp I ( Labcaire), cấp II
(SterilGard II);
Máy li tâm (universal 320 R); Kính hiển vi ngược (Axiovert 40 CFL)
Tủ lạnh sâu -25oC, - 800C