ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----o0o-----

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN
TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN
TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM

Chuyên ngành:

Vi sinh vật học

Mã số:

60420107

Nguyễn Thị Kim Dung


MỤC LỤC


DANH MỤC BẢNG


DANH MỤC HÌNH



MỞ ĐẦU
Bệnh cúm đã và đang đe dọa toàn cầu. Trong ba thế kỷ qua, cứ
khoảng 10 đến 40 năm, thế giới lại chứng kiến một đại dịch cúm. Trước khi
có vắcxin, mỗi đợt dịch có hàng triệu người chết. Năm 1918 chứng kiến đại
dịch cúm nghiêm trọng nhất lịch sử thế giới, thậm chí còn được cho là đại
dịch kinh hoàng nhất trong các loại bệnh dịch. Tác nhân gây dịch là vi rút
cúm A/H1N1 đã gây tổn thất chưa từng thấy. Dịch cúm gia cầm A/H5N1
xuất hiện từ giữa tháng 12/2003 tại Hàn Quốc, sau đó lan rộng ra một số
nước châu Á trong đó có Việt Nam. Từ đầu tháng 4/2009, Mexico đã thông
báo trường hợp nhiễm cúm A/H1N1. Vi rút này nhanh chóng lan ra rất nhiều
quốc gia trên thế giới và đã có thời điểm Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG)
phải đưa ra các cảnh báo coi đây như là một đại dịch cúm mới. Gần đây nhất,
vào năm 2013, trường hợp nhiễm cúm A/H7N9 đầu tiên được thông báo ở
Trung Quốc và đang tiếp tục dấy lên một mối lo ngại cho châu Á nói riêng
cũng như toàn Thế giới nói chung về một căn nguyên cúm mới nguy hiểm
đối với sức khoẻ con người.
Bệnh cúm là một trong những bệnh nhiễm trùng đường hô hấp tạo

9


Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm chung của vi rút cúm
Vi rút cúm thuộc họ Othomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài,
genom là ARN đơn, (-), phân đoạn, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm
B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Trong đó, vi rút cúm A lưu hành phổ
biến trên gia cầm, người và động vật khác như lợn, ngựa…là căn nguyên gây nên
các đại dịch lớn trên toàn cầu. Vi rút cúm B và C chỉ lưu hành ở người và thường
chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ. Các vi rút cúm A, B và C rất giống nhau về cấu
trúc. Thể vi rút có chiều ngang từ 80-120 nm, và thường có hình gần như tròn,
ngoài ra vi rút cũng có thể hiện diện một số dưới dạng hình sợi. Thể vi rút cúm
được cấu tạo từ một vỏ vi rút bao gồm 2 loại glycoprotein, quấn quanh một phần
nhân trung tâm. Phần nhân trung tâm chứa bộ gene RNA và các protein khác có
chức năng đóng gói và bảo vệ thể RNA này. Đối với 1 vi rút, thông thường bộ gene
không chỉ có 1 mảnh nucleic acid; thay vào đấy, sẽ chứa 7 hoặc 8 mảnh RNA có
chiều âm và phân đoạn. Vi rút cúm A có bộ gene mã hoá cho 11 protein trên 8 đoạn
RNA: hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP), M1, M2,
NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 và PB2.
1.2. Hình thái và cấu trúc hạt vi rút cúm
Hạt vi rút cúm có hình dáng rất đa dạng: hình cầu, hình trứng hoặc đôi khi có
hình sợi kéo dài tới 2000 nm, đường kính trung bình từ 80-120 nm. Các hạt virion
của vi rút A và B có vỏ bao bọc. Vỏ vi rút có bản chất là protein có nguồn gốc từ
màng tế bào vật chủ, bao gồm một số protein được glycosyl hóa và một số protein
dạng trần không được glycosyl hóa. Vi rút cúm có genom nhiều đoạn, ở typ A và B
có 8 đoạn ARN(-) với tổng khối lượng 5x106, còn ở typ C có 7 đoạn. Trong virion
có chứa enzyme ARN- polymeraza phụ thuộc ARN, enzyme này cần cho quá trình
phiên mã vì genom ARN chuỗi (-). Protein capsit kết hợp với ARN tạo nucleocapsit
đối xứng xoắn.

Enzym neuraminic (silidaza) phân giải thụ thể ở màng nhầy đường hô hấp bằng
cách cắt liên kết glycozit, giải phóng axit neuraminic. Động tác này cho phép vi rút
đi qua màng nhầy và thoát khỏi các chất ức chế “không đặc hiệu”. Neuraminidaza
phá hủy thụ thể của hemaglutinin trên bề mặt hồng cầu mặc dù tế bào này không
phải là đối tượng gây nhiễm. Neuraminidaza cũng tham gia vào giải phóng vi rút ra
khỏi tế bào.
Vi rút typ A có 16 loại gai H và hầu hết các loại gai này có ở vi rút gây nhiễm
ở động vật (chim, gà, vịt, ngỗng, gà tây, lợn ngựa và một số loại động vật có vú
khác). Ba loại gai H quan trọng có ở vi rút gây bệnh cho người là H1, H2 và H3.
Trước đây có H0 và HW (H lợn), nhưng về sau 2 gai này được coi là H1.
Có 9 loại gai N, trong đó N1 và N2 là quan trọng nhất vì gây bệnh cho
người.

12


Hình 1.2. Hình ảnh vi rút cúm B [1].
Vi rút cúm B với virion dạng hình cầu điển hình với đường kính hạt vi rút
thay đổi từ 80- 120nm. Bên ngoài vỏ bao ngoài hạt vi rút là các gai ngắn dài khoảng
12nm rõ nét bám xung quanh. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo 100nm).

Hình 1.3. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 [1].

13


Hình 1.4. Hình ảnh vi rút cúm A/H1N1 [1].
Vi rút cúm A/H1N1 đa dạng về hình thái (hình cầu- 1.3.; hình que- 1.4.) và
kích thước thay đổi, đường kính hạt vi rút từ 80-120nm, dài đến 1μm. Trên bề mặt
hạt vi rút là các gai ngắn xếp đều đặn. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo 100nm).


thước

thay đổi:

hình cầu,

hình que,

14


đường kính hạt vi rút khoảng 100nm, dài đến 1μm. Các gai ngắn sắp xếp đều trên
bề mặt hạt vi rút với chiều dài của gai khoảng 17nm. Nhuộm PTA 0,25% (thước đo
100nm).
1.3. Cấu trúc hệ gen vi rút cúm và các protein mã hóa
Hệ gen của vi rút cúm A và B có 8 đoạn gen trong khi vi rút cúm C có 7 đoạn
gen ( không có gen NA). Cấu trúc hệ gen của vi rút cúm đã được tìm hiểu nhờ kỹ
thuật phân tích điện di virion ARN vi rút trên gen polyacrylamit. Cấu trúc gen của
vi rút cúm như sau: Đọan gen 1 mã hóa cho PB2, đoạn gen 2 mã hóa cho PB1, đoạn
gen 3 mã hóa cho PA, đoạn 4 cho HA, đoạn 5 cho NP, đoạn 6 cho NA, đoạn 7 cho
M1 và M2, đoạn 8 cho NS1 và NS2. Trình tự nucleotit của ARN vi rút cúm PR8/34
và rất nhiều phân typ khác được công bố từ năm 1982 [28]. Vi rút R8/34 có 13.588
nucleotit.

Bảng 1.1. Các phân đoạn ARN của vi rút cúm và chức năng [26]

Phân
đoạn
ARN

30-60

2

PB1

86 500

2341

757

30-60

3

PA

84 200

2233

716

30-60

15

Chức năng


1778

1565

1413

27 801

7

566

498

454

500

Phân tử có cấu trúc trimer, cắt
bởi enzyme thủy phân thành
HA1 và HA2, là cơ sở cho khả
năng nhiễm trùng. HA gắn với tế
bào túc chủ, dung hợp giải
phóng phức hợp RNP, mở đầu
cho quá trình nhân lên của vi rút.

1000

Là thành phần protein chủ yếu
của phức hợp RNP, chứa một


26 815

230

20-60

121

130200

8

890
NS2

14 216

16

M1: là kháng nguyên đặc hiệu
typ, có chức năng ổn định vrrus,
điều khiển hoạt tính ARNprotease và tham gia vào quá
trình lắp rắp vi rút (70%).
M2: kênh ion.
Là protein không cấu trúc, kết
thúc quá trình tổng hợp protein
của tế bào túc chủ, chỉ có trong
tế bào nhiễm vi rút.


đều liên quan đến sự thay đổi cấu trúc kháng nguyên.
Đoạn ARN 4 có chiều dài 1.742 đến 1.778 nucleotit và mã hóa cho 562 đến
566 axit amin. HA do đoạn ARN 4 mã hóa và được tổng hợp nên ribosom gắn màng
và di chuyển vào lumen của lưới nội chất (ER) tế bào bị nhiễm như là polypeptit
đơn HA0 (trọng lượng phân tử 76.000 dalton). Phụ thuộc vào phân typ vi rút, loại tế
bào chủ và điều kiện nuôi cấy HA tồn tại cả 2 dạng: Dạng tiền thân không phân tách
HA0 hoặc dạng phân tách với hai chuỗi có cầu nối disulfit (HA1 có trọng lượng
47.000 dalton và HA2- 29.000 dalton). Quá trình phân tách là điều kiện quyết định
để vi rút có khả năng lây nhiễm và do vậy liên quan đến độc tính và khả năng lây
truyền [42]. HA chính là đoạn gen đầu tiên của vi rút cúm được xác định trình tự.
HA1 có từ 319 đến 326 axit amin và HA2 có từ 221 đến 222 axit amin. Tùy thuộc
vào các phân typ HA, số lượng các axit amin bị phân tách giữa HA 1 và HA2 là 1 đến
6. HA nguyên vẹn có thể tách chiết từ hạt virion vi rút cúm hoặc từ tế bào bị nhiễm
bằng chất tẩy hòa tan màng, khi chất tẩy bị loại bỏ, vùng transmembrane kỵ nước
kết hợp lại và tạo thành HA hình hoa thị. Tuy nhiên, xử lý vi rút bằng promelin sẽ
giải phóng ra HA bảo toàn tính kháng nguyên và cấu trúc ba chiều, có khả năng hòa
tan trong nước và chứa toàn bộ HA 1 cùng với 175 axit amin đầu tiên trong số 221
axit amin của HA2 [61] . Vị trí gắn thụ thể HA nằm ở vùng ngoại biên của các tiểu
đơn vị phân tử. Cấu trúc vị trí đó có tính đồng dạng cao giữa các phân typ (Tyr- 98,
Tyr – 153, His – 183, Glu – 190, Leu – 194) [41, 63]. Bởi vì tính đặc hiệu gắn thụ
thể khác nhau giữa khí quản người (α 2, 3) và khí quản lợn (α 2, 3 và α 2, 6), số
lượng các phân tử có thể chuyển từ loài này sang loài khác và có thể bị giới hạn
[18]. Sự phân tác HA0 thành HA1 và HA2 là cần thiết để chuyển dạng pH thấp và do
vậy cần thiết đối với hoạt tính gây nhiễm của vi rút. Những HA đó đều chứa chuỗi
R-X-K-/R-R ở cầu nối peptit và được phân tách trong tế bào bằng furin, một
proteaza của mạng trans-Golgi [25, 43]. HA chỉ có arginnine đơn ở cầu nối peptit
không bị phân tách khi nuôi cấy trên tế bào (trừ chủng A/WSN/33) nhưng sẽ bị
phân tách bởi tpypsin ngoại sinh. Khi nuôi cấy trên trứng gà có phôi, HA có

18

vỏ ngoài của vi rút với màng endosom. Điều này thực hiện được nhờ gai H chồi lên

19


khi pH trong endosom thấp. Sau khi dung hợp ribonucleprotein và ARNpolymeraza chui vào tế bào chất. Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN- polymeraza của
vi rút. Phân tử mARN được phiên mã trong nhân từ các chuỗi ARN khuôn đơn, (-)
của vi rút khi sử dụng mồi là đoạn 10 – 13 nucleotit cắt ra tử đầu 5 ’ của mARN có
gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi PolyA cũng lấy từ mARN của tế bào chủ.
Enzym cắt mồi là endonucleaza do vi rút mang theo. Phân tử mARN mới hoàn thiện
của vi rút ra khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành sao chép genom trong nhân.
Kết quả quá trình phiên mã từ 8 đoạn ARN genom (-) tạo ra 10 phân tử
mARN, bởi vì đoạn 7 và 8 mỗi đoạn phiên mã tạo ra 2 phân tử mARN. 6 phân tử (1
– 6) dịch mã cho ra 6 protein, còn 2 phân tử (7 – 8) do có 2 khung đọc nên mỗi
phân tử tạo ra 2 phân tử protein. Điều này được thực hiện không phải do sử dụng
mARN đa gen (polycistronic) thật sự như ở prokaryota, bởi vì riboxom ở eukaryote
chỉ nhận diện bộ ba khởi đầu AUG nằm sát đầu 5’ của mARN.
Như vậy từ 1 ARN đã cho ban đầu, chúng chỉ tạo ra được 1 protein. Hai đoạn
7 và 8 tiến hành phiên mã cho ra 2 mARN có chiều dài đủ. Mỗi trường hợp tổng
hợp một loại protein bổ sung cho dịch mã từ mARN đã được chế biến nhờ bộ máy
cắt ghép (splicing) của tế bào chủ. Giống như các gen chồng lớp, một lần nữa đây là
ví dụ cho thấy các vi rút ARN đã tận dụng tối đa genom nhỏ bé của mình như thế
nào.
Khác với đa số vi rút ARN, protein cấu trúc sau khi được tổng hợp lại được
chuyển vào nhân và quá trình lắp rắp ribonucleoprotein xảy ra trong nhân. Các
glycoprotein HA và NA được tổng hợp trên mạng lưới nội chất hạt sau đó được di
chuyển tới các vùng chuyên biệt trên màng sinh chất. Protein M cũng di chuyển đến
màng và liên kết với màng nhờ gai HA và NA. Ribonucleoprotein và ARNpolymeraza cũng từ nhân di chuyển ra tế bào chất rồi tới màng sinh chất, nơi đã có
protein M và các gai HA, NA. Virion ra khỏi tế bào chất theo lối nảy chồi với sự
tham gia của neuraminidaza. Nếu enzyme này bị ức chế thì virion không được giải

nhân lên thành vi rút mới [13]
1.5. Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào
Vi rút cúm đầu tiên được nuôi trên trứng gà có phôi. Sau này, các vi rút cúm
có thể được nuôi trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên
phát. Việc nuôi cấy vi rút trên trứng gà có phôi vẫn được lựa chọn làm quy trình sản
xuất vắcxin cúm trên thế giới. Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào như thận khỉ tiên
phát (PMKC) hay thận chó Madin- Darby (MDCK) thường được dùng để phân lập
vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người. Tế bào MDCK có độ nhạy 100% trong
phân lập vi rút cúm A trong khi đó độ nhạy của Vero chỉ 71,4% và MRC-5 là
57,1%.
Sự phát triển của vi rút trên nuôi cấy tế bào và tạo các đám hoại tử trong một
số dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận bê, thận chuột đồng, thận gà.
Ngoài ra nếu sử dụng các dòng tế bào thường trực thì trypsin phải được bổ sung để
hoạt hóa các phân tử protein HA trong quá trình xâm nhập vào tế bào chủ của vi rút.
1.6. Kỹ thuật di truyền ngược
Giống như hầu hết các loại vi rút ARN sợi (-), vi rút cúm nhân lên trong nhân
của tế bào bị nhiễm. Sau khi dung hợp với màng tế bào, phức hợp của

22


ribonucleoprotein của vi rút (vRNP) được phóng thích vào tế bào chất. Phức hợp
vRNP, bao gồm ARN của vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) và 3 loại protein
polymeraza (PA, PB1, PB2), được chuyển vào nhân và quá trình phiên mã tái bản
diễn ra tại đây, vARN sợi (-) không thể trực tiếp làm khuôn tổng hợp protein mà
vARN được bao bọc trong NP phải được phiên mã thành mARN nhờ phức hợp
polymeraza của vi rút. Trong quá trình tái bản vARN được sử dụng làm khuôn để
tổng hợp sợi ARN bổ sung (cARN), sợi cARN này lại được làm khuôn để tổng hợp
sợi vARN. Như vậy, đơn vị chức năng tối thiểu để vi rút cúm có thể tái bản là
vRNP.

của vi rút, 9 plasmit biểu hiện tổng hợp 9 loại protein). Sau đó hệ thống này được
cải tiến, rút số plasmid phải sử dụng xuống 12.
Năm 2000, Hofmann và cộng sự đã cải biến hệ thống ARN polymeraza I
thành hệ thống ARN polymeraza I/II. Đoạn cDAN được cài đặt giữa trình tự
promoter ARN polymeraza II (cytomegalovi rút early promoter) và trình tự poly
(A). Do đó, quá trình phiên mã bằng ARN polymeraza I tạo ra ARN sợi âm của vi
rút, còn quá trình phiên mã bởi ARN polymeraza II tạo ra sợi mARN. Như vậy cả
vARN và mARN được tổng hợp cùng từ một khuôn, kết quả đã làm giảm số lượng
plasmid cần dùng từ 12 xuống 8. Vì vậy, hệ thống này có thể sử dụng cho nhiều
dòng tế bào hơn. Đến năm 2005, Neumann và cộng sự đã thiết lập được một hệ
thống di truyền ngược mới chỉ sử dụng từ 3 đến 4 plasmit. Đây là hệ thống mà rất
nhiều cấu trúc phiên mã bởi ARN polymeraza I được kết hợp lại với nhau trong
cùng một plasmid, cũng như các cấu trúc phiên mã bởi ARN polymeraza II được
kết hợp vào một plasmid khác.
Sự thành công của hệ thống các plasmid mang nhiều trình tự AND mã hóa
cho nhiều ARN, đã gợi ý rằng có tạo ra một hệ thống di truyền ngược mới chỉ có
một plasmid bằng cách kết hợp hệ thống trên và hệ thống ARN polymeraza I/II. Khi
đó, plasmid duy nhất được thiết kế gồm 4 đơn vị phiên mã ARN polymeraza I/II
cho các cDNA mã hóa PA, PB1, PB2, NP; 4 đơn vị phiên mã ARN polymeraza I
cho 4 cDNA mã hóa cho HA, NA, M, NS.
Trong những năm gần đây kỹ thuật di truyền ngược đã được áp dụng để tạo
ra các chủng vi rút cúm có sự sắp xếp lại các đoạn gen và có khả năng nhân lên rất
mạnh. Tùy từng trường hợp, các chủng vi rút cúm có tỷ lệ sắp xếp lại gen theo tỷ lệ

24


6:2 đã được tạo ra. Trong đó các đoạn gen HA và NA của nhiều chủng vi rút cúm
hoang dại khác nhau (bao gồm các chủng cúm người và gia cầm như A/H1N1,
A/H3N2, A/H5N1 và H5N3) còn 6 đoạn còn lại là của chủng PR8 [32, 46, 65]. Quy