Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ là ô nhiễm môi trường và nảy
sinh những vấn đề khác, ví dụ như các căn bệnh nguy hiểm (ung thư, kháng sinh, cúm
H1N1, H7N9,...). Nguyên nhân của các căn bệnh trên đến từ nhiều nguồn khác nhau,
có thể do ô nhiễm môi trường, do kháng sinh. Trước tình trạng đó, nhiều quốc gia trên
thế giới đã tiến hành các chương trình nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất từ thiên
nhiên, với hy vọng các dược phẩm mới có nguồn gốc thực - động vật sẽ giúp giảm
thiểu các căn bệnh nguy hiểm nêu trên, tăng cường công tác chăm sóc sức khỏe và
kéo dài tuổi thọ con người. Những nghiên cứu tìm kiếm các họp chất có hoạt tính sinh
học cao để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác trong đời sống
con người đã và đang trở thành những nhiệm vụ quan trọng của các quốc gia trên thế
giới.
Là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa tương đối lớn,
độ ẩm cao (khoảng trên 80%), nhiệt độ trung bình khoảng từ 15 - 27°c, Việt Nam có
điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài
động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng tới
sự phát triển của nền y học cổ truyền của Việt Nam.
Trong số các loài thực vật của Việt Nam, các loài thực vật thuộc họ Thầu dầu
hiện đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Ví dụ như: cây Me rừng
ịPhyỉỉanthus embỉica), thuộc họ Thầu dầu, là một loài cây đã được sử dụng làm thuốc
chữa bệnh từ lâu trong y học dân gian như chữa huyết áp cao, viêm ruột, viêm da, đau
họng, đau răng, rắn cắn,... Tuy nhiên, để có được cơ sở khoa học nhằm phát triển và
ứng dụng cụ thể loài cây này, cần có những nghiên cứu cụ thể về hóa học, hoạt tính
sinh học và những nghiên cứu sâu hon về duợc lý để giải thích tác dụng trong y học
cổ truyền của loài cây này, qua đó tạo cơ sở để tìm kiếm phuơng thuốc điều trị bệnh.
Xuất phát từ ý nghĩa thục tiễn trên tôi chọn đề tài cho khoá luận tốt nghiệp là:


tính cùng gốc.

Hình 1.1. Mẩu lá, quả và tiêu bản cây me rừng
Hoa nhỏ mọc thành xim co ở nách lá phía dưới cành, gồm nhiều hoa đực và 12 hoa cái. Hoa đực có cuống ngắn; đài gồm 6 mảnh màu hồng hoặc xanh nhạt, hình
bầu dục. Hoa cái gần như không cuống; đài có 6 thuỳ tương tự hoa đực. Quả hình cầu,
kích thước 13-25 X 20-30 mm, mọng nước, màu vàng xanh; khi khô thành quả nang,
tự mở. Hạt dạng 3 cạnh, màu hồng nhạt hay nâu nhạt [1, 2, 4, 5].

1.1.2.

Phân bố sinh thái
Cây mọc phổ biến khắp nơi ở Việt Nam, nhất là ở các tỉnh miền núi và trung


du phía bắc [1, 2, 4, 5].
Me rừng là loài có vùng phân bố rộng ở nhiều nước châu Á, từ Ấn Độ đến
Myanmar, Nepal, Thái Lan, Malaysia, Lào, Campuchia, miền nam Trung Quốc. Hiện
me rừng đã được đưa vào trồng tại Nhật Bản, Hoa Kỳ và Australia.

1.1.3.

Công dụng
Nhiều bộ phận của loài Me rừng (p. emblỉca L.) có hoạt tính kháng khuẩn,

kháng oxy hóa, chống suy giảm miễn dịch, kháng độc và bảo vệ tế bào gan do các
kim loại màu gây ra [1, 2, 4, 5],...
Trong y học dân gian, lá được dùng chữa phù thũng, viêm da, mẩn ngứa. Hạt
dùng chữa hen, viêm cuống phổi và thiểu năng mật. Rễ dùng để chữa huyết áp cao,
đau thượng vị, viêm ruột và lao hạch bạch huyết [5],...
Quả thường dùng ăn tươi, làm ô mai, nước hoa quả, giải khát, hầm thịt, làm

và kìm hãm sự phát triển của virut HIV [5],...
Lá là nguồn nguyên liệu giàu ílavonoid, tannin và sterol. Từ lá có thể tách
chiết được các hoạt chất ellagic acid, amlaic acid, kaempferol-3- glucoside,
kaempíerol, lupeol, a-amyrin acetat, các phytosterol C29 như P- sitosterol,
poriíerasterol, P-sitosterol-3-O-D-glucopyranosid [5],...
Vỏ cây chứa P-sitoserol,(+)-leucodelphinidin (3,75%), lupeol (2,25%) và
tannin. Thành phần chủ yếu trong tannin gồm phyllembin, gallotannin như 1,2,3trigalloyglucose, ellagitannin terchebin, corilagin, chebulagic acid, chebulinic acid.
Hạt chứa khoảng 16% dầu béo, chủ yếu là các linoleic acid (44%), oleic acid (28,4%),
linolenic acid, stearic acid, palmatic và myristic acid [5].


r
r
r
Dưới đây là ví dụ vê câu trúc một sô họp chât từ cây me rừng:
□H

Keamfero

□

Quercetin

Emblicanin A

Emblicanin B Hình 1.2.
Cấu trúc một

) họp chất từ cây me rừng



Flavanonol-3

Flavon
(Hình 1.4)
và của
ílavonol
rất 1.4.
phổ Khung
biến trong
tự nhiên.
Hình
1.3. Khung
cơ bản
các (Hình 1.5)
Hình
cơ bản
của cácCông
thức cấu tạo của chúng
ílavanchỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3.

ílavon

Trong thực vật, các ílavon và ílavonol thường không tồn tại dưới dạng tự do
mà thường dưới dạng glycozit.
Bên cạnh các họp chất có dạng khung ílavan, ílavon, ílavonol còn có các họp


chất thuộc dạng Flavanonol-3 (Hình 1.6) và một số họp chất thuộc khung Chalcon
(Hình 1.7), khung auron (Hình 1.8).

hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá


trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể
làm bẩn dịch chiết của cây. Chloroform, metylen clorit và methanol là những dung
môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân,
rễ, củ, quả, hoa,...
Những tạp chất của chloroform như CH2CI2, CtbClBr có thể phản ứng với
một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tương tự
như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HC1) cũng có thể gây ra sự phân
huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác. Chloroform có thể gây
tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo,
cẩn thận ở nơi thoáng và phải đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ
bay hơi hơn chloroform.
Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế
clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế
bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần
trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của chloroform thấp hơn, nó có thể rửa giải
các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực
cùng với các họp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các
chất này cũng bị hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những
đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol
trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ Trechonaetes aciniata
được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain
cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay
vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Đietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay
hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ, peroxit

quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử
dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy
thích họp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng
nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng
kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp
chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi
chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần
dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc
quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ:


-

Khi chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo
thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân: Đragendroff và tác nhân
Mayer.

-

Các ílavoloit thường là những hợp chất màu, vì vậy khi dịch chiết chảy ra mà không
có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi
cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.


Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lóp chất mà ta
có thể tách thô một số lóp chất ngay trong quá trình chiết.


suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
n
1+b.c


Trong đó:

n - Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n«, - Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp
phụ nào đó. b - Hằng số.
c - Nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.4.3.

Phân loại các phương pháp sắc ký
Trong phương pháp sắc ký pha động là các lưu thể (các chất ở trạng thái khí

hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng
thái tập họp của pha động, người ta chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí và sắc
ký lỏng. Dựa vào cách tiến hành sắc ký, người ta chia ra thành các phương pháp sắc
ký chủ yếu sau:

1.4.3.

L Sắc ký cột (C.C)
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các

loại silicagel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS,
Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại,
phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản

-

Phương pháp 2: Nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy
cột trước với lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần
thiết.
Lun ý: không được để bọt khí bên trong cột (nếu có bọt khí gây nên hiện
tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), cột không được nứt, gẫy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ
dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì
sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.

1.4.3.2.

sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lóp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng

cho sắc ký cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silicagel trên đế nhôm
hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc
sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silicagel dày hơn), có thể đưa lượng
chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc ký, người ta có thể cạo riêng phần silicagel


có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích họp để thu được từng chất
riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu
đặc trưng cho từng lóp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.

1.5.

Một số phương pháp hoá lỷ xác định cấu trúc của các họp chất hữu cơ [5-



-

Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization mass spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh


ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.

-

Phổ ESI-MS (Electron Spray Ionization mass spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện
tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS,
do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các
liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.

-

Phổ FAB (Fast Atom Bombing mass spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh
với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu
được pic ion phân tử.

-

Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác
định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký kết
hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc ký khí-khối phổ), LC-MS (sắc ký lỏng-khối
phổ). Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần
của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược).


một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C-NMR là
ppm, với dải thang đo rộng 0 - 230ppm.

1.5.3.3.

PhoDEPT (Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

Phổ này cho ta các tín hiệu phân loại các loại cacbon khác nhau. Trên
phổ DEPT, tín hiệu của các cacbon bậc bốn biến mất. Tín hiệu của CH và CH3 nằm
về một phía và của CH2 về một phía trên phổ DEPT 135°. Trên phổ DEPT 90° chỉ
xuất hiện tín hiệu phổ của các CH.

1.5.3.4.
-

Phổ 2D-NMR

Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence)’. Các tương tác trực tiếp
H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này. Trên phổ, một trục là phổ !HNMR, còn trục kia là 13C-NMR. Các tương tác HMQC nằm trên đỉnh các ô vuông
trên phổ.

-

Phổ COSY (HOMOCOSY)

Chemical Shift Correlation

Spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác xa của H-H, chủ yếu là các proton
đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại
với nhau.

thường phải sử dụng phương pháp thuỷ phân rồi xác định bằng phương pháp so sánh
LC-MS hoặc GC-MS với các đường chuẩn dự kiến.


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1.

Mẩu thưc vât
••
Mầu cây Me rừng thu thập tại Mê Linh - Vĩnh Phúc. Người thu thập và định

loài: TS Nguyễn Thế Cường, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định. Tiêu bản mẫu (VNB_21) được lưu tại
Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hình ảnh mẫu
và tiêu bản (Hình 1.1).

2.2.
2.2.1.

Phương pháp phân lập các họp chất
sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lóp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60F254 (Merck 1,05715), RPi8 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở
hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%
được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện đến khi hiện màu.

2.2.2.



được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.3.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): !H-NMR (500 MHz) và 13C- NMR (125

MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.4.

Độ quay cực [a]D
Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện

Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.4.

Dung cu và thiết bi

2.4.1.

Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng

bao gồm:
+ Bình chiết 30 lít

+ Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck).
+ Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
+ Các loại dung môi hữu cơ như methanol, etanol, ethyl acetate, chloroform,
hexane, acetone,... là loại hoá chất tinh khiết của Merck.


CHƯƠNG 3. THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1.

Chiết và phân lập các họp chất
Mầu lá của cây me rừng, được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, sau đó sấy

khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 50°c, sau cùng đem nghiền nhỏ thành bột thu được 7 kg
bột khô.
Phần lá khô của Phyllanthus emblỉca (7 kg) được đem nghiền nhỏ sau đó đem
chiết với MeOH 3 lần. Phần dịch chiết được quay khô với áp suất giảm để tạo thành
cặn chiết MeOH (430 g). Cặn MeOH được hòa vào nước và phân lóp lần lượt với
Hexan và EtOAc để thu được các dịch chiết rồi quay khô thu được cặn chiết Hexan
(124 g) và EtOAc (186 g).


Hình 3.1. Sơ đồ tạo dịch chiết phân đoạn
Do thời gian thực nghiệm có hạn, nội dung nghiên cứu của khóa luận chỉ dừng
lại trong phân lập phần dịch chiết EtOAc, các phân đoạn khác đang đuợc tiến hành tại
đơn vị nghiên cứu.


Từ phần cặn chiết EtOAc tiến hành sử dụng sắc ký cột thủy tinh với dung môi
rửa giải là CHCI3 : MeOH (chạy gradient với tỷ lệ dung môi từ 100% CHCI3 đến