Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ là ô nhiễm môi trường
và nảy sinh những vấn đề khác, ví dụ như các căn bệnh nguy hiểm (ung thư,
kháng sinh, cúm H1N1, H7N9,…). Nguyên nhân của các căn bệnh trên đến
từ nhiều nguồn khác nhau, có thể do ô nhiễm môi trường, do kháng sinh.
Trước tình trạng đó, nhiều quốc gia trên thế giới đã tiến hành các chương
trình nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất từ thiên nhiên, với hy vọng các dược
phẩm mới có nguồn gốc thực - động vật sẽ giúp giảm thiểu các căn bệnh nguy
hiểm nêu trên, tăng cường công tác chăm sóc sức khỏe và kéo dài tuổi thọ con
người. Những nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao để
ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác trong đời sống con
người đã và đang trở thành những nhiệm vụ quan trọng của các quốc gia trên
thế giới.
Là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa tương
đối lớn, độ ẩm cao (khoảng trên 80%), nhiệt độ trung bình khoảng từ 15 270C, Việt Nam có điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự
phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Điều
này có ý nghĩa rất quan trọng tới sự phát triển của nền y học cổ truyền của
Việt Nam.
Trong số các loài thực vật của Việt Nam, các loài thực vật thuộc họ
Thầu dầu hiện đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Ví dụ như:
cây Me rừng (Phyllanthus emblica), thuộc họ Thầu dầu, là một loài cây đã
được sử dụng làm thuốc chữa bệnh từ lâu trong y học dân gian như chữa
huyết áp cao, viêm ruột, viêm da, đau họng, đau răng, rắn cắn,... Tuy nhiên,
để có được cơ sở khoa học nhằm phát triển và ứng dụng cụ thể loài cây này,
cần có những nghiên cứu cụ thể về hóa học, hoạt tính sinh học và những
Chu Kim Ngân




CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu chung về cây Me rừng
1.1.1. Thực vật học cây me rừng
Cây Me rừng (Hình 1.1) hay còn được gọi là chùm ruột núi, chùm ruột
rừng, bông ngót, cam tú, ngưu cam tú, du cam tú, mắc kham. Cây có tên khoa
học là Phyllanthus emblica. Đây là cây gỗ nhỏ hoặc bụi, cao 3-8(-10) m, vỏ
mỏng, màu nâu nhạt, nâu hoặc màu xám, nhẵn. Thân thường cong queo, phân
cành nhiều, cành nhỏ mềm, cành già màu xám nhạt, mang các nhánh nhỏ, có
lông. Cành mang lá mảnh, màu xanh nhạt. Cành mang lá và lá cùng sắp xếp
gần như trên một mặt phẳng. Phiến lá hình bầu dục khuôn, hai đầu tù, kích
thước (3-)12-20 x (1-)3,5 - 5 mm, nhẵn; gần như không cuống hoặc rất ngắn.
Lá kèm rất nhỏ, hình tam giác, màu đỏ nâu. Hoa đơn tính cùng gốc.

Hình 1.1. Mẫu lá, quả và tiêu bản cây me rừng

Hoa nhỏ mọc thành xim co ở nách lá phía dưới cành, gồm nhiều hoa
đực và 1-2 hoa cái. Hoa đực có cuống ngắn; đài gồm 6 mảnh màu hồng hoặc
xanh nhạt, hình bầu dục. Hoa cái gần như không cuống; đài có 6 thuỳ tương
tự hoa đực. Quả hình cầu, kích thước 13-25 x 20-30 mm, mọng nước, màu
vàng xanh; khi khô thành quả nang, tự mở. Hạt dạng 3 cạnh, màu hồng nhạt
hay nâu nhạt [1, 2, 4, 5].



1.1.2. Phân bố sinh thái
Cây mọc phổ biến khắp nơi ở Việt Nam, nhất là ở các tỉnh miền núi và
trung du phía bắc [1, 2, 4, 5].
Me rừng là loài có vùng phân bố rộng ở nhiều nước châu Á, từ Ấn Độ

phyllemblic acid và emblicol. Các nghiên cứu gần đây cho biết cả vitamin C
và acid gallic cùng có đặc tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn. Hoạt
tính ức chế các quá trình oxy hóa có thể còn do tác dụng của các tannin,
emblicanin A, emblicanin B, punigluconin và pedunculagin ở trong quả me
rừng [5].
Phyllemblin được coi là hoạt chất có tác dụng tương tự như adrenalin,
gây giảm đau, an thần, đặc biệt là với hệ thần kinh trung ương [5],…
Những acid hữu cơ trong quả me rừng như: acid aspartic, ellagic,
gallic, myristic, ascorbic, các alanine, glycine, histidine, methionine, niacin,
tyrosine cùng với một số hợp chất tannin được coi là có tác dụng phòng chống
một số dạng ung thư và kìm hãm sự phát triển của virut HIV [5],…
Lá là nguồn nguyên liệu giàu flavonoid, tannin và sterol. Từ lá có thể
tách chiết được các hoạt chất ellagic acid, amlaic acid, kaempferol-3glucoside, kaempferol, lupeol, α-amyrin acetat, các phytosterol C29 như βsitosterol, poriferasterol, β-sitosterol-3-O-D-glucopyranosid [5],...
Vỏ cây chứa β-sitoserol,(+)-leucodelphinidin (3,75%), lupeol (2,25%)
và tannin. Thành phần chủ yếu trong tannin gồm phyllembin, gallotannin như
1,2,3-trigalloyglucose, ellagitannin terchebin, corilagin, chebulagic acid,
chebulinic acid. Hạt chứa khoảng 16% dầu béo, chủ yếu là các linoleic acid
(44%), oleic acid (28,4%), linolenic acid, stearic acid, palmatic và myristic
acid [5].



Dưới đây là ví dụ về cấu trúc một số hợp chất từ cây me rừng:
OH

O

OH

OH


OH

OH

OH

O

O

O

O

OH

O

OH

O
O

OH

OH

O


OH

O

O

O
OH

O

O
OH
OH

O
OH

O

O
O

OH

O

O
O





1.2. Giới thiệu về lớp chất flavonoit [10-14]
Flavonoit là một trong những nhóm hợp chất phân bố rộng rãi nhất
trong tự nhiên. Cho đến nay có hơn 4000 Flavonoit được tìm thấy từ thực vật.
Ban đầu chúng được phát hiện với vai trò là các sắc tố của thực vật vào
mùa thu khi các loài hoa, lá cây dần chuyển sang màu vàng, da cam, đỏ. Các
Flavonoit cũng được tìm thấy trong rau, quả, quả hạch, hạt, cỏ, gia vị, thân
cây, các loại hoa cũng như trong chè và rượu vang đỏ. Flavonoit có mặt trong
hầu hết các bộ phận của cây như lá, hoa, quả, phấn, rễ,… và cư trú ở thành tế
bào. Nó tham gia vào sự tạo thành màu sắc của cây đặc biệt là hoa (tạo cho
hoa những màu sắc rực rỡ để quyến rũ các loại côn trùng giúp cho sự thụ
phấn của cây).
Các flavonoit là lớp chất phổ biến có trong thực vật. Chúng là hợp chất
có cấu tạo gồm 2 vòng benzen A, B được nối với nhau bởi một dị vòng C với
bộ khung cacbon C6-C3-C6. Việc phân loại các flavonoit dựa trên sự khác
nhau của nhóm C3 (các glicosit của nó có màu vàng nhạt và màu ngà;
antoxianin và antoxianiđrin màu đỏ, xanh, tía và các dạng không màu;
isoflavon, catecin và leucoantoxianiđrin là các chất tan trong nước và thường
nằm trong không bào).

A

1' 2'

8

O



O

Hình 1.3. Khung cơ bản của các

Hình 1.4. Khung cơ bản của các

flavan

flavon



OR

O

O
OH

RO

RO
OH

OH
O

O


OR
CH

B

O

Hình 1.7. Khung cơ bản của các

Hình 1.8. Khung cơ bản của các hợp

hợp chất chalcon

chất Auron

1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất
có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân
cực trung bình,...) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.3.1. Chọn dung môi chiết


Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung
môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.


Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá
thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng
với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy.

việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng và phải
đeo mặt nạ phòng độc. Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn
chloroform.
Methanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của



chloroform thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol
hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân
cực trung bình và thấp. Vì vậy khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị
hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính
tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ
Trechonaetes aciniata được chuyển thành trechonolide B bằng quá trình phân
huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense
được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà
thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Đietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với những hợp chất
không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoit. Tiếp đến là axeton
cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.
Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình
phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit - bazơ có thể
tạo thành những sản phẩm mong muốn.

bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân:
Đragendroff và tác nhân Mayer.
- Các flavoloit thường là những hợp chất màu, vì vậy khi dịch chiết chảy ra
mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung
môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý nhằm đạt hiệu quả cao.


Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phương pháp sắc ký trong phân lập các hợp chất hữu cơ
Phương pháp sắc ký (chromatography) là một phương pháp phổ biến và
hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp
chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp tách các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất
hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha tĩnh và pha
động.
Sắc ký gồm có pha tĩnh và pha động. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu
tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất
của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,...). Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác
nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc
theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá
trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh
sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu
hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá
trình sắc ký.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc ký
Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
hai pha tĩnh và pha động. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự

tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên nếu chất hấp phụ có kích thước hạt
càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong một số trường hợp nếu lực trọng
trường không đủ lớn thì gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy
được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC), áp
suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất
quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu
cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa
quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là