ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ KIM DUNG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
CHẤT LƯỢNG KHÁNG NGUYÊN TRONG QUY TRÌNH
SẢN XUẤT VẮCXIN CÚM

Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC
Mã số: 60420107

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội – Năm 2015


Công trình được hoàn thành tại:
Công ty TNHH MTV Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) – Bộ Y Tế

Người hướng dẫn khoa học: TS.

Đỗ Tuấn Đạt

PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà

Phản biện 1: PGS. TS. Nguyễn Vân Trang
Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Thị Vân Anh

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại: Khoa

kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
-

Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình

sản xuất vắcxin cúm..
3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
Trong nhiều thập kỷ qua, bên cạnh virus cúm mùa, thế giới liên tục phải trải
qua những đại dịch cúm với các chủng khác nhau, A/H5N1, A/H7N9, A/H1N1 đại
dịch. Sản xuất virus cúm vừa phải tuân thủ các quy định nghiêm ngặt về chất lượng
vắc xin, vừa phải đối diện với việc thay thế chủng hàng năm cũng như các chủng
mới gây đại dịch. Việc xây dựng quy trình và tiêu chuẩn đánh giá chất lượng vắc
xin chung cho các vắc xin cúm và riêng cho một số vắc xin phòng các chủng cúm
gây đại dịch là rất quan trọng, nhằm đảm bảo chất lượng, tính an toàn và tính kháng
1


nguyên của vắc xin. Những đánh giá này có thể là cơ sở để áp dụng cho các vắc xin
cúm mới khác, nhằm nhanh chóng đưa vắc xin mới vào thử nghiệm và sử dụng5.
KẾT CẤU LUẬN VĂN
Luận văn ngoài phần mở đầu, danh mục các hình, danh mục các bảng, bảng
ký hiệu các chữ viết tắt, kết luận, tài liệu tham khảo, phụ lục còn có 3 chương sau:
Chương 1. Tổng quan
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận

2


PHẦN NỘI DUNG

PR8/34 và rất nhiều phân typ khác được công bố từ năm 1982. Vi rút R8/34 có
13.588 nucleotit.
3


1.4. Quá trình nhân lên của vi rút cúm
Trước hết gai H của vi rút gắn vào thụ thể có chứa axit neuraminic của tế bào
chủ, rồi tiến hành nhập bào tạo endosom. Tiếp đó, xảy ra quá trình dung hợp giữa
vỏ ngoài của vi rút với màng endosom. Điều này thực hiện được nhờ gai H chồi lên
khi pH trong endosom thấp. Sau khi dung hợp ribonucleprotein và ARNpolymeraza chui vào tế bào chất. Việc “cởi áo” làm hoạt hóa ARN- polymeraza của
vi rút. Phân tử mARN được phiên mã trong nhân từ các chuỗi ARN khuôn đơn, (-)
của vi rút khi sử dụng mồi là đoạn 10 – 13 nucleotit cắt ra tử đầu 5’ của mARN có
gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi PolyA cũng lấy từ mARN của tế bào chủ.
Enzym cắt mồi là endonucleaza do vi rút mang theo. Phân tử mARN mới hoàn thiện
của vi rút ra khỏi nhân, vào tế bào chất để tiến hành sao chép genom trong nhân.
1.5. Sự phát triển của vi rút cúm trên tế bào
Vi rút cúm đầu tiên được nuôi trên trứng gà có phôi. Sau này, các vi rút cúm
có thể được nuôi trên trứng gà có phôi hoặc trong một số hệ nuôi cấy tế bào tiên
phát. Việc nuôi cấy vi rút trên trứng gà có phôi vẫn được lựa chọn làm quy trình sản
xuất vắcxin cúm trên thế giới. Hiện nay, các hệ nuôi cấy tế bào như thận khỉ tiên
phát (PMKC) hay thận chó Madin- Darby (MDCK) thường được dùng để phân lập
vi rút cúm từ mẫu bệnh phẩm của người. Tế bào MDCK có độ nhạy 100% trong
phân lập vi rút cúm A trong khi đó độ nhạy của Vero chỉ 71,4% và MRC-5 là
57,1%.
1.6. Kỹ thuật di truyền ngược
Giống như hầu hết các loại vi rút ARN sợi (-), vi rút cúm nhân lên trong
nhân của tế bào bị nhiễm. Sau khi dung hợp với màng tế bào, phức hợp của
ribonucleoprotein của vi rút (vRNP) được phóng thích vào tế bào chất. Phức hợp
vRNP, bao gồm ARN của vi rút (vARN), nucleoprotein (NP) và 3 loại protein
polymeraza (PA, PB1, PB2), được chuyển vào nhân và quá trình phiên mã tái bản

1.9. Vắcxin cúm
Vi rút là tác nhân gây bệnh cúm. Miễn dịch ngừa cúm là phương pháp căn
bản để kiểm soát cúm ở mức độ cá nhân và cộng đồng. Vắcxin cúm được phát triển
và được cấp phép sử dụng ở người dưới dạng vi rút sống giảm độc lực và vi rút bất
hoạt. Các phương pháp chủng ngừa cúm có chung mục tiêu là kích thích miễn dịch
đối với hemagglutinin (HA) và có thể đối với neuraminidase (NA), do đó thành
phần của vắcxin cúm thường xuyên được thay đổi sao cho tương thích nhất với
5


chủng vi rút đang lưu hành đã được tiên lượng trước. Vai trò kích thích các đáp ứng
miễn dịch khác của vắcxin trong phòng ngừa bệnh vẫn chưa được hiểu biết một
cách đầy đủ. Vắcxin cúm an toàn, hiệu quả, và được TCYTTG khuyến cáo sử dụng
cho phụ nữ có thai, trẻ từ 6 đến 59 tháng tuổi, người già, người đang mắc bệnh “đặc
biệt”, và cán bộ y tế.
Việt Nam đã có nhiều cách tiếp cận khác nhau trong nghiên cứu sản xuất
vắcxin cúm như tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH), trên trứng gà có phôi
(IVAC), trên tế bào Vero (Viện Pasteur TP. HCM), trong đó VABIOTECH đã hoàn
thành 3 đợt thử nghiệm lâm sàng và kết quả cho thấy vắcxin cúm A/H5N1 do
VABIOTECH sản xuất là an toàn trên người tình nguyện. Các chỉ số sinh hóa học ở
những người tình nguyện sau tiêm vắcxin là bình thường. Vắcxin A/H5N1 sản xuất
trên dây truyền công nghệ đã nghiên cứu cho kết quả đáp ứng tốt ở tất cả các đối
tượng được tiêm từ liều 7,5µg trở lên và đáp ứng tiêu chuẩn của châu Âu. Từ những
kinh nghiệm có sẵn trong sản xuất vắcxin cúm A/H5N1 VABIOTECH cũng đã xây
dựng được một quy trình công nghệ sản xuất vắcxin cúm A/H1N1 có tính ổn định
và hiệu suất cao. Người Việt Nam sẽ được sử dụng vắcxin cúm do Việt Nam sản
xuất trong một ngày không xa.
1.10. Một số dạng vắcxin cúm
Hiện nay có nhiều cách tiếp cận công nghệ khác nhau để sản xuất vắcxin
cúm và cũng có nhiều loại vắcxin cúm khác nhau tùy thuộc vào các phương pháp và

- Từng mẻ gặt đơn chứa vi rút cần được chuẩn độ hiệu vi rút cúm
- Nhận dạng: Xác định các kháng nguyên đặc hiệu bằng phản ứng khuyếch tán miễn
dịch hoặc ứng chế ngưng kết hồng cầu sử dụng các kháng thể đặc hiệu.
- Xác định hàm lượng kháng nguyên HA:
- Thử nghiệm về các nguyên liệu tồn dư: các nhà sản xuất phải chứng minh các
nguyên liệu tồn dư khác sử dụng trong sản xuất phải giảm qua quá trình tinh chế
bằng phương pháp chạy SDS-PAGE nhưng vấn phải giữ nguyên đặc tính kháng
nguyên bằng phương pháp kính hiển vi điện tử.
- Hàm lượng Protein tổng số được xác định bằng phương pháp Lorry.
Kiểm tra chất lượng kháng nguyên vắcxin thành phẩm
- Thử nghiệm nhận dạng: Thử nghiệm nhận dạng được thực hiện với ít nhất 1 lọ cho
mỗi loạt vắcxin.
- Hàm lượng kháng nguyên HA.
- Thử nghiệm an toàn chung
- Thử nghiệm chất gây sốt
- Thử nghiệm công hiệu.

7


CHƯƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Tế bào
Tế bào thận chó thường trực (Madin- Darby Canine Kidney): MDCK
(London – Anh)
2.1.2. Mẫu thử nghiệm
Mẫu nước nổi sau gặt vi rút trong quy trình sản xuất vắc xin cúm.
Mẫu bán thành phẩm trong quy trình sản xuất vắc xin cúm.
2.1.3. Môi trường và hóa chất và các trang thiết bị
Các môi trường, hóa chất và trang thiết bị cần thiết



3.1.2. Kết quả kiểm tra chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất
vắcxin cúm
Chúng tôi đã nghiên cứu và áp dụng các phương pháp kiểm tra chất lượng
kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm cho 9 loạt vắcxin cúm A/H5N1
và 10 loạt vắcxin cúm A/H1N1.
Bảng 3.4. Kết quả kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm A/H5N1
CCID50

HA

SRID

Protein

(CCID50/ml)

(HAU)

(µg/ml)

(µg/ml)

Loạt 0112

107,5

1024


228,0

388,27

Loạt 0512

108,6

512

169,3

373,04

Loạt 0113

107,9

512

169,0

304,61

Loạt 0213

108,0

1024



SRID

Protein

(CCID50/ml)

(HAU)

(µg/ml)

(µg/ml)

Loạt 0113

107,5

256

132,2

498,1

Loạt 0213

108,2

512

159,1


480,6

Loạt 0214

108,6

512

145,6

563,4

Loạt 0314

108,4

512

142,5

556,2

Loạt 0414

108,6

512

140,8

phẩm chỉ còn các băng protein của vi rút cúm.
Đồng thời, với các phương pháp thông dụng hiện vẫn được áp dụng trong
việc đánh giá chất lượng của kháng nguyên, trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng
đã tiến hành kỹ thuật huỳnh quang điện tử để quan sát hình ảnh các kháng nguyên
vi rút cúm. Phương pháp này được tiến hành trên các mẫu nuôi cấy vi rút cúm trên
tế bào để quan sát quá trình nhân lên của vi rút cúm Các vi rút cúm A/H1N1 được
tổng hợp đã nẩy chồi ra khỏi màng tế bào MDCK, tế bào hoàn toàn bị teo lại, quan
sát thấy rất nhiều hạt vi rút hoàn chỉnh giải phóng ra bên ngoài tế bào. Mẫu bán
thành phẩm vắcxin cúm sau khi tinh chế để thấy được tính toàn vẹn của hạt vi rút
cúm với các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu của vi rút.
3.2. Xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất lượng kháng nguyên trong quy trình
sản xuất vắcxin cúm.
Chúng tôi đã phân tích dữ liệu dựa trên kết quả của 9 loạt vắcxin đại dịch
cúm A/H5N1 và 10 loạt vắcxin cúm mùa A/H1N1 để xây dựng tiêu chuẩn đáng giá
chất lượng kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắc xin cúm nhằm đảm bảo chất
lượng mà còn đảm bảo tính ổn định của sản phẩm.

11


3.2.1. Tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
Hàm lượng
CCID5 0 /ml
6.00E+08

Phân tích xu hướng hàm lượng CCID 5 0

5.00E+08
4.00E+08
3.00E+08

X+2SD

X-SD
X-3SD

X+SD
X+3SD

Hình 3.9. Đồ thị phân tích xu hướng hiệu giá vi rút cúm 9 loạt BTP vắcxin cúm
A/H5N1
Hàm lượng
CCID5 0 /ml
1.00E+09

Phân tích xu hướng hàm lượng CCID5 0

8.00E+08
6.00E+08
4.00E+08
2.00E+08
Loạt

0.00E+00
0113

0213

0313

0413

cúm A/H1N1
Từ đồ thị trên chúng tôi nhận thấy các kết quả đều nằm trong khoảng (±
2SD) chứng tỏ các loạt BTP đều ổn định vể hiệu giá vi rút. Từ đó chúng tôi phân
tích dữ liệu và xây dựng tiêu chuẩn hiệu giá vi rút cúm trong quy trình sản xuất
vắcxin cúm đạt từ 106,5 CCID50/ml trở lên.

12


3.2.2. Tiêu chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng
cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm
Hàm lượng HA
(HAU)

Phân tích hàm lượng HA

1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
-200

Loạt

0112

kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 9 loạt
BTP vắcxin cúm A/H5N1
Phân tích hàm lượng HA

Hàm lượng HA
(HAU)

900
800
700
600
500
400
300
200
100
Loạt

0
0113

0213

0313

0413

0114

0214

hiệu giá kháng nguyên HA ổn định. Từ các phân tích trên chúng tôi đưa ra tiêu

13


chuẩn hiệu giá kháng nguyên HA bằng kỹ thuật ngưng kết hồng cầu trong quy trình
sản xuất vắcxin cúm phải đạt từ 128 HAU/50µl trở lên.
3.2.3. Tiêu chuẩn hàm lượng kháng nguyên HA bằng SRID
Phân tích xu hướng hàm lượng SRID

Hàm lượng SRID

300.0
250.0
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0

Loạt

0112
SRID
X+2SD

0212

0312


170.0
160.0
150.0
140.0
130.0
120.0
110.0
100.0
90.0
80.0

Loạt

0113 0213 0313 0413 0114 0214 0314 0414 0115 0215
SRID
X+2SD

X
X-3SD

X-SD
X+3SD

X+SD

X-2SD

Hình 3.16. Đồ thị phân tích xu hướng hàm lượng kháng nguyên HA
(SRID) trong quy trình sản xuất vắcxin cúm của 10 loạt BTP vắcxin cúm
A/H1N1.

X-3SD

0412

0512

0113

X-SD
X+3SD

0213

0313

X+SD

0413
X-2SD

Hình 3.17. Đồ thị hàm lượng Protein tổng số trong quy trình sản xuất vắcxin
cúm của 9 loạt BTP vắcxin cúm A/H5N1
Hàm lượng
Protein

Phân tích xu hướng hàm lượng Protein

600
580
560

15


3.2.5. Tiêu chuẩn của điện di trên gel SDS-PAGE
Sản phẩm sau siêu ly tâm tinh sạch hơn nhiều so với trước siêu ly tâm, không
còn lẫn các tạp chất, sản phẩm chỉ còn các băng protein của vi rút cúm.
3.2.6. Tiêu chuẩn kính hiển vi điện tử
Vi rút cúm sau siêu ly tâm còn nguyên vẹn với các kháng nguyên bề mặt đặc
hiệu của vi rút.

16


KẾT LUẬN
1. Nghiên cứu xây dựng và áp dụng các phương pháp đánh giá chất lượng
kháng nguyên trong quy trình sản xuất vắcxin cúm:
-

Tìm ra các điều kiện tối ưu cho phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm
CCID50 (liều vi rút gây hủy hoại 50% tế bào) là:
+ Nhiệt độ nuôi cấy vi rút: 32oC
+ Môi trường nuôi cấy vi rút: môi trường MEM
+ Thời gian nuôi cấy vi rút: 4 ngày

-

Đã áp dụng được các phương pháp đánh giá chất lượng kháng nguyên cúm
như phương pháp chuẩn độ hiệu giá vi rút cúm CCID50 (liều vi rút gây hủy
hoại 50% tế bào), phương pháp chuẩn độ kháng nguyên HA bằng kỹ thuật
ngưng kết hồng cầu, phương pháp xác định hàm lượng kháng nguyên HA