VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----

---

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
XÂY DựNG THƯờNG QUY ĐịNH LƯợNG CHOLINE
TRONG SảN PHẩM DINH DƯỡNG CÔNG THứC
CHO TRẻ EM BằNG SắC KÝ ION

Giảng viên hướng dẫn

: ThS.Lê Hồng Dũng

Sinh viên thực hiên

: Nguyễn Thị Hà My

Lớp

: 11 - 01

HÀ NỘI-2015


VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
----


tài: “Xây dựng thường quy định lượng choline trong sản phẩm dinh dưỡng công
thức cho trẻ em bằng sắc ký ion.”
Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Lê Hồng Dũng(trưởng phòng Labo Hoá,
Viện Dinh Dưỡng Quốc Gia) đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực
hiện và hoàn thành khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong khoa Công nghệ sinh học ( Viện
Đại Học Mở Hà Nội) đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm tôi học tập.
Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá
trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu để tôi bước vào đời một
cách vững chắc và tự tin.
Tôi cũng xin cảm ơn sự chỉ bảo tận tình của tập thể cô, chú, anh, chị phòng Labo
hoá đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt khoá luận này.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất. Song do
buổi đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học cũng như sự hạn chế về
mặt kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những sai sót. Rất mong
được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn.

Hà Nội, tháng 05 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Hà My


Khóa luận Tốt nghiệp 2015

Nguyễn Thị Hà My

MỤC LỤC
PHẦN 1. TỔNG QUAN ............................................................................................. 3
1.1.


PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ...........................................................12
2.1. Cách tiếp cận đề tài: ..........................................................................................12
PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.....................................................................15
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích tối ưu để định lượng choline trong
các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức: ...............................................................15
3.2. Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng: ........................................................................15
3.2.1. Thay đổi các thông số liên quan đến quá trình chiết để xác định các yếu tố
ảnh hưởng: ................................................................................................................15
3.2.1.2. Khảo sát thời gian chiết mẫu: 2 giờ, 3 giờ, và 4 giờ: .......................................18
3.2.1.3. Khảo sát nồng độ HCl: 0,5N, 1N, và 2N: .......................................................20
3.2.2. Ảnh hưởng thời gian chiết mẫu đến độ thu hồi của choline, thời gian bảo
quản dịch chiết đến đáp ứng peak sắc ký: .................................................................22
3.2.3. Thay đổi pha động trong khoảng: 6,4mM đến 8,0mM: ...................................24
3.3. Thẩm định các thông số của quy trình phân tích theo quy định của tiêu
chuẩn AOAC: ...........................................................................................................25
3.3.1. Tính chọn lọc: ..................................................................................................25
3.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính: ...............................................................26
3.3.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): .............................28
3.3.4. Độ lặp lại (SD) và hệ số biến thiên (CV%): .....................................................29
3.3.5. Độ thu hồi: .......................................................................................................32
3.4. Áp dụng quy trình dự kiến để chiết và chạy thử trên HPLC với mẫu thử: ....33


Khóa luận Tốt nghiệp 2015

Nguyễn Thị Hà My

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. .................................................................35
4.1. Kết luận: .............................................................................................................35
4.2. Các tác động của kết quả nghiên cứu: ..............................................................35

Hình 10. Sắc ký đồ khảo sát nồng độ HCl 1N..........................................................21
Hình 11. Sắc ký đồ khảo sát nồng độ HCl 2N..........................................................22
Hình 12. Sắc ký đồ của mẫu sữa 1. ..........................................................................23
Hình 13. Sắc ký đồ của mẫu sữa 2. ..........................................................................23
Hình 14. Sắc ký đồ của mẫu ở khoảng pha động 6,4mM. ......................................24
Hình 15. Sắc ký đồ của mẫu ở khoảng pha động 8,0mM. .......................................25
Hình 16. Sắc ký đồ của mẫu sữa không có choline. .................................................25
Hình 17. Sắc ký đồ của mẫu sữa có choline. ............................................................26
Hình 18. Hình biểu diễn sự phụ thuộc nồng độ từ 1ppm đến 100ppm vào diện
tích peak ....................................................................................................................27
Hình 19. Sắc ký đồ của mẫu sữa 3. ..........................................................................30
Hình 20. Sắc ký đồ của mẫu sữa 5. ..........................................................................30
Hình 21. Sắc ký đồ của mẫu sữa 10..........................................................................31
Hình 22. Biểu đồ mẫu QC Chart..............................................................................32
Hình 23. Sắc ký đồ của mẫu sữa Grow Plus +. ........................................................34
Hình 24. Sắc ký đồ của mẫu sữa Dutch Lady. .........................................................34


Khóa luận Tốt nghiệp 2015

Nguyễn Thị Hà My

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Nhu cầu khuyến nghị đối với choline .......................................................... 5
Bảng 2. Một số thực phẩm cung cấp choline. ..........................................................10
Bảng 3. Chương trình chạy sắc ký của Choline. .....................................................13
Bảng 4. Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu ở các khoảng nhiệt độ 600C, 700C, 800C. .....16
Bảng 5. Khảo sát thời gian chiết mẫu: 2 giờ, 3 giờ, và 4 giờ. ..................................18
Bảng 6. Khảo sát nồng độ HCl: 0,5N, 1N, và 2N. ....................................................20
Bảng 7. Ảnh hưởng thời gian chiết mẫu đến độ thu hồi của choline, thời gian bảo

choline còn giúp mẹ bầu giảm sự căng thẳng, mệt mỏi trong thai kỳ.
Những nghiên cứu khác còn chỉ ra rằng, choline giúp cải thiện trí nhớ cho bà bầu.
Hàm lượng choline mỗi ngày là 450mg cho phụ nữ đang mang thai và 550mg cho phụ
nữ sau sinh.[35]
Choline không chỉ cần thiết cho bà mẹ mang thai và cho con bú mà nó cũng là một
chất dinh dưỡng quan trọng đối với tất cả mọi người. Nó được Uỷ ban Thực phẩm và
Dinh dưỡng của Viện Y khoa (Mỹ) công nhận là một trong những chất dinh dưỡng cần
thiết vào năm 1998, và cần được bổ sung trong bữa ăn hàng ngày.[11]
Chính vì choline là một chất dinh dưỡng thiết yếu nên chúng tôi đã tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Xây dựng thường quy định lượng choline trong sản phẩm dinh dưỡng
công thức cho trẻ em bằng sắc ký ion” với mục tiêu sau:
Mục tiêu chung: Xây dựng thường quy định lượng choline trong sản phẩm dinh
dưỡng công thức cho trẻ em bằng sắc ký ion.
Mục tiêu cụ thể: gồm có ba mục tiêu:
1


Khóa luận Tốt nghiệp 2015

Nguyễn Thị Hà My

. Khảo sát và chọn lựa quy trình chiết và phân tích sắc ký phù hợp để xác định hàm
lượng choline trong sản phẩm dinh dưỡng công thức
. Thẩm định các thông số phân tích theo tiêu chuẩn AOAC
. Xác định hàm lượng choline trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức cho trẻ
em trên thịtrường.

2



nhi
ở màng tế bào.Choline
.Choline là các phân tử
t
tiền thân cho chấtdẫn truyền
ền thần
th
kinh acetylcholine, là chấttham
ấttham gia vào
nhiều chức năng bao gồm
m trínhớ
trính và
kiểm soát cơ bắp.
Thuộc tính của choline:

Tên

-

Công thức hoá học:
ọc: C5H14NO+

Tên IUPAC

-

Tỉ trọng: 1,09 g/ml

2-hydroxy N , N , N -trimethylethanamonium
trimethylethanamonium

h thì được gọi là choline [10] . Năm
m 1998, choline được
phân loại như là một chấtt dinh dưỡng
d
thiết yếu bởi Uỷ ban Thực phẩm
m và Dinh
dưỡng của Viện Y khoa (Mỹ)[10].
(M
Choline được tìm thấy dưới dạng
phosphatidylcholine (hay lecithin) có trong màng tế bào
ào và trong Sphingomyelin, là
thành phần quan trọng củaa llớp myelin bao quanh sợi dây thần kinh.
Choline cũng đươc tìm thấyy trong gan,đóng
gan,
vai trò trong việc tạoo methionine và
lipoprotein.
3


Khóa luận Tốt nghiệp 2015
1.3.

Nguyễn Thị Hà My

Chức năng của choline:

Choline là một dưỡng chất thiết yếu trong sinh tổng hợp acetylcholine-một chất dẫn
truyền xung thần kinh quan trọng và là thành phần chính chủ yếu trong màng tế bào
của chúng ta, ví dụ như phosphatidylcholine(lecithin) và Sphingomyeline, tiểu cầu yếu
tố hoạt hóa và betaine, đó là yêu cầu của các tế bào thận và đóng vai trò trong nhóm


Khuyến nghị

Giới hạn tối đa

4


Khóa luận Tốt nghiệp 2015
Trẻ nhỏ

Nguyễn Thị Hà My

0-6 tháng

125mg/ngày hoặc 18mg/kg

6- 12 tháng

150 mg/ngày

0-3 tuổi

200mg/ngày

1000mg/ngày

4- 8 tuổi

250mg/ngày


3500mg/ngày

Phụ nữ có thai

Chung

450mg/ngày

Theo tuổi

Phụ nữ cho con bú

Chung

550mg/ngày

Theo tuổi

Trẻ em

Nam giới

Nữ giới

Bảng 1. Nhu cầu khuyến nghị đối với choline
1.5.

Vai trò của choline trong cơ thể:


choline, (SNPs thay đổi mã RNA, và sau đó có thể thay đổi sự sắp xếp của các protein
được làm từ RNA đó, dẫn đến sự khác biệt về chức năng protein giữa các phiên bản
thường và phiên bản SNP)[19].
Choline- dinh dưỡng tối quan trọng dành cho mẹ và bé
Choline là một hợp chất hữu cơ, một chất dinh dưỡng thiết yếu tan được trong nước và
có mặt trong vitamin nhóm B. Mặc dù mãi tới cuối thế kỷ 18, choline mới được tìm ra
và được các chuyên gia thế giới công nhận là một chất dinh dưỡng đặc biệt quan trọng
cho sức khỏe con người đặc biệt là bà bầu và thai nhi. Chất dinh dưỡng này đã được
chứng minh là ảnh hưởng lớn đến sự hình thành phát triển của não và cơ cấu tủy sống,
chức năng bộ nhớ của trẻ. Choline giúp quá trình sản xuất acetylcholine được đẩy
mạnh - 1 chất dẫn truyền đặc biệt quan trọng của hệ thần kinh, ảnh hưởng đến trí nhớ,
sự kiểm soát cơ bắp và các chức năng khác ở mẹ và bé.
6


Khóa luận Tốt nghiệp 2015

Nguyễn Thị Hà My

Choline là chất dinh dưỡng cần thiết giúp cơ thể con người tổng hợp các tế bào một
cách nhanh và chính xác, giúp chất dinh dưỡng được chuyển hóa dễ dàng qua gan,
giúp các chất dinh dưỡng vận chuyển tốt trong cơ thể. Nó góp phần cấu tạo nên hệ
thống thần kinh cho trẻ nhỏ ngay từ khi còn trong bào thai.Choline giúp bé giảm nguy
cơ khuyết tật ống thần kinh (NTDs). Ngoài ra, choline còn cần thiết cho hoàn thiện
dây thần kinh, tim mạch, chức năng não và sự phát triển các tế bào của thai nhi.
Nghiên cứu cho thấy rằng những người phụ nữ tiêu thụ một lượng choline cao trong
chế độ ăn uống có thể giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư vú hơn những chị em
khác.Thêm vào đó, bà bầu được bổ sung đầy đủ choline sẽ làm giảm nguy cơ mắc
bệnh tim mạch, bệnh giảm trí nhớ. Khi mang bầu, lượng choline sẵn có trong cơ thể
người mẹ sẽ dần bị cạn kiệt bởi giai đoạn này, vì vậy, bà bầu cần được bổ sung lượng

gan. Tế bào gan chết do appoto được đặt trong môi trường thiếu choline, nên bị rò rỉ
enzyme vào máu ở người. Hơn thế nữa, thiếu choline trong cơ thể người cũng có thể
dẫn đến dãn màng cơ, vì màng cơ mỏng manh hơn.
Nói chung, choline là một dưỡng chất thiết yếu cho sự duy trì và phát triển màng tế
bào người. Các bệnh nhân được nuôi ăn qua đường tĩnh mạch với chế độ nghèo
choline đều xuất hiện các dấu hiệu thiếu hụt chất này.Trong nghiên cứu ở người,cả trí
nhớ về ngôn ngữ lẫn hình ảnh đều bị suy giảm ở bệnh nhân được nuôi ăn hoàn toàn
qua đường tĩnh mạch dài hạn, tuy nhiên cho thấy có cải thiện khi bổ sung choline.
Hội chứng mùi cá
Tại một lượng tiêu thụ vượt quá vài gram mỗi ngày, choline có thể gây ra giảm đáng
kể huyết áp.Ngoài ra, lượng choline quá mức có thể gây ra mùi tanh cho cơ thể. Mùi
tanh này do một chất chuyển hóa được hình thành trong quá trình bài tiết gọi là
Trimethylaminuria, trong đó choline là một tiền thân. Người có Trimethylaminuria nên
hạn chế tiêu thụ các thực phẩm giàu choline, điều này có thể giúp giảm mùi cơ thể của
người bị bệnh.
Ngoài ra, khi dùng liều cao, choline có thể gây ra các tác dụng phụ nhất định như buồn
nôn, và mất cảm giác ngon miệng khi ăn. Một lượng lớn choline cũng có thể dẫn đến
làm tăng nhiệt độ cơ thể.
Ảnh hưởng sức khỏe từ chế độ ăn uống choline
Thiếu choline có thể đóng một vai trò trong bệnh gan, xơ vữa động mạch, và có thể
là rối loạn thần kinh [5]. Nó đặc biệt quan trọng đối với phụ nữ mang thai để có đủ
choline, vì lượng choline thấp có thể làm tăng tỷ lệ dị tật ống thần kinh ở trẻ sơ sinh ,
và có thể ảnh hưởng đến bộ nhớcủacon cái sau này . Ngoài ra, nó còn làm tăng nguy
cơ tiền sản giật, sinh non [5].Những phụ nữ có chế độ ăn giàu choline có thể làm giảm
nguy cơ ung thư vú [17][18], vàchống viêm mũi dị ứng[22].
Choline còn có thể làm giảm huyết thanh và nước tiểu carnitine (Hongu & Sachan
2003).
1.7.

Một số thực phẩm cung cấp choline:


Loại thực phẩm

Choline (mg / 100g)

1

Lòng đỏ trứng gà sấy khô

1388

2

Trứng gà toàn phần sấy khô

1007

3

Lòng đỏ trứng gà tươi

682

4

Bầu dục bò

513

5


Gan gà

290

11

Trứng vịt toàn phần

263

12

Trứng ngỗng toàn phần

263

13

Trứng chim cút toàn phần

263

14

Trứng gà toàn phần

251

15

phân tích đã được áp dụng là phương pháp sắc ký ion xác định choline trong sản phẩm
công thức trẻ em [28, 30], hoặc phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phân tích
choline trong huyết thanh [29]. Gần đây, một số phương pháp xác định choline đã
được tiêu chuẩn hóa như phương pháp AOAC 999.14 [31] sử dụng kỹ thuật so màu để
định lượng choline trong sữa và sản phẩm công thức, AOAC 2012.18 [32] sử dụng kỹ
thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết nối khối phổ, AOAC 2012.20 [33] sử dụng
10


Khóa luận Tốt nghiệp 2015

Nguyễn Thị Hà My

phương pháp sắc ký ion với bộ phận ức chế ion trong xác định choline. Tuy nhiên bộ
phận ức chế ion này thường không có sẵn trong các hệ thống sắc ký ở các phòng thí
nghiệm Việt Nam.
Khoa Hoá Thực phẩm , Viện Dinh dưỡng đã triển khai nhiều đề tài nghiên cứu phát
triển phương pháp phân tích xác định các loại vitamin trong thực phẩm như vitamin A,
B1, B2, B6, D, E, các carotenoid và nhiều thành phần dinh dưỡng khác.
Với thiết bị sắc ký ion hiện có của phòng thí nghiệm Khoa Hoá Thực phẩm, Viện Dinh
dưỡng, đề tài này nhằm xây dựng một phương pháp sắc ký ion phù hợp (không sử
dụng bộ phận ức chế ion như trong tiêu chuẩn AOAC) để phân tích thành phần choline
trong sản phẩm dinh dưỡng công thức dành cho trẻ em, góp phần phục vụ công tác
đảm bảo chất lượng sản phẩm và phục vụ các nghiên cứu dinh dưỡng.

11


Khóa luận Tốt nghiệp 2015


2.4.1. Phương pháp chọn mẫu:
Chọn mẫu chủ đích:
- Tại một quận ( Hai Bà Trưng ), chọn một siêu thị để mua
12


Khóa luận Tốt nghiệp 2015

Nguyễn Thị Hà My

- Chọn 5 loại sản phẩm dinh dưỡng công thức để phân tích bước đầu
- Tại mỗi điểm đã chọn, mua mỗi loại sản phẩm một mẫu
Tổng số mẫu thu thập: 1 mẫu/loại x 5 loại sản phẩm = 5 mẫu
Phân tích định lượng choline trong các mẫu thu thập theo quy trình đã chuẩn hoá để
bước đầu cung cấp dữ liệu thành phần trong choline trong sản phẩm dinh dưỡng công
thức cho trẻ em.
2.4.2. Quy trình dự kiến:
Cân 10g± 0,1g mẫu/bình nón 250ml
Thêm 30ml HCl 1M,lắc đều
Để cách thuỷ 70oC trong 3 giờ, thỉnh thoảng lắc
Để nguội đến nhiệt phòng
Lọc qua giấy lọc vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch
Lọc qua màng 0,45µm, tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký ion,cột cation
2.4.3. Điều kiện sắc ký:
Quá trình chạy sắc ký ion sử dụng detector độ dẫn điện được tham khảo từ các tài liệu
nước ngoài với một số điều kiện thay đổi phù hợp với điều kiện thực tế của phòng thí
nghiệm được thể hiện ở bảng 3 dưới đây:
TT

Thiết bị



Khóa luận Tốt nghiệp 2015

Nguyễn Thị Hà My

2.4.4. Tính toán kết quả:
Hàm lượng các Choline trong mẫu phân tích được tính toán theo công thức sau:
X(mg/100g)=

࡯ࢉ.ࡿ࢓.ࢌ.ࢂ.૚૙૙
ࡿࢉ.࢓.૚૙૙૙

Trong đó:
Cc: Nồng độ của dung dịch chuẩn (µg/ml)
Sm, Sc: Diện tích (hoặc chiều cao) của peak mẫu và peak chuẩn
m: Trọng lượng mẫu thử (g)
f: Hệ số pha loãng (nếu có)
V: Thể tích cuối khi pha loãng (ml)

14


Khóa luận Tốt nghiệp 2015

Nguyễn Thị Hà My

PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích tối ưu để định lượng choline trong
các loại sản phẩm dinh dưỡng công thức:

600C

700C

800C

QC_1

860,3

1082,6

QC_2

722,0

1109,1

803,8

QC_3

913,8

1057,9

854,6

QC_4


QC_8

856,4

1087,1

QC_9

802,2

1110,2

796,2

QC_10

790,9

1097,8

785,7

901,0

814,7

Bảng 4. Khảo sát nhiệt độ chiết mẫu ở các khoảng nhiệt độ 600C, 700C, 800C.
Nhận xét: Từ kết quả bảng 4, cho chúng ta thấy ở khoảng nhiệt độ là 600C và 800C,
mẫu không được chiết hoàn toàn, còn ở khoảng nhiệt độ 700C thì lượng choline trong
mẫu mẫu được chiết ra nhiều hơn. Vì thế nhiệt độ chiết được đưa ra với quy trình là