BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
TÌM HIỂU VÀ THỰC TẬP QUI TRÌNH ĐỊNH ĐANH VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS
AUREUS, HEAMOPHILUS INFLUNENAE VÀ KLEBSIALL PENEUMONIAE TRÊN
BỆNH PHẨM ĐÀM TẠI BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH
CBHD: Ths.BS. NGUYỄN SỬ ÁNH TUYẾT
KS. NGUYỄN THÙY TRANG
GVHD: Th.S LƯU HUYỀN TRANG
SVTT: 1. DƯƠNG NGỌC THẢO - 10066551
2. NGUYỄN THỊ THÙY
3. PHẠM TRỌNG
4. PHAN HÙNG VƯƠNG
5. NGUYỄN NGỌC YẾN – 10271641
Lớp: CDSH12
Niên khóa: 2010 – 2013
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2013


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa thực tập tốt nghiệp và bài báo cáo thực tập này. Bên cạnh sự nổ lực của
bản thân đã vận dụng những kiến thức thu thập ở trường, tìm tòi học hỏi cũng như thu thập
những thông tin số liệu liên quan đến đề tài, nhóm chúng em đã nhận được sự quan tâm cũng
như hướng dẩn tận tâm của Quý Thầy Cô , Cán Bộ và các Anh ( Chị ) tại bệnh viện, cùng với
những lời động viên và khích lệ từ phí gia đình và bạn bè trong lúc em gặp khó khăn.
Chúng em xin được gởi lời cảm ơn đến Quý Thầy Cô Ban Giám Hiệu trường Đại Học Công
Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh, Quý Thầy Cô Viện Công Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm đã tận

................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
T.p Hồ Chí Minh, ngày…..tháng…. năm 2013
Cán bộ hướng dẫn:

Trang 3


NHẬN XÉT CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN
Báo cáo thực tập tại Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định
GVHD: Th.S Lưu Huyền Trang
Nhận xét:
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
................................................................................................................................................................
T.p Hồ Chí Minh, ngày….tháng….năm 2013
Giảng viên hướng dẫn:


GIỚI THIỆU VỀ BỆNH VIỆN NHÂN DÂN GIA ĐỊNH ................................................. 9

2.1.1.

Lịch sử hình thành và phát triển ........................................................................................... 9

2.1.2.

Cơ cấu tổ chức. .................................................................................................................... 11

2.2.

KHOA VI SINH .................................................................................................................. 13

2.2.1.

Giới thiệu khoa .................................................................................................................... 13

2.2.2.

Chức năng và nhiệm vụ....................................................................................................... 13

2.2.3.

Thành tích đạt được ............................................................................................................. 14

2.2.4.

Hướng phát triển trong tương lai ........................................................................................ 15


2.4.1.

Haemophilus influenzae ...................................................................................................... 27

2.4.2.

Vi khuẩn Klebsiella pneumoniae........................................................................................ 37

a.

Đặc điểm phân loại .............................................................................................................. 37

2.4.3.

STAPHYLOCOCCUS AUREUS ......................................................................................... 40

3.

NỘI DUNG THỰC TẬP .................................................................................................... 49

3.1.

DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ .................................................................................................. 49

3.1.1.

Dụng cụ ................................................................................................................................ 49

3.2.


3.4.1.

Quy trình định danh H. influenzae. .................................................................................... 53

3.4.2.

giải thích quy trình .............................................................................................................. 54

3.4.3.

Phương pháp định danh Klebsiella pneumoniae ............................................................... 56

MỤC LỤC BẢNG+HÌNH

Trang 6


MỤC LỤC CÁC CHỬ VIẾT TẮT(NẾU CÓ)

1. GIỚI THIỆU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm khuẩn đường hô hấp không chỉ là gánh nặng bệnh tật mà còn là bệnh lý có tỷ lệ tử vong
đứng đầu trong số 10 bệnh lý nhiễm trùng ở các nước có thu nhập thấp Yếu tố rất quyết định để
góp phần chống đở được gánh nặng này là vấn đề tìm ra tác nhân đích gây bệnh và tìm ra loại
kháng sinh phù hợp trong điều trị kinh nghiệm khi đứng trước một bệnh nhân nhiễm khuẩn hô
hấp. Chính vì vậy sự hiểu biết về các tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn hô hấp cũng như
các thách thức phải quan tâm hiện nay trong đề kháng các kháng sinh của các vi khuần này là
những vấn đề gì.
Các bệnh lý nhiễm khuẩn hô hấp cấp bao gồm viêm xoang , viêm tai giữa , viêm amydale là các
bệnh lý viêm nhiễm khuẩn cấp đường hô hấp trên, và viêm phổi, viêm phế quản – phổi là các

Gia Định).
Trong tất cả các tác nhân gây bệnh kể trên thì ba tác nhân: Staphylococcus aureus, Haemophilus
influenza,Klebsiella pneumoniaelà những vi khuẩn thường có mặt trong mẫu bệnh đàm đáng
được quan tâm. Chính vì lẽ đó, nhóm chúng tôi đã thực hiện quá trình tìm hiểu..., quy trình
định danh và phương pháp thực hiện kháng sinh đồ đối với ba loại vi khuẩn này.

1.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Là những mẫu bệnh phẩm đàm của các bệnh nhân từ khoa lâm sàng gửi tới khoa vi sinh tại bệnh
viên nhân dân Gia định có chỉ định cấy vi khuẩn, định danh và làm kháng sinh đồ.

1.3 MỤC ĐÍCH, NHIỆM VỤ
 Mục đích

Trang 8


Tìm hiểu, theo dõi và thực hành thao tác phân lập và định danh,kháng sinh đồ với các chủng
Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Klebsiella pneumoniae phân lập từ mẫu bệnh
phẩm đàm.
 Nhiệm vụ
Hiểu được nguyên lý, nắm vững các thao tác về lấy mẫu bệnh phẫm, các thao tác trong quy trình
định danh, làm kháng sinh đồ với chủng Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza,
Klebsiella pneumoniae trong mẫu bệnh phẩm đàm.

1.4 PHẠM VI ĐỀ TÀI
Đề tài được thực hiện trên tất cả các bệnh phẩm đàm thu nhận được tại khoa vi sinh bệnh viện
nhân dân Gia định. Các thao tác, quy trình định danh vi khuẩn dùng để báo cáo là những thao
tác, quy trình đang được áp dụng tại bệnh viện Nhân Dân Gia Định.
 Thời gian
Từ 1/03/2013 đến 31/05/2013


Trang
10


nhân/ngày. Trước tình hình qúa tải trầm trọng cả khu vực nội trú và ngoại trú, bệnh viện đã được
xây dựng mới khu khám bệnh – cấp cứu 4 tầng với tổng diện tích 10.100 m2 , đã đưa vào sử dụng
vào tháng 7/2007.
- Hiện tại, Bệnh viện Nhân Dân Gia Định là bệnh viện đa khoa loại 1 trực thuộc Sở Y tế TP. Hồ
Chí Minh với quy mô 1.200 giường, khám chữa bệnh cho nhân dân sinh sống trên địa bàn TP.
Hồ Chí Minh (các quận trong tuyến: Bình Thạnh, Gò Vấp, Phú Nhuận, một phần Quận I và các
quận ngoài tuyến: Thủ Đức, Quận 2, 12, 9 . . ), ngoài ra bệnh viện còn tiếp nhận bệnh nhân đến
từ các tỉnh thành lân cận như Đồng Nai, Bình Dương, Vũng Tàu và một số tỉnh miền Trung.
Bệnh viện có đủ các chuyên khoa lớn, với nhiều phân khoa sâu, bệnh viện được trang bị khá đầy
đủ trang thiết bị y tế nhằm nâng cao chất lượng chẩn đoán, điều trị và chăm sóc bệnh nhân, đáp
ứng được nhu cầu khám chữa bệnh ngày càng cao của nhân dân.
- Bệnh viện còn là cơ sở thực hành của 2 trường Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh và Đại học Y
khoa Phạm Ngọc Thạch. Trung bình mỗi năm bệnh viện tiếp nhận khoảng 1500 học viên đến
thực tập thuộc hệ trung học, hệ đại học và sau đại học.

2.1.2. Cơ cấu tổ chức.
Ban giám đốc:

 Phòng chức năng

Trang
11


 Phòng chỉ đạo tuyến


 Khối nội:

 Chuyên khoa:

 Nội tiêu hóa

 Khoa tai mũi họng

 Hồi sức tích cực – chống độc

 Khoa răng hàm mặt

 Khoa lão học

 Khoa mắt

 Khoa nội hô hấp – cơ xương khớp

 Các khoa khác:

 Khoa nội tiết – thận – niệu

 Khoa cấp cứu

 Khoa nội thần kinh – huyết học – y

 Khoa khám bệnh
 Khoa cận lâm sàng:



 Khoa chống nhiễm khuẩn


Trong nhiều năm qua bệnh viện đã có nhiều thành tích đáng ghi nhận trong việc cứu chữa bệnh
và nghiên cứu khoa học chẳng hạn như có thể mổ ghép thận, phẩu thuật vi mạch điều trị co giật
nửa mặt,…và nhiều nghiên cứu khoa học khác

Trang
12


Với nhiều trang thiết bị ngày càng tiên tiến cùng với đội ngũ y bác sĩ giàu kinh nghiệm,bệnh viện
sẽ có nhiều hướng phát triển hơn nữa trong tương lai.

2.2.

KHOA VI SINH

2.2.1. Giới thiệu khoa
Năm 1978, từ khoa xét nghiệm bao gồm sinh hoá - huyết học – vi trùng, bộ phận vi trùng học
tách ra để lập khoa riêng với tên gọi KHOA VI TRÙNG hoạt động độc lập với khoa Sinh hoá Huyết học.
Năm 1998, khoa được đổi tên thành KHOA VI SINH cho đến nay.
Khoa gồm có 17 công nhân viên chức
Phó trưởng khoa: Ths.Bs Nguyễn Sử Minh Tuyết
Cán bộ trên đại học: 01 (thạc sỹ vi sinh y học)
Cán bộ đại học: 04 (02 bác sĩ, 02 kỹ sư)
Cán bộ trung cấp (kỹ thuật viên xét nghiệm): 11
Hộ lý: 01


đồ; theo dõi sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn mỗi 6 tháng – 1 năm.
• Kiểm tra vô khuẩn định kỳ các khoa trong bệnh viện, lưu ý các khoa trọng điểm như Hồi sức
tích cực - chống độc, Hồi sức ngoại, Phòng mổ, Bệnh lý sơ sinh. Thực hiện cấy không khí, nước,
tay phẫu thuật viên, y dụng cụ ...

Trang
14


• Các xét nghiệm miễn dịch học: HIV (Determine, Vironostika, Murex), viêm gan siêu vi
(HBsAg, HBsAb, HBeAg, HBeAb, antiHBc-IgM/IgG, antiHCV, antiHAV-IgM/IgG),
Toxoplasma gondii (IgM, IgG), Rubella (IgM, IgG), Cytomegalovirus (IgM, IgG).
• Tham gia công tác ngoại kiểm tra chất lượng của Trung tâm Kiểm chuẩn TP.HCM với đánh giá
“Kết quả hoàn toàn phù hợp”.
• Hướng dẫn sinh viên các trường Đại học đến thực tập và làm Luận văn tốt nghiệp.
• Tham dự và báo cáo trong các hội nghị Khoa học kỹ thuật, lao động sáng tạo – sáng kiến cải
tiến trong và ngoài bệnh viện

2.2.4. Hướng phát triển trong tương lai
Triển khai nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí, huyết thanh chẩn đoán bệnh do ký sinh trùng, các xét
nghiệm sinh học phân tử đáp ứng nhu cầu cung cấp các dịch vụ xét nghiệm chẩn đoán toàn diện.

2.3.

CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY

BỆNH

2.3.1. Phương pháp cấy mẫu bệnh phẩm
2.3.2. Phương pháp nhuộm Gram

Nhằm xác định vi sinh vật có có hệ enzyme citratase có khả năng khử nitrat thành nitrite hay nitơ
tự do trong điều kiện kị khí. Nitrite được tạo ra sẽ phản ứng với sulphanilamide và Nnapthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng.
• Thử nghiệm ONPG

Trang
16


Các vi khuẩn có khả năng len men đường lactose nhanh có khả năng sản xuất cả2 loại men
lactose permease và β-galactosidase. Một số vi khuẩn được xem là nhóm vi khuẩn lên men
lactose chậm chỉ sản xuất được β-galactosidase. Hoạt tính của enzyme này có thể xác định dựa
một cơ chất tổng hợp là o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG).Sự thủy phân của cơ chất
đường này bởi β-galactosidase sẽ phóng thích o- nitrophenol có màu vàng.
• Thử nghiệm khả năng biến dưỡng citrate
Sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kiềm hóa môi trường. Mặt khác mọi sinh
vật có khả năng sử dụng citrate làm nguồn cacbon duy nhất đều có khả năng dùng muối
ammonium làm nguồn đạm duy nhất.Sự phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm
trong môi trường sẽ sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị
bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
• Thử nghiệm Urease
Vi khuẩn tiết men urease có khả năng thủy phân urê trong môi trường thành CO2 và NH3 làm
môi trường bị kiềm hóa. Chất chỉ thỉ Phenol Red trong môi trường thửnghiệm làm môi trường
chuyển sang màu đỏ.
• Phenylalanine deaminase (PAD)
Một số vi khuẩn thuộc bộ lạc Proteeae như Proteus, Morganella, Providencia có khả năng sản
xuất men deaminase khử amin của amino acid phenylalanine thành một keto acid, chất này kết
hợp với ion sắt trong thuốc thử Ferric chloride 10% để cho ra màu xanh lá cây.
• Thử nghiệm bile esculine
Thử nghiệm này giúp phân biệt vi sinh vật dựa trên khả năng thủy phân liên kết glucoside trong
esculine thành esculetin và glucose tự do khi có sự hiện diện của muối mật. Esculetin tạo ra sẽ

trường với điều kiện thiếu ôxi, glucose được lên men kỵ khí sinh ra các acid hữu cơ làm giảm pH
của môi trường.Nếu trong môi trường có chất chỉ thị phenol red thì trên mặt thạch nghiêng sẽ có
màu đỏ và phần sâu sẽ có màu vàng.
Trang
18


+ Nếu vi sinh vật có thể sử dụng cả glucose và lactose, toàn bộ môi trường trở nên có pH acid, vi
sinh vật không cần phải sử dụng đến pepton để tạo năng lượng.
+ Nếu vi sinh vật không sử dụng được cả hai nguồn carbon này, thì pepton được sử dụng để biến
dưỡng thu năng lượng và vật chất cần cho sự tăng trưởng của vi sinh vật. Tuy nhiên, do pepton
chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa chỉ diễn ra trên phần của
bề mặt môi trường và chỉ phần này mới trở nên có màu đỏ.Trong khi đó, phần môi trường sâu
trong ống nghiệm sẽ không có hiện tượng đổi màu.

Trong các trường hợp nêu trên, sự lên men đường tạo ra các sản phẩm khí được nhận biết nhờ
các khí này đẩy ống thạch lên trên hay làm vỡ thạch. Thử nghiệm này cũng có thể phát hiện khả
năng sinh H2S do thành phần môi trường có chứa sodium thiosulphate. Vi sinh vật khử sulfate
có thể khử hợp chất này để giải phóng H2S. Khí H2S tạo ra sẽ được phát hiện dựa vào phản ứng
tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thịammonium citrate hiện diện trong môi
trường.
•Thử nghiệm tính di động
Vi sinh vật di động thường là các vi sinh vật có tiêm mao phân bố tại các vi trí khác nhau trên tế
bào vi sinh vật. Trong môi trường thử nghiệm tính di động thường bổ sung triphenyltetrazolium
chloride để phát hiện dễ dàng vị trí hiện diện của tế bào vi sinh vật trong môi trường do hợp chất
này khi vào bên trong tế bào sẽ bị khử thành formazan có màu đỏ.
• Thử nghiệm decarboxylase
Thử nghiệm này giúp xác định khả năng một vi sinh vật tạo enzyme carboxylase thủy phân được
các axít amin đặc hiệu để xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl. Các enzyme carboxylase chỉ
được cảm ứng tổng hợp khi môi trường có tính acid và chứa chất cảm ứng đặc hiệu.Phản ứng tạo

20


- Dùng kẹp giấy lấy một đĩa giấy oxidase nhúng vào giọt nước muối sinh lý cho vừa đủ ướt và
đặt lên lame.
- Dùng vòng cấy vô trùng lấy khúm khuẩn quệt lên đĩa giấy oxidase.
- Đọc kết quả sau 10 giây: phản ứng dương tính khi đĩa giấy oxidase xuất hiệnmàu tím đen; âm
tính khi đĩa giấy oxidase không có màu tím đen.
• Thử nghiệm trên ống nghiệm đã có chứa các môi tường thử nghiệm tương ứng
- Dùng tăm bông vô trùng lấy khúm khuẩn cho vào nước muối sinh lý vô trùng đểlàm thành
huyền dịch có độ đục McFarland 2,0.
- Dung que cấy vòng lấy dịch từ ống pha nước muối sinh lý có chứa vi sinh vật cấy vào các ống
chưa các thử nghiệm tượng ứng.
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.
-Đọc kết quả theo bảng 2.1
Tương tự cho thử nghiệm sinh hóa đối với bộ API trên 10 giếng thử nghiệm
-cách dùng: dùng Micropipetcho vào mỗi giếng 200 µl huyền dịch, đậy nắp.
- Ủ 35-37oC/12-24 giờ.
-Đọc kết quả theo bảng 2.1
Bộ thử nghiệm API

Trang
21


Bảng 2.1 Hướng dẫn đọc kết quả phản ứng sinh hóa
Thuốc
Giếng

Ký


Càng

thành nitite

phút

nhạt

Thủy giải

Vàng nhạt

glucose
2

3

NIT

ONPG

Khử nitrat

Tìm nitite

ONPG
4

URE

Vàng

deaminase

thuốc thử)

nhạt

Sử dụng citrate

Xanh biển (có ánh xnah

Xanh lá/

biển)

vàng

Thủy giải

Đen( có màu từ đen nhạt

Không

Esculine

qua đen đậm)

đen


VP

MLO

Voges-

KOH+napthto

prokauer

l

Đỏ(xuất hiện 5 phút)

Vàng
nhạt

Sử dụng

Xanh biển

malonate

Xanh
lá/vàng

Đọc kết quả định danh
hệ thống định danh phân chia các thử nghiệm sinh hóa theo nhóm như trong hình 2.1
3.Phương pháp cấy mẫu đàm (PHẦN NÀY CHƯA NẮM RÕ CẦN TÌM HIỂU KỸ)
Trước hết làm tan đàm trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vừa pha thêm NALC

Mẫu đàm pha

Vòng cấy định

Thể tích đàm

Số vi khuẩn được

loãng

lượng

được cấy

định lượng

1

1/2

10 µl

5 µl

2N x 10 2 / ml

2

1/2


Bàn luận và kết quả
- Các vi khuẩn có lượng ≥ 1000 CFU/ml thì phải định danh và làm kháng sinh đồ. Có nghĩa là
tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ bất cứ khóm vi khuẩn nào mọc được trên hộp thạch 2
và 3 hay có số lượng ≥ 5 trên hộp thạch 1. Trả lời lâm sàng cả kết quả định lượng là bao nhiêu vi
khuẩn đã định danh và làm kháng sinh đồ để lâm sàng có thể tùy nghi sử dụng.(theo TS.Phạm
Hùng Vân)
-Tuy vậy, tùy từng Labo xét nghiệm chọn các vi khuẩn có lượng từ 103 – 107 CFU/ml để tiến
hành làm kháng sinh đồ.

2.3.4. Phương pháp làm kháng sinh đồ với kỹ thuật KIRBY
2.3.5. Chuẩn bị môi trường.
Môi trường được chuẩn bị theo hướng dẫn của từng hãng sản xuất: bằng cách cân chính
xác lượng thạch Muller-Hinton khô và hòa tan vào trong nuớc cất trung tính, kiểm tra pH trước
khi hấp tiệt khuẩn. Trong khi hấp, tránh để môi trường ở nhiệt độ cao và thời gian dài hơn sự cần
thiết, vì điều đó sẽ làm giảm khả năng đệm và thay đổi pH của môi trường. Sau khi để nguội môi
Trang
25