BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC
DỤNG SINH HỌC CỦA RONG CÂU CHỈ
(Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia)
- Gracilariaceae) Ở HẢI PHÒNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ QUYÊN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC
DỤNG SINH HỌC CỦA RONG CÂU CHỈ
(Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia)

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và các bạn yêu quý của tôi đã luôn
động viên, khích lệ và nhắc nhở, luôn sát cánh bên tôi, là động lực lớn giúp tôi vượt
qua mọi khó khăn.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn,
luận văn này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy
cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày

tháng

năm 2016.

Tác giả luận văn

Đinh Thị Quyên


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...................................................................................... 3
1.1. Gracilaria tenuistipitata trong hệ thống phân loại ............................................... 3
1.2. Đặc điểm thực vật.................................................................................................. 3
1.3. Phân bố và Sinh thái .............................................................................................. 3
1.4. Thành phần hóa học .............................................................................................. 5
1.5. Tác dụng sinh học.................................................................................................. 6
1.5.1. Độc tính .......................................................................................................... 6
1.5.2. Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan ........................................................ 8
1.5.3. Tác dụng chống viêm................................................................................... 11
1.5.4. Một số tác dụng sinh học khác .................................................................... 11

4.2.3. Định lượng ................................................................................................... 45
4.2.2. Phân lập chất ................................................................................................ 46
4.3. Về tác dụng sinh học ........................................................................................... 47
4.3.1. Tác dụng chống oxy hóa in vitro ................................................................. 47
4.3.2. Tác dụng chống oxy hóa in vivo .................................................................. 47
KẾT LUẬN................................................................................................................ 49
1. Về thực vật.............................................................................................................. 49
2. Về thành phần hóa học ........................................................................................... 49
3. Về tác dụng sinh học .............................................................................................. 49
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ALT

Alanin amino transferase

AST

Aspartat amino transferase

BHA

Butyled hydroxylanisol

CC50

Cytotoxic concentration


Malonyl dialdehyd

MeOH

Methanol

RCCh

Rong Câu Chỉ

Rf

Retension factor

SD

Standard deviation (độ lệch chuẩn)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TT

Thuốc thử

TLTK

Tài liệu tham khảo


Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học

30

4

Bảng 3.2. Hàm lượng polysaccharid của rong Câu Chỉ

31

5

Bảng 3.3. Hàm lượng lipid của rong Câu Chỉ

32

6

Bảng 3.4. Thành phần các acid béo của rong Câu Chỉ

32

7

Bảng 3.5. Phổ 1H - và 13C - NMR của hợp chất RC1

35

8

43


DANH MỤC CÁC HÌNH
TT

Tên Hình

Trang

1

Hình 2.1. Hình ảnh thu mẫu rong Câu Chỉ

13

2

Hình 2.2. Nguyên tác định lượng MDA trong dịch đồng thể gan

23

3

Hình 3.1. Toàn thân rong Câu Chỉ

25

4


Hình 3.7. Sinh sản dinh dưỡng ở rong Câu (40x)

28

10

Hình 3.8. Hình ảnh bào tử của rong Câu (40x)

28

11

Hình 3.9. Chu trình sống của rong Câu Chỉ

29

12

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất RC1 (cholesterol)

36

14

Hình 3.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất RC2

39

15


hóa và bảo vệ gan trên cả mô hình in vitro và in vivo [26]. Rong Câu Chỉ thu tại
Trung Quốc có tác dụng làm hạ men gan trên mô hình chuột bị gây tổn thương gan
bằng CCl4 [59]. Với mục đích tìm nguồn nguyên liệu ứng dụng trong ngành dược,
chúng tôi tiến hành sàng lọc tác dụng chống oxy hóa in vitro, cho thấy rong Câu Chỉ
có tiềm năng có tác dụng chống oxy hóa. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài:

1


« Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng
sinh học của rong Câu Chỉ (Gracilaria tenuistipitata (Zhang et Xia) –
Gracilariaceae) ở Hải Phòng »
Đề tài thực hiện với 3 mục tiêu:
1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái thực vật, giám định tên khoa học của loài
rong Câu Chỉ.
2. Định tính, định lượng một số nhóm chất chính trong rong Câu Chỉ. Phân lập,
xác định cấu trúc 1-2 chất từ rong Câu Chỉ.
3. Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa in vitro, tác dụng chống oxy hóa và bảo
vệ gan của cắn dịch chiết rong Câu Chỉ.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Gracilaria tenuistipitata trong hệ thống phân loại
Trong hệ thống phân loại thực vật, theo A.L. Takhtajan (1987), vị trí phân
loại của Gracilaria tenuistipitata là:
Giới thực vật: Planta
Phân giới thực vật bậc thấp
Ngành tảo Đỏ: Rhodophyta


Tên Việt Nam

1

Gracilaria arcuata Zanardini

rong Câu Cong

2

Gracilaria blodgettii Harvey

rong Câu Gậy

3

Gracilaria cuneifolia (Okamura) Lee et Kurogi

rong Câu Nêm

4

Gracilaria firma Zhang et Xia

rong Câu Thắt

5

Gracilaria longirostric Chang et Wang


rong Câu Dẹp

11

Gracilaria yamamotoi Zhang et Xia

rong Câu Nan Quạt

12

Gracilaria tenuistipitata Zhang & Xia

rong Câu Chỉ

13

Gracilaria tenuistipitata var liui Zhang & Xia

rong Câu Chỉ Mảnh

Trong đó loài rong Câu Chỉ là loài có phân bố và trữ lượng lớn là rong Câu
Chỉ. Rong Câu Thắt phân bố chủ yếu ở miền Nam và cũng có trữ lượng lớn, còn các
loài khác chỉ có ý nghĩa về mặt đa dạng sinh học. Trong thời gian qua nhiều công
trình công bố liên quan tới nguồn lợi rong Câu như Nguyễn Hữu Dinh, 1969 [4];
Phạm Hoàng Hộ, 1969 [9]; Huỳnh Quang Năng và Nguyễn Hữu Đại, 1978 [11];
Nguyễn Văn Tiến và cộng sự, 1991, 1994, 1996 [12], [14], [13]; Nguyễn Hữu Đại
và Phạm Hữu Trí, 2001 [7], đã cho thấy ngoài nguồn lợi rong Câu khai thác tự
nhiên từ các bãi triều ven biển còn có một nguồn lợi lớn từ nuôi trồng tập ở một số
vùng trọng điểm như hệ thống đầm nhà Mạc (Quảng Ninh), Đình Vũ, Cát Hải,

vào loài, chu kỳ sống, mùa và điều kiện môi trường [50], [22]. Và do quy trình xử
lý, G. tenuistipitata khi chiết không qua xử lý kiềm hàm lượng agar khoảng 17, 1%;
còn khi có xử lý kiềm hàm lượng agar tăng lên khoảng 23,6 – 26,1% [64].
Cấu trúc: agar có thể phân tách thành 2 phân đoạn, agarose và agaropectin.

5


+ Agarose được cấu tạo bởi nhiều đơn vị agarobiose. Agarobiose là
disaccharid của β – D – galactose và 3 - 6 anhydro – α – L – galactose (cấu trúc
được xác định sau khi thủy phân trong môi trường acid. Nếu đem thủy phân bằng
enzyme cấu trúc có khác).
+ Agaropectin,có galactose, anhydrogalactose, L - galactose, nhiều gốc của
aicd uronic và este sulfuric [17].
Theo Hemmingson và cộng sự agar được cấu tạo từ các đơn vị: Dgalactopyranosyl, 6 – O – sulfo – L - galactopyranosyl, 3,6 -

anhydro – L -

galactopyranosyl [38].
Ở Việt Nam:
Rong Câu Chỉ: chứa polysacharid 50% (trong đó agar thô chiếm 22,3%); tro
23,9%; lipid 2% (các acid béo bão hòa, không bão hòa); protein 17% [8].
Hàm lượng agar thu ở các loài chi Gracilaria thu ở nước ta dao động khoảng
23,55 - 46,18% trọng lượng khô (trung bình 40,79%) nếu trồng tại hệ thống đầm
nuôi thủy hải sản. Ở ao, đầm tự nhiên hàm lượng Agar thấp hơn (28,49%) [18].
1.5. Tác dụng sinh học
Ở trong nước, chưa có công trình nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh của rong
Câu Chỉ. Các công trình liên quan tới loài này hiện đã được các nhà khoa học trên
thế giới quan tâm nghiên cứu, đặc biệt ở các nước như Trung Quốc, Thái Lan,
Brazil.

Cắn dịch chiết ethanol 50% G. corticata có LD50 = 1 g /20 g cân nặng chuột,
dùng đường tiêm dưới màng bụng [39].
+ Trên người
Năm 1991, ở Guam có báo cáo 13 trường hợp bị ngộ độc, có 3 trường hợp tử
vong, với các triệu chứng như buồn nôn, nôn, giãn cơ, hạ huyết áp có liên quan tới
loài G. tsudai [37].
Năm 1993, ở Nhật Bản có 2 trường hợp ngộ độc, 1 trường hợp tử vong sau
đó liên quan tới các Protaglandin E2 trong loài G. verrucosa [43].
Năm 1994 ở Hawaii, 7/13 người tham gia chuyến cắm trại có ăn thức ăn chế
biến từ tảo. Cả 7 người này đều có dấu hiệu của bỏng rát họng và bệnh đường ruột
như buồn nôn, nôn và đau bụng. Nguyên nhân được xác định là do 2 chất độc
debromoaplysiatoxin, plysiatoxin có trong loài G. coronopifolia mà họ ăn phải [42].

7


1.5.2. Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan
Có một số công trình nghiên cứu rong Câu Chỉ ở Trung Quốc cho thấy tác
dụng dọn gốc tự do và chống oxy hóa trên mô hình chuột bị gây tổn thương gan.
Cắn dịch chiết nước của G. tenuispititata có tác dụng dọn hơn 60% (63,37 ±
0,91%) gốc tự do DPPH ở tế bào chỉ với liều 4 mg /ml, tỉ lệ này cao hơn khi dùng
10 ppm BHA và 100 ppm acid ascorbic ( p < 0.0001). Cắn dịch chiết nước của G.
tenuispititata có tác dụng ngăn ngừa sự tổn thương ADN, tăng trưởng tế bào và
giúp phục hồi chu kỳ tế bào bị gây ra bởi H2 O2 [63].
Agaro - oligosaccharid, sản phẩm thủy phân trong môi trường acid từ
polysaccharid thu được từ rong Câu Chỉ có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan in
vitro và in vivo. Agaro - oligosacchrid có khả năng dọn gốc tự do đáng kể và cải
thiện khả năng sống của tế bào. Ở nghiên cứu in vivo, trên mô hình chuột bị gây tổn
thương gan bằng CCl4 chỉ ra rằng agaro - oligosaccharid nâng cao hoạt động của
superoxidedismutase (SOD), glutathion peroxidase (GSH-Px), giảm một cách đáng

0
enzym, chiết với kiềm NaOH 0,1M ở 22 C kèm siêu âm, chiết với kiềm NaOH

0,1M ở 220 C có siêu âm và ủ enzyme) của G. birdiae đều cho hoạt tính chống oxy
hóa tương đương với khoảng 41,6 mg đến 75,9 mg acid ascorbic. Cắn dịch chiết
cho hiệu quả nhất là chiết với NaOH 0.1M có siêu âm và ủ men tiêu hóa [30].
Tác dụng dọn 50% gốc oxy hóa (IC50 ) của cao chiết một số loài rong Câu
được trình tại bảng 1.2.
Bảng 1.2. Tác dụng dọn gốc oxy hóa của cắn dịch chiết một số loài rong Câu
Cao chiết
Hexan

Gốc oxy hóa

Loài

IC50

TLTK

DPPH

Gracilaria
manilaensis

1,5 mg /ml

[19]

G. birdiae

G. manilaensis

1,0 mg /ml

G. birdiae
Peroxy lipid

Butanol

G. birdiae

G.domingensis
G. birdiae

[60]

1,2 mg /ml
0,8 mg /ml
1,0 mg /ml
1,5 mg /ml
1,0 mg /ml

G.domingensis

1,4 mg /ml

G. birdiae

>2,0 mg /ml



0,8 mg /ml
1,7 mg /ml

-

OH
80% Methanol

DPPH

1,7 mg /ml

[35]
[52]
[19]

G. changii

14,7 mg /ml

[53]

G. manilaensis

1,6 mg /ml

[19]

Aceton

10


Trên mô hình chuột bị gây viêm gan bởi Rifampicin 1g /kgtt. Cắn dịch chiết
aceton của G. crassia liều 100 và 200 mg /kgtt chuột, làm giảm nồng độ ALT, AST
và billirubin trong huyết thanh chuột và đạt ý nghĩa về mặt thống kê [47].
1.5.3. Tác dụng chống viêm
Trên mô hình in vitro: 800 mg /ml cắn dịch chiết nước của G. tenuistipitata
giảm NO và Protaglandin E2 sản xuất đến 6,3 ± 0,8 µM và 2,8 ± 0,5 ng /ml, tương
ứng, so với lipopolysaccharid kích thích sản xuất NO và Protaglandin E2 đến 14,2 ±
2,2 mM và 6,6 ± 0,9 ng /ml, tương ứng [59].
Trên mô hình Ex-vivo (trên dòng đại thực bào RAW 264.7): cắn dịch chiết
nước G. tenuistipitata làm giảm một cách đáng kể nồng độ NO và Protaglandin E2 ,
các chất tiền gây viêm của cytokin (TNF-α, IL-1β, IL-6) so với lipopolysaccharid
thông qua cơ chế bằng cách ức chế tín hiệu IKK / IκB / NF-κB, và tỉ lệ giảm có phụ
thuộc vào nồng độ. Ở nồng độ 800 µg /ml làm giảm sản xuất TNF-α, IL-1β, và IL-6
từ 3 đến 5 lần so với nhóm dùng với lipopolysaccharid [59].
Trên mô hình chuột bị tổn thương gan do CCl4 : nồng độ chất trung gian gây
viêm iNOS, COX-2 giảm so với nhóm chứng. Các chất tiền viêm của cytokin (NFα, IL-1β và IL-6) trong huyết thanh giảm từ 3,5 đến 4 lần so với nhóm chứng [59].
1.5.4. Một số tác dụng sinh học khác
Cắn dịch chiết nước của G. tenuistipitata (liều 100, 200, 400, 600, 800 và
1000 µg /ml) có tác dụng ức chế sự tổng hợp protein HCV phụ thuộc vào liều sau 3
ngày điều trị do ức chế sự tháo xoắn ARN HCV với EC50 = 300 ± 0,3 µg /ml. Tác
dụng chống virút HCV của cắn dịch chiết nước G. tenuistipitata có EC50 = 325 ± 0,7
µg /ml [27].
1.6. Công dụng theo dân gian, y học cổ truyền của rong Câu
Rong Câu Chỉ là một nguồn lợi từ biển, có nhiều chất dinh dưỡng nên được
dùng để ăn. Ngoài ra rong Câu là nguyên liệu sản xuất agar, dùng trong y học và
công nghệ sinh học [17].
Thạch (agar) có vị ngọt, mặn, tính lạnh, trơn nhầy có tác dụng bổ mát, nhuận

Hình 2.1. Hình ảnh thu mẫu rong Câu Chỉ
Mẫu toàn cây rong Câu Chỉ sau khi thu hái, loại tạp chất, rửa sạch, để ráo,
0
0
cân khối lượng. Tiến hành sấy ở 110 C trong 15 phút, sau đó sấy ở 60 C tới khô, để

nguội. Hàm ẩm của rong Câu khô là 14 %.

13


2.2. Phương tiện nghiên cứu, động vật thí nghiệm
2.2.1. Hóa chất, dung môi
- Hóa chất nghiên cứu thực vật
+ Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: javen, acid acetic, xanh methylen, đỏ son
phèn và nước cất.
- Hóa chất nghiên cứu thành phần hóa học
+ Dung môi, hóa chất dùng để định tính (EtOH 80%, nước cất, Pb(CH3 COO)2 30%,
Pb(CH3 COO)2 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc thử Fehling A và Fehling B,
thuốc thử Lugol, thuốc thử natri nitroprussiat 0,5%, Na2 SO4 khan, tinh thể Na2 CO3 ,
bột magie kim loại, (CH3 CO)2 O, dung dịch gelatin 1%, CHCl3 , HCl đặc, amoniac
đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch NaOH 5%) đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam
IV.
+ Dung môi hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập (EtOH 96%, n-hexan, ethyl
acetat (EtOAc), đạt tiêu chuẩn công nghiệp. Ngoài ra, các dung môi như ethanol, nhexan, ethyl acetat, dùng trong sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao đều
đạt tiêu chuẩn của hóa chất phân tích.
+ Silica gel sử dụng trong tách chiết là loại Merck cỡ hạt 63−200 μm. Bản mỏng
tráng sẵn của Merck loại số 60 F254 . Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước
sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch vanilin, dung dịch H2 SO4
10 % trong EtOH 96% hơ nóng để phát hiện vết chất.

C – NMR, HMBC và HSQC trên

máy Bucker Avance 500 MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàm lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
- Máy móc và thiết bị để thử tác dụng sinh học
+ Máy ly tâm thường Universal PLC – 012E
+ Máy sắc kí khí khối phổ: GC/MS – Aligent 6890N
+ Máy ly tâm Mikro 22 R của hãng Hettich (Đức).
+ Máy đo quang UV - VIS: UV mini 1240 (Shimazu)
+ Máy định lượng sinh hóa Humalyser 2000 của Human (Đức).
+ Máy nghiền đồng thể Ultra Turrak T25 của IKA (Malayxia).
+ Máy định lượng ELISA Lx 800 (Mỹ)
+ Kít định lượng ALT, AST của hãng JAS (Mỹ)
+ Kít định lượng Protein toàn phần của Human (Đức)
2.2.3. Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng
23,0 ± 2,0, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, do Học Viện Quân Y cung cấp.
Chuột được nuôi trong điều kiện đầy đủ thức ăn và nước uống tại Phòng
chăn nuôi, Khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu từ trước khi nghiên cứu 5 ngày
và trong suốt thời gian nghiên cứu theo các tài liệu hướng dẫn thường quy.

15


2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
Mẫu được phân tích trong phòng thí nghiệm của Phòng Sinh thái và Tài
nguyên Thực vật Biển, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển (Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam). Việc định loại chủ yếu dựa vào các tiêu chuẩn về
hình thái ngoài (dưới kính Lúp) và cấu tạo trong. Để nghiên cứu cấu trúc trong căn

được polysaccharid dạng bột, cân khối lượng m (g) [16].
- Tính kết quả: phần trăm hàm lượng polysaccharid của rong Câu Chỉ được
tính theo công thức:
% HLpolysaccharid =
Trong đó:

m x 100
m0 x (100 – Ha)

x 100%

m0 :

khối lượng dược liệu rong Câu Chỉ khô

m:

khối lượng polysaccharid thô thu được

Ha:

hàm ẩm của rong Câu Chỉ khô

2.3.2.3. Định lượng lipid của rong Câu Chỉ
Định lượng lipid trong dược liệu có nhiều phương pháp như: Chiết bằng
dung môi hữu cơ (ether, cloroform), bốc hơi dung môi hữu cơ, cân cặn còn lại và
tính tỷ lệ, sử dụng cụ chiết như Shoxhlet, Zaisenco hay Kumagawa [2]; phương
pháp Folch (1956) [32], phương pháp Bligh & Dyer (1959) [23]. Phương pháp
Bligh & Dyer ưu điểm là thực hiện nhanh, tốn ít dung môi, cho kết quả tin cậy.
Nguyên liệu rong Câu Chỉ chứa hàm lượng nước lớn tới 84%, tỉ lệ lipid nhỏ hơn 2%