TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA

GVHD: Th.S Lê Thị Thu Hương
Th.S Dương Thúc Huy
SVTH : Huỳnh Thị Thuận Vy
MSSV : K38.106.161

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA

GVHD: Th.S Lê Thị Thu Hương
Th.S Dương Thúc Huy
SVTH: Huỳnh Thị Thuận Vy
MSSV: K38.106.161


…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………


LỜI CẢM ƠN



Với tất cả sự trân trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành
nhất đến với:
• Cô Lê Thị Thu Hương và Thầy Dương Thúc Huy đã theo sát, nhiệt tình giảng
dạy, hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình làm khóa
luận tốt nghiệp.
• Tất cả quý thầy cô Khoa Hóa, đặc biệt quý thầy cô Bộ môn Hóa Hữu cơ đã tận
tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian qua và hoàn thành
khóa luận.
• Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên bộ môn Hóa hữu cơ, khoa
Hóa học Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã động viên, giúp
đỡ trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
• Và cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn gia đình, đặc biệt là ba mẹ đã tạo
điều kiện tốt nhất trong suốt thời gian con theo học và thực hiện đề tài ở
Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN


2.2. NGUYÊN LIỆU ..................................................................................................... 8
2.3. QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM ............................................................................. 9
2.3.1. Cô lập các hợp chất trên phân đoạn A3 .......................................................... 10
2.4.2. Cô lập các hợp chất trên phân đoạn A6 .......................................................... 10
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 12
3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT SO1 ........................................................ 12
3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT L1........................................................... 14
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................. 17
4.1. KẾT LUẬN........................................................................................................... 17
4.2. ĐỀ XUẤT ............................................................................................................. 17
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................ 18
PHỤ LỤC

ii


DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

AcOH

Acetic acid

Ac

Acetone

C

Chloroform


gam

H

Hexane

1

H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

Hz

Hertz

kg

kilogam

ppm

Part per million

Me

Methanol

mg

miligam



DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
 HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1 Đông trùng hạ thảo ..................................................................................... 1
Hình 1.2 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự 2009 .............................. 3
Hình 1.3 Các hợp chất cô lập được từ Cordyceps sinensis .................................. 5,6,7
Hình 3.1 Công thức cộng hưởng của SO1................................................................ 12
Hình 3.2 Công thức cấu tạo của SO1 ....................................................................... 13
Hình 3.3 Cấu trúc đường vòng năm của L1 ............................................................. 15
Hình 3.4 Công thức cấu tạo của L1 .......................................................................... 15
Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập được từ cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps ........... 17
 SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1 Quá trình ly trích và cô lập từ cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps
sinensis ...................................................................................................................... 11
 BẢNG BIỂU
Bảng 2.2 Các phân đoạn của cao methanol thô .......................................................... 9
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất SO1 và Uracil ............ 13
Bảng 3.2 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất L1 và Adenosine ........ 16

iv


DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ

Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR của SO1 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 2: Phổ 13C-NMR của SO1 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của L1 trong dung môi DMSO-d 6
Phụ lục 4: Phổ 13C-NMR của L1 trong dung môi DMSO-d 6



miễn

dịch

(immunomodulatory), kháng oxy hóa, kháng viêm, diệt sâu bọ (insecticidal), kháng
khuẩn, hạ lipit trong máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh và thận.
Những nghiên cứu gần đây cho biết các polysaccharide hiện diện trong Cordyceps thể
hiện đa dạng các hoạt tính sinh học như : chống oxy hóa, miễn dịch, chống xơ vữa
động mạch, các nucleoside mang đa tác dụng trên macrophage và cordycepin có hoạt
tính ức chế sự phát triển khối u và miễn dịch. Vì thế, loài nấm này thu hút rất nhiều
nhà nghiên cứu những năm gần đây dựa trên giá trị dinh dưỡng và dược học của nó.
Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của
Cordyceps neovolkiana với mong muốn đóng góp vào việc nghiên cứu các hợp chất tự
nhiên, tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần nâng cao giá trị của các
dược thảo Việt Nam.

vi


Huỳnh Thị Thuận Vy

Khóa luận tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1

KHÁI QUÁT VỀ CHI CORDYCEPS

Các loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm có C. sinensis, C. militaris, C. pruinosa

“Cordyceps sinensis” (Berk.) Sacc. với sâu non (ấu trùng) của một loài côn trùng
thuộc chi Hepialus. Thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus.
Ngoài ra còn 40 loài khác thuộc chi Hepialus cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký
sinh. Tên gọi trên bắt nguồn từ sự thay đổi theo mùa của nó. Vào mùa đông nấm bắt
đầu ký sinh vào sâu non và làm chết sâu non vì ăn hết chất dinh dưỡng của chúng nên
được gọi là đông trùng. Mùa hè vươn lên khỏi mặt đất. Đầu của ngọn nấm là một thể
đệm (stroma) hình trụ thuôn nhọn nên được gọi là hạ thảo. Chỉ phát hiện được Đông
trùng hạ thảo vào mùa hè ở một số cao nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000 m.
Đó là các vùng Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam... Ở Trung Quốc,
đây là vị thuốc có nguồn gốc hàng ngàn năm.[23]
Trong y học cổ truyền Trung Hoa và Tây Tạng, Đông trùng hạ thảo được xem
là có sự cân bằng tuyệt vời giữa âm và dương, bởi nó vừa là thực vật vừa là động vật,
được hình thành vào mùa đông và trưởng thành vào mùa hạ. Cho nên Đông trùng hạ
thảo được xem là một vị thuốc quý, có thể chữa được “bách hư bách tổn”.
1


Huỳnh Thị Thuận Vy
1.2

Khóa luận tốt nghiệp

HOẠT TÍNH CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG CHI CORDYCEPS

Thành phần hóa học của chi Cordyceps được tìm thấy gồm có cordycepin (30deoxyadenosin) và dẫn xuất, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein và peptide có
chứa thành phần aminoisobutyric acid. Các hợp chất này có các hoạt tính sinh học như
kháng

ung



NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CHI CORDYCEPS

Các

hợp

chất

như

cordycepin

(3’-deoxyadenosine),

3’-amino-3’-

deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid và

D-

mannitol đã được cô lập từ các loài nấm thuộc chi Cordyceps từ những năm 1950
[Cunningham và cộng sự (1950);[5] Chatterjee và cộng sự (1957);[2] Kredich và
Guarino (1961);[16] Guarino và Kredich (1963);[7] Kaczka và cộng sự (1964);[10] Liu và
cộng sự (1989).[21]].
Một nguyên cứu gần đây chứng tỏ có sự khác nhau về thành phần và hàm
lượng các hợp chất hóa học giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy. Nấm nuôi cấy chứa
hàm lượng của polysaccharide, adenine và adenosine cao hơn so với các loài nấm tự
nhiên. Li và cộng sự[18,19] cũng tìm thấy nấm C. sinensis nuôi cấy có hàm lượng
nucleoside cao hơn loài tự nhiên.

dụng nhiều phương pháp xác định cấu trúc của polysaccharide từ Cordyceps militaris.

-(1→3)-

→[ 4-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→
]n

→
β-D-Gal-(1→
[ 6)-β-D-Gal-(1 ]3 4)-α-D-Glc
Hình 1.2 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự (2009)
3


Huỳnh Thị Thuận Vy

Khóa luận tốt nghiệp

Gần đây, Yang và cộng sự[29] đã cô lập năm cordysinin A-E (1-5) cùng với bốn
mươi sáu hợp chất đã biết khác từ nấm Cordyceps sinensis nuôi cấy: ergosterol (6),
(17R)-17-methylincisterol (7), ergosterol peroxide (8), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3one (9), fungisterol (10), hỗn hợp của β-sitosterol (11) và stigmasterol (12), hỗn hợp
của β-sitosterol 3-O-acetate (13) và stigmasterol 3-O-acetate (14), 4,4-dimethyl-5αergosta-8,24(28)-dien-3β-ol (15), 3-O-ferulylcycloartenol (16), daidzein (17), phydroxybenzoic acid (18), vanillic acid (19), orobol (20), uracil (21), genistein (22),
D-mannitol

(23), p-methoxybenzoic acid (24), 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25),

acetovanillone (26), p-hydroxyphenylacetic acid (27), cyclo(L-Pro-L-Val) (28),
syringic

acid

N

NH
N

O
HO

N

H
H

O

N

N
H

H
H

HO

Cordisinin A (1)

N

N


Cordisinin E (5)

H
O
H

O
H

H

H

O

HO

H

O

O

HO

(17R)-17-methyl incisterol (7)

Ergosterol peroxide (8)


O

O
H

H
HO

O

O

Stigmasterol 3-O-acetate (14)

ß-sitosterol 3-O-acetate (13)

Stigmasterol (12)

H

H

H

H

CH2
H
O
H

O

OH

Daidzein (17)

H
N

HO
OH

p-hydroxybenzoic acid (18)

HO
O

HO

Vanillic acid (19)

OH

OH

O

Uracil (21)

OH

D-mannitol(23)

p-methoxybenzoic acid (24) 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25)

Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps
5


Huỳnh Thị Thuận Vy

Khóa luận tốt nghiệp

O
CH3

O

O
O

H 3C

HO

HO

O
Cyclo-(L-Pro-L-Val) (28)

O


N

O

O

H

p-hydroxyphenylacetic acid (27)

N
HN

HO

HN
OH

Acetovanillone (26)

OH

N

O
HO

O


O

O

OH
HN

O

N
H

H
N

O

O

OH
N

Thymine (37)
Flazin (39)

N

O
O


H
O

Aib-1

Hyp-1

CH3

N

N

N

N

O

HO

OH

adenosine (50)

HO

R2

adenosine (50)

H
N
OH

O

N

OH
O

1-methylpyrimidine-2,4-dione
(44)
O

Hyp-2

N
H

HO

Succinic acid (42)

3,4dihydroxyacet
ophenone (46)

O

N


HO

O

O

O

Ergosterol 3-O-ß-D-glucoside (38)

H

HO

OH

O

OH

O

NH2

(51) R1 = CH3, R2 = H
(52) R1 = H, R2 = CH3

N
HO



Huỳnh Thị Thuận Vy

H3CO
8

8a

7
6

H3CO

OH
9 9a

10a 10 4a
5

Khóa luận tốt nghiệp

H3CO

H3CO

OH

3



CH3

OH
R2

R2
H3CO

1 O
4 3

1 O

1 O
4

OH

4'

3'
1' O

OCH3 OH

OCH3 OH

(63)


H3CO

OH

OH
O
O
H3CO

H3CO

CH3

CH3
R1

(66) R1 = OH
(67) R1 = H

OH

H3CO

R1

CH3
O
OCH3 OH
(64) R1 = OH
(65) R1 = H

N

OH
13

OH

9

7
8

3

2
13 O

OH

15

14
(69)
OCH3
N

OCH3

H


R
(77)
2
(78) R = p-bromobezoyloxy

14

OH
(80)
(79)

Hình 1.5 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps
7

N

H

H

O

OH

OH
O

N

H


5

O

X

5

(68)
O

O

N

O
H

4

OCH3

OH
6

CH3

4'


2.1.1
Hóa chất

Dung môi dùng trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm: hexane,
ether dầu hỏa, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol đều là hóa
chất của hãng Chemsol-Việt Nam và được làm khan bằng Na 2 SO 4 nếu sử dụng lại
và nước cất.

-

Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung
dịch sulfuric acid 30%, vanillin/H 2 SO 4 .

-

Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột 70- 30, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm, Ấn Độ.

-

Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F 254 Merck.
2.1.2

Thiết bị

-

Các thiết bị dùng để trích ly (lọ thủy tinh, becher, bình lóng).

-


Mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp từ TS. Đinh Minh Hiệp – Ban
quản lý khu Nông nghiệp công nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh.

8


Huỳnh Thị Thuận Vy
2.3

Khóa luận tốt nghiệp

QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

Từ sinh khối nấm tươi 3.5 kg được làm sạch, để khô, nghiền nhỏ thu được bột
khô. Sau đó, bột khô được ngâm dầm trong ethanol ở nhiệt độ phòng. Lấy dịch cô
quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được 200.0 g cao ethanol thô.
Cao ethanol thô sẽ được hòa tan nhiều lần trong methanol nóng, trong quá trình
hòa tan thấy xuất hiện kết tủa, lọc riêng phân tủa (70.0 g). Phần dịch đem cô quay thu
hồi dung môi, thu được cao methanol thô (130.0 g). Sau đó, tiến hành sắc ký cột cao
methanol thô với hệ dung môi với độ phân cực tăng dần thu được tám phân đoạn
tương ứng như bảng 2.1:
Bảng 2.1 Các phân đoạn của cao methanol thô

2.3.1

Hệ dung môi

Cao (g)

H:EA 9:1


Cô lập các hợp chất trên phân đoạn A3

Thực hiện sắc kí cột cao A3 (3.1 g) bằng hệ dung môi H:EA:AcOH
(4.0:1.0:0.2) thu được sáu phân đoạn kí hiệu từ A3.1 đến phân đoạn A3.6. Tiếp tục
sắc kí lớp mỏng điều chế trên phân đoạn A3.5 (210.0 mg) với hệ dung môi
H:EA:Ac:AcOH (7.5:2.5:1.0:0.1) thu được hợp chất SO1 (5.0 mg).

9


Huỳnh Thị Thuận Vy
2.3.2

Khóa luận tốt nghiệp

Cô lập các hợp chất trên phân đoạn A6

Cao A6 (10.0 g) được tiến hành sắc kí cột với hệ dung môi
H:EA:Ac:AcOH:Me (6.0:3.0:0.4:0.2:0.1) thu được bốn phân đoạn kí hiệu từ A6.1 đến
phân đoạn A6.4.
Phân đoạn A6.4 (20.0 mg) tiếp tục được sắc kí cột với hệ dung môi Q:AcOH
với tỷ lệ thể tích v/v 5.0:0.1 với hệ Q là C:Me:W (82.0:11.8:0.2) thu được hợp chất L1
(7.0 mg).

10


Huỳnh Thị Thuận Vy


5.0 g

A3
3.1 g

A4
10.0 g

Me
100%

A5
3.0 g

A6
10.0 g

SKC H:EA:AcOH
4.0:1.0:0.2

A3.1
150.0
mg

A3.2
70.0
mg

A3.3
256.0

A7
30.0 g

A6.2
2.16
g

A6.3
2.30
g

A6.4
3.15
g

SKC Q:AcOH
5.0:0.1

L1
7 mg

Với hệ Q là C:Me:W 82.0:11.8:0.2
Sơ đồ 2.1 Quá trình ly trích và cô lập từ cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps sinensis

11


Huỳnh Thị Thuận Vy

Khóa luận tốt nghiệp


N3 4 5
2 6
1
N

OH
4

H
N3

2

H

HO

H
5

1
N 6 H

H
(B)

(A)

Hình 3.1 Hai công thức cộng hưởng của SO1


HO

N

H

H
B

A

Hình 3.2 Công thức cấu tạo của SO1
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất SO1 và Uracil
Vị trí
1

δ H (ppm)

δ C (ppm)

10.78

2
3

Uracil (DMSO-d 6 )[6]

SO1 (DMSO-d 6 )



142.7

7.41

142.9

13


Huỳnh Thị Thuận Vy
3.2

Khóa luận tốt nghiệp

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT L1

Hợp chất L1 thu được từ phân đoạn A6.3 của cao ethanol với các đặc điểm như
sau:
 Trạng thái: Chất lỏng không màu.
 Bắt UV, hiện hình màu vàng nâu.
 Phổ 1H-NMR (DMSO): Phụ lục 3.

 Phổ 13C-NMR (DMSO): Phụ lục 4.
Biện luận cấu trúc:
Trên phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của hai proton thơm mũi đơn tại δ H
8.33 (1H, s) H-2, δ H 8.11 (1H, s) H-8. Hai proton của nhóm –NH 2 tại δ H 7.32 (2H, s).
Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của các nhóm methine H-2, H-8 chứng tỏ chúng phải
liên kết trực tiếp với dị tố nitrogen. Phổ 1H-NMR còn cho thấy các tín hiệu ở vùng từ
trường từ δ H 3.53 đến 5.85 tương ứng với một phân tử đường.

1'
2'
3'
H
OH

HO

Hình 3.3 Cấu trúc đường vòng năm của L1
Dựa vào sự phân tích các dữ kiện phổ trên và so sánh các dữ kiện phổ của chất
L1 với adenosine đã được công bố thấy có sự tương đồng, do đó hợp chất L1 đề nghị
có công thức như sau:

NH2
6
5

N1
2 3 4
N

7
N
9
N

8
1'

HO

δ H (ppm)

δ C (ppm)

8.33

152.8

8.38

153.2

1
2
3
4

149.6

149.8

5

119.8

120.1

6

156.6

4.64

74.3

3'

4.13 (dd, 5.0, 3.5)

71.1

4.17

71.4

4'

3.93 (q, 3.5)

86.4

3.99

86.6

9

5'

3.64 (dd, 12.0, 3.5)
3.53 (dd, 14.0, 3.5)

62.4