BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ ÁNH
Mã sinh viên: 1101036

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA
DỊCH CHIẾT LÁ CÂY RAU MỎ
(GYMNEMA INODORUM (LOUR. )
DENCE) ĐẾN MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN
GEN CỦA ENZYM G6PASE Ở GAN
CHUỘT THỰC NGHIỆM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ ÁNH
Mã sinh viên: 1101036

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA
DỊCH CHIẾT LÁ CÂY RAU MỎ
(GYMNEMA INODORUM (LOUR. )
DENCE) ĐẾN MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN
GEN CỦA ENZYM G6PASE Ở GAN
CHUỘT THỰC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ



MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................. 3
1.1. Đái tháo đƣờng do tụy (Diabetes melitus) ................................................... 3
1.1.1.

Định nghĩa .......................................................................................... 3

1.1.2.

Phân loại ............................................................................................. 3

1.1.3.

Dịch tễ. ............................................................................................... 4

1.1.4.

Các thuốc điều trị đái tháo đƣờng ...................................................... 6

1.2. Enzym Glucose-6-phosphatase (G6Pase) .................................................... 9
1.2.1.

Cấu trúc .............................................................................................. 9




2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................. 17
2.1.1.

Nguyên liệu ...................................................................................... 17

2.1.2.

Hóa chất ........................................................................................... 18

2.1.3.

Thiết bị ............................................................................................. 19

2.1.4.

Dụng cụ ............................................................................................ 19

2.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 20
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................ 22
2.3.1.

Phƣơng pháp tách chiết ARN .......................................................... 22

2.3.2.

Phƣơng pháp tiến hành phản ứng phiên mã ngƣợc (phản ứng RT) . 22

2.3.3.

3.2.2.

Về khả năng điều hòa biểu hiện gen G6Pase của các mẫu dƣợc


liệu…………………………………………………………………………….36
3.2.3.

Về sự đa dạng trong khả năng ức chế biểu hiện gen G6Pase của các

mẫu dƣợc liệu. ................................................................................................... 37
3.2.4.

Về mối liên quan giữa khả năng ức chế biểu hiện gen G6Pase và tác

dụng hạ glucose máu của các mẫu dƣợc liệu. ................................................... 37
KẾT LUẬN ......................................................................................................... 39
KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADA

American Diabetes Asociation – Hiệp hội Đái tháo đƣờng Hoa Kỳ

ADN

Acid deoxyribonucleic


Glucose-6-phosphat

G6Pase

Glucose-6-phosphatase

GAPDH

Glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase

GI

Gymnema inodorum

GLP-1

Glucagon like peptid 1

IDF

International Diabetes Federation – Liên đoàn đái tháo đƣờng thế
giới

LDL

Low-density lipoprotein

PCR

Polymer chain reaction – phản ứng khuếch đại gen

Trang

Bảng 2.1

Ký hiệu các mẫu sử dụng trong nghiên cứu

18

Bảng 2.2

Thành phần Mix 1 của phản ứng RT

22

Bảng 2.3

Thành phần Mix 2 của phản ứng RT

23

Bảng 2.4

Thành phần Mix của phản ứng PCR cổ điển

23

Bảng 2.5

Chu trình nhiệt phản ứng PCR cổ điển


Bảng 3.3

Mức độ biểu hiện gen G6Pase ở các nhóm khi đánh giá 33
bằng phƣơng pháp realtime PCR


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Tên hình vẽ, đồ thị

STT

Trang

Hình 1.1

Số lƣợng bệnh nhân ĐTĐ (20-79 tuổi) năm 2015

5

Hình 1.2

Cấu tạo của enzym G6Pase

10

Hình 1.3

Cơ chế hoạt động của enzym G6Pase

10


200nm đến 300nm.
Hình 3.2

Hình ảnh điện di gel các mẫu ARN đƣợc tách từ mô

29

gan
Hình 3.3

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen GAPDH ở các nhóm

30

nghiên cứu.
Hình 3.4

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen G6Pase ở các nhóm

31

nghiên cứu.
Hình 3.5

Mức độ biểu hiện gen G6Pase ở các nhóm nghiên cứu khi

32

đánh giá bằng phƣơng pháp PCR cổ điển

sử dụng trong điều trị đều là do kinh nghiệm, các nghiên cứu về GI còn rất hạn chế.
Tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu gần đây nhất của TS. Phùng Thanh Hƣơng và
ThS. Phạm Hà Thanh Tùng về tác dụng hạ glucose máu của 4 loài Gymnema R.Br
cho thấy Gymnema inodorum (Lour. ) Dence có khả năng hạ glucose máu đáng kể
[7]. Điều đó cho thấy đây có thể là một dƣợc liệu đầy tiềm năng trong điều trị ĐTĐ.
Tác dụng của GI đã đƣợc chứng minh, tuy nhiên cơ chế tác dụng của dƣợc
liệu này vẫn còn là một vấn đề tranh cãi. Trên thế giới và Việt Nam đã có những
nghiên cứu ban đầu về cơ chế tác dụng của GI: ức chế hấp thu glucose bằng cơ chế


2

gây giãn cơ trơn ở hồi tràng trên lợn [50], [51], ức chế α-glucosidase ở chuột [1].
Tuy nhiên, trong nghiên cứu của TS. Đào Thị Mai Anh về khả năng ức chế αglucosidase của GI thu hái ở 4 vùng khác nhau, kết quả cho thấy không có sự tƣơng
đồng giữa tác dụng hạ glucose máu và khả năng ức chế α-glucosidase [1]. Dƣờng
nhƣ GI vẫn còn ẩn chứa một cơ chế nào đó chƣa đƣợc tìm ra. Để có thể tiếp tục làm
sáng tỏ cơ chế hạ glucose máu của loài Gymnema inodorum (Lour. ) Dence ở Việt
Nam, góp phần vào việc nâng cao hiệu quả điều trị cũng nhƣ độ an toàn của một
loài dƣợc liệu tiềm năng chúng tôi lựa chọn enzym glucose-6-phosphatase
(G6Pase), enzym chìa khóa trong hệ thống điều hòa glucose máu, một trong những
đích tác dụng quan trọng, cần kiểm soát của các thuốc điều trị ĐTĐ làm đối tƣợng
nghiên cứu cho đề tài của mình. Mục tiêu của đề tài là:
“Khảo sát ảnh hƣởng của các mẫu dịch chiết lá cây rau mỏ (Gymnema
inodorum (Lour. ) Decne) thu hái tại các địa phƣơng khác nhau đến mức độ biểu
hiện gen của enzym G6Pase ở gan chuột”.


3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

 ĐTĐ týp 2: trƣớc đây đƣợc gọi là “ĐTĐ không phụ thuộc insulin”. Chiếm
khoảng 90-95% tổng số bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ. Nguyên nhân là do thiếu
hụt insulin tƣơng đối trên nền kháng insulin.
 ĐTĐ thai kỳ (GDM: Gestational Diabetes Mellitus): ĐTĐ thai kỳ đƣợc định
nghĩa là bất cứ rối loạn dung nạp glucose máu nào khởi phát hoặc lần đầu


4

tiên đƣợc chẩn đoán phát hiện trong thời kỳ mang thai. Nguyên nhân là do sự
thay đổi hormon trong thời kỳ mang thai dẫn tới kết quả là làm tăng kháng
insulin. Trong số phụ nữ có thai thì khoảng 7% mắc phải ĐTĐ thai kỳ, chiếm
khoảng 200,000 bệnh nhân mỗi năm.
 ĐTĐ do nguyên nhân khác nhƣ:


Giảm chức năng tế bào β do khiếm khuyết gen MODY (Maturity Onset
Diabetes of the young – ĐTĐ khởi phát trên bệnh nhân trẻ tuổi, thƣờng trƣớc
25 tuổi).



Giảm hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen IR (insulin receptor).



Các bệnh của tuyến tụy ngoại tiết: bất kỳ vấn đề gì làm tổn thƣơng tuyến tụy
đều có thể gây ra bệnh ĐTĐ, bao gồm: viêm tụy, chấn thƣơng, nhiễm trùng,
ung thƣ biểu mô tuyến tụy.


về đất nƣớc và vùng lãnh thổ thì Trung Quốc đứng đầu về số bệnh nhân ĐTĐ (2079 tuổi) với 109,6 triệu ngƣời, tiếp theo đó là Ấn Độ và Mỹ với 69,2 và 29,3 triệu
ngƣời. Năm 2015, ĐTĐ đã cƣớp đi sinh mạng của 5,0 triệu ngƣời trên thế giới [32].
Không những gây thiệt hại nặng nề về ngƣời mà ĐTĐ còn gây ra gánh nặng
khổng lồ về chi phí điều trị cho ngƣời bệnh, tạo ra áp lực to lớn với nền y tế các
nƣớc. Theo thống kê của IDF 2015, ƣớc tính tổng chi phí cho ĐTĐ trên toàn thế
giới là 673 tỉ USD vào năm 2015 và dự kiến tăng lên 802 tỉ vào năm 2040 [32].


6

Nằm trong bối cảnh chung của thế giới, Việt Nam đang phải đối mặt với tỷ lệ
ĐTĐ ngày một gia tăng. Năm 1992, một nghiên cứu dịch tễ ĐTĐ trong khu vực nội
thành thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ ĐTĐ là 2,8%, sau đó 9 năm (năm
2001) tỷ lệ này đã tăng lên 2,8 lần (6,9%) [22]. Cũng trong năm 2001, điều tra dịch
tễ học bệnh ĐTĐ tiến hành ở 4 thành phố lớn: Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng, Thành
phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ tại 4 thành phố này ở đối tƣợng lứa
tuổi 30-64 tuổi là 4,9% [2]. Năm 2013, trong kết quả công bố của “Dự án phòng
chống ĐTĐ Quốc gia” do bệnh viện Nội tiết Trung ƣơng thực hiện năm 2012 trên
11.000 ngƣời tuổi 30-69 tại 6 vùng gồm: miền núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng,
Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ
lệ mắc ĐTĐ là 5,7% (tỷ lệ cao nhất Tây Nam Bộ là 7,2%, thấp nhất là Tây Nguyên
3,8%) [13].

1.1.4. Các thuốc điều trị đái tháo đƣờng
1.1.4.1. Các thuốc tân dược
Dựa vào cơ chế tác dụng, thuốc điều trị ĐTĐ được chia làm các nhóm sau:
a)

Insulin
Insulin là hormon peptid đƣợc tiết ra từ tế bào β đảo tụy, có vai trò vô cùng

thiện nguyên nhân gây kháng insulin ở mô đích. Bên cạnh đó, PPAR- còn làm
tăng nhạy cảm của insulin thông qua sự thay đổi các hormon đặc hiệu do tế bào mô
mỡ sản xuất (adipokin) [21], [26]. Những tác dụng trên chính là cơ sở cho việc ứng
dụng các thuốc có cơ chế kích hoạt PPAR- vào trong lâm sàng nhƣ nhóm thuốc
thiazolidindion: pioglitazon, rosiglitazon [14], [18].
Ngoài nhóm thiazolidindion, nhóm thuốc chủ vận dopamin-2 với đại diện là
Bromocriptine-QR cũng đã đƣợc ADA xếp vào nhóm có tác dụng giảm kháng
insulin. Tuy nhiên, cơ chế chính xác gây ra tác dụng điều hòa glucose máu của
Bromocriptine-QR đang trong quá trình nghiên cứu [18], [37].
d)

Các thuốc điều trị ĐTĐ khác.
Ngoài các cơ chế liên quan tới insulin thì các thuốc điều trị ĐTĐ còn tác

động lên nhiều đích khác mà hiệu quả làm hạ glucose máu thu đƣợc vẫn rất tốt.
Ức chế α-glucosidase ở ruột có thể làm giảm thủy phân oligosacchrid và làm
chậm quá trình hấp thu glucose vào máu, do đó giúp kiểm soát lƣợng glucose máu
sau ăn. Nhóm thuốc đại diện cho cơ chế này gồm: acarbose, miglitol, voglibose
[18].
Ức chế tái hấp thu glucose ở ống thận: SGLT2 (sodium glucose cotransporter 2) là kênh đồng vận chuyển glucose và natri với vai trò tái hấp thu


8

glucose ở ống lƣợn gần [14], [18]. Ức chế SGLT2 dẫn tới ức chế tái hấp thu glucose
ở thận, tăng glucose trong nƣớc tiểu [18]. Các thuốc trong nhóm này đã đƣợc ADA
khuyến cáo sử dụng trong điều trị ĐTĐ gồm có: canagliflozin, dapagliflozin và
empagliflozin [14].
Giảm tiết glucagon, tăng cảm giác no, chậm tháo rỗng dạ dày làm hạn chế
tăng glucose máu sau ăn, giảm nhu cầu đƣa thức ăn vào cơ thể. Đại diện của nhóm

9

Các sản phẩm thuốc từ thực vật đã đƣợc biết đến từ lâu đời nay. Khoảng 800
loài thực vật đã đƣợc báo cáo là có đặc tính điều trị ĐTĐ, một số thực vật đã đƣợc
sử dụng để ngăn ngừa hoặc điều trị bệnh ĐTĐ ở các nƣớc nhƣ Trung Quốc, Nam
Mỹ, Ấn Độ, Thái Lan [36] và Việt Nam.
Các thuốc điều trị ĐTĐ có nguồn gốc từ thực vật còn có thể khắc phục đƣợc
những nhƣợc điểm của các thuốc tân dƣợc nhƣ: giá thành vừa phải, ít tác dụng phụ,
dễ dàng sử dụng. Một số chế phẩm đã đƣợc sử dụng rộng rãi trên thị trƣờng nhƣ:
Bonidabet (Gymnema Sylvestre, Momordica charantia, Trigonella foenum-graecum
L.), Epinsulin (Pterocarpus marsupium). Ở Việt Nam, các nghiên cứu trên thảo
dƣợc về tác dụng hạ glucose máu cũng ngày càng phát triển, rất nhiều loại thảo
dƣợc đã đƣợc chứng minh có tác dụng hạ glucose máu, ví dụ nhƣ: dây thìa canh
(Gymnema R.Br) [10], bằng lăng nƣớc (Lagerstroemia speciosa L. Pers.) [6], ý dĩ
(Coix lachryma jobi) [3], mƣớp đắng (Momordica charantia) [9], bông ổi (Lantana
camara) [8].

1.2.

Enzym Glucose-6-phosphatase (G6Pase)

1.2.1. Cấu trúc
G6Pase (EC.3.1.3.9) là một chuỗi peptid gồm 357 acid amin (aa) với khối
lƣợng xấp xỉ 36 kDa (ký hiệu là P36). Đây là một peptid có 9 chuỗi xoắn, đầu N tận
nằm trong khoang màng lƣới nội chất (ER) còn đầu C tận nằm trong bào tƣơng
[27], [42] (Hình 1.2). Trung tâm hoạt động của G6Pase có các aa: Lys76, Arg83,
His119, Arg170, và His176. Các aa này đều nằm trong khoang lƣới nội chất (Hình 1.2)
nên hoạt động xúc tác của G6Pase cũng diễn ra trong khoang này [27], [42].




1.2.3. Vai trò của G6Pase ở gan
G6Pase đƣợc biểu hiện chủ yếu ở gan, chỉ một lƣợng rất thấp đƣợc tìm thấy ở
thận, niêm mạc ruột non [38], đảo tụy [30] và xƣơng [28]. Vai trò sinh lý quan trọng
của G6Pase ở gan là điều hòa cân bằng glucose máu trong cơ thể, cụ thể là duy trì
liên tục mức độ ổn định của glucose máu [30]. Khi lƣợng glucose trong máu giảm
xuống, G6Pase sẽ đƣợc hoạt hóa để tăng lƣợng glucose tự do giải phóng vào máu.
Ngƣợc lại, khi glucose trong máu quá cao, enzym này sẽ giảm hoạt động, kết quả là


12

G6P sẽ đƣợc giữ lại trong tế bào gan. Điều này có thể đƣợc thực hiện là do G6Pase
xúc tác cho phản ứng cuối cùng của cả hai con đƣờng sản xuất glucose ở gan là tân
tạo đƣờng và phân giải glycogen [34] (Hình 1.5).

Hình 1.5. Vai trò của enzym G6Pase ở gan [34].
Với vai trò quan trọng nhƣ vậy, G6Pase dù trong trƣờng hợp đƣợc kích thích
quá mức hay bị ức chế thì đều gây ra những tình trạng bất lợi cho cơ thể. Thực
nghiệm cho thấy, đột biến gen làm mất tác dụng của G6Pase sẽ gây ra triệu chứng
hạ glucose máu nghiêm trọng, ngƣợc lại tăng cƣờng hoạt động G6Pase quá mức lại
gây ra triệu chứng tăng glucose máu nhƣ chúng ta thƣờng thấy trong bệnh ĐTĐ
[30].

1.2.4. Các yếu tố điều hòa biểu hiện gen của enzym G6Pase
1.2.4.1.

Yếu tố kích thích biểu hiện gen của enzym G6Pase



Cụm hoa xim, xếp xoắn ốc lên đến 4 cm, cuống cụm hoa 1-2 cm, cuống hoa 1-1,5
cm. Đài thuôn 2-3 × 1,4 mm, ngắn hơn so với ống tràng, có lông măng hoặc lông
mịn. Tràng hoa màu vàng, 6-7 mm, có lông mịn dày đặc phía ngoài. Ống tràng dạng
hình trụ, nhẵn ngoại trừ có các dãy lông dọc theo phần kẽ ống tràng, xen kẽ với các
thùy tràng. Thùy tràng hình chữ nhật, 3-4 × 1,6-1,8 mm, chóp nhọn, nhẵn trừ mép


14

có lông tơ. Khối phấn hình chữ nhật. Đầu núm nhụy có hình thái vòm, thò lên trên.
Quả 2 đại, hình mác, dài 16 × 3, vỏ quả dày, hơi có sợi, vỏ quả nhẵn. Hạt khoảng
1,5 × 1 cm, mào lông khoảng 4 cm. Hình ảnh đặc điểm thực vật của Gymnema
inodorum (Lour. ) Dence đƣợc trình bày trong hình 1.6 [12], [24].

Hình 1.6. Ðặc điểm hình thái Gymnema inodorum (Lour.) Dence

1.3.2.2.


Phân bố

Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam), Ấn Độ, Nepal, Philippin,
Thái Lan [24].



Ở Việt Nam, các nhà khoa học cũng đã phát hiện thấy Gymnema inodorum
(Lour.) Dence xuất hiện ở nhiều vùng nhƣ: Nam Bộ, Nha Trang, Bắc Kạn,
Thái Nguyên, Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Hà Nội [4].