VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC ỨNG DỤNG
CHO LÊN MEN KIM CHI GỪNG

Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Thị Việt Anh
Sinh viên thực hiện: Đình Đại Dương
Lớp

: 12 - 03

HÀ NỘI – 2016


LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự
hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người khác.
Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay,
em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình
và bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở khoa
Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại Học Mở Hà Nội đã cùng với tri thức và
tâm huyết của mình. Và đặc biệt, trong học kỳ này. Nếu không có những lời
hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em rất
khó có thể hoàn thiện được. Em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc TS. Nguyễn Thị
Việt Anh đã tận tâm hướng dẫn chúng em trong suốt quá trình trực tập,
nghiên cứu và thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn
ThS. Hà Thị Phương và các cô, chú, anh, chị công tác tại bộ môn Công nghệ

1.2.2.1. Ở Việt Nam. ................................................................................19
1.2.2.2. Trên thế giới................................................................................20
1.2.3. Nguyên liệu gừng và các sản phẩm từ gừng. .....................................20
1.2.3.1. Nguyên liệu gừng. .......................................................................20
1.2.3.2. Sản phẩm từ gừng. ......................................................................22
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................24
2.1. VẬT LIỆU. .............................................................................................24
2.1.1. Mẫu thí nghiệm. ................................................................................24
2.1.2. Hóa chất. ...........................................................................................24
2.1.3. Máy móc dụng cụ..............................................................................25
2.1.4. Môi trường cơ bản sử dụng trong nghiên cứu....................................25
2.2. PHƯƠNG PHÁP. ...................................................................................26
2.2.1. Phương pháp vi sinh..........................................................................26
2.2.1.1. Phương pháp lấy mẫu, làm sạch, phân lập. ..................................26


2.2.1.2. Phương pháp nhuộm Gram (Nhuộm kép)....................................27
2.2.1.3. Xét nghiệm catalaza. ...................................................................28
2.2.1.4. Phương pháp đo độ đục bằng máy quang phổ khả biến. ..............29
2.2.1.5. Phương pháp bảo quản giống. .....................................................30
2.2.2. Phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh. ...........................................31
2.2.2.1. Phương pháp chuẩn acid. ............................................................31
2.2.2.2. Phương pháp xác định thành phần chất xơ. .................................32
2.2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng ẩm của nguyên liệu gừng. ......33
2.2.2.4. Phương pháp xác định lượng tinh dầu trong gừng. ......................34
2.2.3. Phương pháp lên men thử nghiệm kim chi gừng. ...........................35
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. ........................................................37
3.1. PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC TỪ NGUỒN THỰC
PHẨM LÊN MEN. ........................................................................................37
3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ



DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 3. 1. Khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ muối, nồng độ
gừng cao của các chủng vi khuẩn lactic. ...........................................................41
Hình 3. 2. Hình thái các chủng lactic. ...............................................................42
Hình 3. 3. Hình thái các khuẩn lạc. ...................................................................43


LỜI MỞ ĐẦU

Lương thực, thực phẩm là nhu cầu không thể thiếu của con người.
Chính vì vậy mà con người luôn tìm cách chế biến lương thực thực phẩm
thành những dạng thực phẩm khác nhau, rất đa dạng và phong phú. Từ lâu,
các sản phẩm lên men là một trong những sản phẩm truyền thống đã phổ
biến khắp nơi trên thế giới.
Ngoài hương vị đặc trưng, các sản phẩm lên men còn có tác dụng chữa
bệnh như yaourt giúp tiêu hóa tốt, phòng bệnh đường ruột. Đặc biệt các sản
phẩm muối chua rau quả với quá trình lên men đường trong nguyên liệu rau
quả bởi vi khuẩn lactic, có tác dụng tạo hệ vi khuẩn có ích cho đường tiêu
hóa. Rau quả muối chua tuy không phải là thuốc thuần túy nhưng dùng làm
thức ăn rất tốt cho người mắc chứng béo phì, tiểu đường ... vì nó ít glucid và
khả năng sinh nhiệt thấp. Bên cạnh đó, kim chi gừng còn mang đến cho chúng
ta rất nhiều lợi ích. Trong mùa hè nóng bức, dịch vị dạ dày giảm, do đó ảnh
hưởng đến sự thèm ăn. Trước bữa ăn, nếu ăn một vài lát gừng, sẽ có tác dụng
kích thích nước bọt, tăng tiết dịch và nhu động dạ dày, nhờ đó tăng cảm giác
ngon miệng. Điều này cũng là lý giải cho câu nói "Mùa đông ăn củ cải, mùa
hè ăn gừng”. Gừng chứa các hợp chất cấu trúc diphenyl heptan, một chất
chống oxy hóa mạnh mẽ. Nhờ đó, trà gừng nói riêng và các món có chứa
gừng rất có lợi cho sức khỏe trong việc chống lại hiệu ứng phá huỷ tế bào bởi

1.1. VI KHUẨN LACTIC.
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu vi khuẩn lactic.
Qua nhiều thế kỷ các nhà khoa học trên thế giới đã dần khám phá ra những
bí ẩn về vi khuẩn lactic.
Năm 1780, nhà hóa học Thụy Điển Scheele đầu tiên tách được acid lactic
từ sữa bò lên men.
Năm 1847, Blondeau đã công nhận acid lactic là sản phẩm cuối cùng của
chuỗi phản ứng lên men.
Năm 1857, Louis Paster đã chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả
hoạt động của một nhóm vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn lactic.
Năm 1873, Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặt tên là
Bacterium lactic (nay gọi là Streptococcuss lactic).
Năm 1906, Metchnikoff xuất bản cuốn “The problongation of life
optimistic studies”. Ông chứng minh rằng vi khẩn lactic trong sữa chua
(yoghurt) như là nhân tố chống lại sự thối rữa ruột và sự lão hóa. A.L Cantri
đã ứng dụng vi khuẩn lactic để điều trị bệnh bàng quang.
Hiện nay, lên men lactic có nhiều ứng dụng trên quy mô lớn và các dạng
vi khuẩn lactic được sử dụng đòi hỏi phải thuần khiết và có hoạt tính sinh học
cao. Trong đó một số loài thuộc chi Lactobacillus và Streptococcus được sử
dụng nhiều nhất.

3


1.1.2. Đặc điểm chung về vi khuẩn lactic.
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái.
Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriaceae, mặc dù nhóm
vi khuẩn này không đồng nhất về mặt hình thái (gồm cả hình que, hình cầu...).
Kích thước và hình dạng của các vi khuẩn lactic rất khác nhau ở các chi
khác nhau. Sự thay đổi về hình dạng và kích thước tế bào thường xảy ra trong


CO2

oxalaxetat

pyruvat

axetaldehyt

α - axetolactat

2,3 Butylenglycol

acetoin

Diaxetyl

Mặc dù vi khuẩn lactic có thể phát triển trên môi trường hiếu khí nhưng
chúng không thu nhận năng lượng nhờ quá trình hô hấp. Điều này chứng tó
chúng không tổng hợp được nhân hem, do đó không có cytocrom hay những
enzyme chứa nhân hem khác. Chúng có thể tiến hành một số phản ứng oxy
hóa một số ít các hợp chất hữu cơ khác nhờ enzyme flavoprotein. Các phản
ứng này không kèm theo việc tổng hợp ATP.
Nhiều loại vi khuẩn kỵ khí chết rất nhanh khi tiếp xúc với không khí.
Ví dụ: Clostridia sinh ra H2O2 trong tế bào ở điều kiện hiếu khí không
được giải độc vì các vi khuẩn này thiếu cytocrom. Riêng ở vi khuẩn lactic tuy
catalaza âm tính song lại có một enzyme khác là peroxydase bản chất là
flavoprotein. Enzyme này là trung gian xúc tác các quá trình oxy hóa các cơ
chất hữu cơ dưới tác dụng của H2O2. Nhờ đó vi khuẩn lactic vẫn có khả năng
sinh trưởng trong môi trường hiếu khí. Đây cũng là đặc điểm quý báu để nhận

đối với nhiều acid amin, nhiều base nucleic, nhiều loại vitamin... Không một
đại diện nào thuộc nhóm này có thể phát triển trên mooii trường muối khoáng
thuần khiết chứa glucoza và NH4+. Đa số chúng cần hàng loạt vitamin

6


(lactoflavin, thiamin, acid pantotenic, acid nicotinic, acid folic, biotin) và các
acid amin.
Nhu cầu về cacbon.
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại hydratcacbon khác nhau để
đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cacbon của chúng. Chúng có thể sử dụng hexose
(glucose, fructose, mantose, galactose), các đường đôi (saccarose, lactose,
mantose) và cả các polysaccarit (tinh bột, dextrin). Tuy nhiên nguồn cacbon
quan trọng nhất đối với vi khuẩn lactic vẫn là monosaccarit và disaccarit.
Chúng được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh
ra các acid hữu cơ như acid lactic, malic, pyruvic, fumaric, acetic... Nhu cầu
cacbon còn tùy thuộc vào từng loài vi khuẩn, chẳng hạn như Lactobacillus
delbrueckii có thể sử dụng đường maltose; còn Lactobacillus bulgaricus có
thể sử dụng lactose nhưng không sử dụng được maltose và saccarose; một số
loài còn sử dụng được cả đường dextrin. Trong quá trình lên men ngoài việc
sử dụng các hợp chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic còn có thể sử dụng các
acid amin như: arginin, tizonin, gluconic làm nguồn cung cấp năng lượng.
Nhu cầu về Nitơ.
Nitơ có mặt trong tất cả các thành phần quan trọng của tế bào như protein,
enzyme... vì thế vi khuẩn lactic cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ
để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng và phát triển, tham gia vào xây dựng
cấu trúc tế bào. Một số vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp các hợp chất
hữu cơ phức tạp chứa nitơ, vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình
chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít vi

8


Ảnh hưởng của oxi.
Vi khuẩn lactic thuộc nhóm hô hấp tùy tiện, từ kỵ khí đến vi hiếu khí. Đặc
điểm này bị quy định bởi sự không có mặt của hệ enzyme oxi hóa - khử
cytocrom và catalaza trong tế bào.
Tuy nhiên vi khuẩn lactic vẫn có thể oxy hóa một số chất theo cách sử
dụng oxy phân tử là vì chúng có hệ enzyme oxy hóa FAD (Flavin Adenin
Dinucleotit), hệ enzyme peroxydase nội bào, có thể thực hiện các chức năng
thay cho hệ enzyme dehydrogenase để vận chuyển ion H+, khi đó oxi được sử
dụng như là chất nhận hidro. Quá trình oxy hóa ở vi khuẩn lactic xảy ra
thường kèm theo sự hình thành H2O2. Một số vi khẩn như Streptoccocus
mastitidis, Streptoccocus faecalis, Streptoccocus brevis, Leuconostoc
mensenteroides có thể khử được H2O2 thành nước cùng với sự tham gia của
một số chất bị oxy hóa.
Ảnh hưởng của oxy đôi khi còn phụ thuộc cả vào nhiệt độ. Ví dụ như một
số chủng của loài Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri phát triển tốt ở
300C trong điều kiện hiếu khí và yếm khí, trong khi ở 370C nó chỉ phát triển
trong điều kiện hiếu khí.
Ảnh hưởng của nhiệt độ.
Nhiệt độ có ảnh hưởng có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi khuẩn
lactic. Khoảng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng: một số loài có
thể phát triển ở 550C trong khi một số khác có thể phát triển được ở 50C. Nói
chung đa số vi khuẩn lactic có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 150C
đến 400C. Ví dụ như: Lactobacillus delbrueckii nhiệt độ thích hợp là 400C;
Lactobacillus peatose có khoảng nhiệt độ tối ưu là 25 – 300C; Lactobacillus
casei từ 28 – 320C; các loài thuộc Streptococcus nhiệt độ tối ưu ở 450C.

9

triển ở 100C. Kích thước của các loài thuộc Streptococcus không giống nhau,
đôi khi ta còn trông thấy nó có dạng ovan dẹt, kéo dài trông gần giống như
trực khuẩn. Để phân biệt những loại gây bệnh và không gây bệnh, người ta
chia chúng thành 3 nhóm nhỏ hơn: Lactococcus đại diện là những vi khuẩn
lên men sữa; Enterococcus gồm những vi khuẩn sống trong phân và phần còn
lại là Streptococcus.
- Nhóm Leuconostoc: Có dạng hình cầu, nhưng trong môi trường có tính
acid như trong dịch quả thì chúng có dạng ovan hoặc dài hơn. Kích thước 0,5
– 0,8 x 1,6 µm. Đôi khi ta trông thấy hình chuỗi gồm nhiều cầu nối tiếp nhau
dài 1- 3µm. Đây là loại lên men dị hình, thường tạo ra rất ít acid lactic và
acetic, nhưng lại tao ra một lượng cồn và CO2 tương đối.
- Nhóm Pediococcus: Có tế bào hình cầu sắp xếp riêng rẽ, chum lại
thành đôi hoặc bộ bốn, có thể hình thành các chuỗi ngắn. Loại vi khuẩn này
thường bắt gặp trong nước hèm hoặc bia. Chúng thuộc loại hô hấp vi hiếu khí
sử dụng đường glucose sinh acid, không sinh khí, tổng hợp acid dạng L(+) và
DL. Kích thước d: 0,6 – 1,3 µm.
- Nhóm Lactobacillus: Quan sát dưới kính hiển vi thì dạng hình que là
phổ biến nhất. Chủng vi khuẩn này có kích thước thay đổi từ ngắn đến dài,
điều này phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Ví dụ như Lactobacillus casei
có dạng hình que ngắn, có khi lại trông thấy là hình que dài, mảnh hơi cong,
xếp thành chuỗi.
Trong điều kiện kỵ khí, chúng chuyển hóa glucose chủ yếu sinh acid
lactic. Trong điều kiện vi hiếu khí sản phẩm dị hình thường là acid propionic,
butyric, cồn và CO2. Tuy nhiên, sự khác nhau về hình thái còn tùy thuộc vào
môi trường cấy, sự có mặt CO2 cũng như điều kiện nuôi cấy.
Hiện nay, các loài vi khuẩn lactic được phân thành 4 chi sau:
11


Bảng 1. 1. Đặc điểm bốn chi

Dị hình

D-lactic

Đồng
hình

DL-lactic

Tuỳ loài

Tuỳ loài

b. Phân loai theo hình thái lên men.
Những nghiên cứu về hệ thống học đầu tiên của vi khuẩn lactic được Orla
Jensen tiến hành vào năm 1920. Theo ông có thể chia vi khuẩn lactic làm hai
loại: vi khuẩn lactic lên men đồng hình và vi khuẩn lactic lên men di hình.
Lên men lactic đồng hình.
Các vi khuẩn lên men lactic đồng hình phân giải đường theo con đường
EMP và cho sản phẩm chủ yếu là axit lactic (90 - 98%). Chỉ một phần nhỏ
piruvat được decacboxyl hoá và chuyển hoá thành axit axetic, ethanol,
axetoin và C02. Mức độ tạo thành các sản phẩm này phụ thuộc vào sự có mặt
của O2.
Vi khuẩn lactic lên men đồng hình có ý nghĩa lớn trong công nghiệp vì để
đảm bảo đủ năng lượng cho hoạt động sống, đồng thời cung cấp năng lượng
cho sinh trưởng phát triển, chúng phân giải một lượng đường lớn và tạo thành
một lượng lớn axit lactic. Đây là một sản phẩm có vai trò quan trọng trong
công nghiệp thực phẩm.
12


(khoảng 40%). Ngoài ra, tùy theo từng loài có thể tạo thêm các sản phẩm
khác như: acid sucsinic và rượu etylic (20%), acid acetic(10%), các chất khí
còn lại (20%).
Do tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời như vậy cho nên việc tách và cô lập
riêng các sản phẩm này là rất phức tạp. Các chủng vi khuẩn dị hình không
được ứng dụng trong sản xuất lactic ở quy mô công nghiệp nhưng lại thích
hợp với các sản phẩm tạo mùi vị đặc trưng trong các sản phẩm thực phẩm lên
men cổ truyền.

13


Đại diện của nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình là: Leuconostoc
mensemteroides, Leuconostoc cremoris.
Phương trình tổng quát lên men dị hình:

C6H12O6

2CH3CHOHCOOH + C2H5OH + CO2

14


SƠ ĐỒ PHẢN ỨNG LÊN
LÊN MEN ĐỒNG HÌNH

LÊN MEN DỊ HÌNH

C6H12O6 = 2CH3CHOHCOOH



Glixerin + H3PO4

Axit 3 diphospho - glixeric
Axetyl phosphat
Axit 2 diphospho - glixeric

Axit lactic

Axit phosphoenolpyruvic

Axetaldehyt

Piruvat

Ethanol

15

Axetat


1.1.3. Những ứng dụng của vi khuẩn lactic.
Vi khuẩn lactic được ứng dụng rất rộng rãi trong công nghiệp chế biến
sữa. Công nghiệp sản xuất axit lactic, công nghiệp chế biến, bảo quản rau quả
và thức ăn gia súc. Nhiều giống vi khuẩn lactic thuần khiết được sử dụng
trong công nghiệp như: Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc,
Pediococos, Lactococcus.
Trong công nghiệp chế biến sữa vi khuẩn lactic có vai trò quyết định và
tạo hương vị cho sản phẩm. Nhờ chúng mà người ta có thể chế biến được

con người, tăng cường tính miễn dịch, giảm lượng colesteron trong máu, tác
dụng chống ung thư và tăng canh tranh với vi sinh vật gây hại.
Đặc biệt những năm gần đây, cùng với việc tìm kiếm chất kháng sinh mới
lại phát hiện thêm được tính quý giá nữa của nhóm vi khuẩn này. Đó là khả
năng sinh tổng hợp bacteriocin. Một loại polypeptit được tổng hợp ở riboxom
của vi khuẩn lactic. Có khả năng ức chế các vi khuẩn Gram dương, đã mở ra
khả năng ứng dụng to lớn của vi khuẩn lactic trong công nghiệp thực phẩm,
bacteriocin cũng như vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được sử dụng có hiệu
quả cao trong bảo quản thực phẩm để kéo dài thời hạn sử dụng.
1.1.4. Vai trò của vi khuẩn lactic trong bảo quản thực phẩm và chế biến
thực phẩm.
Đã từ lâu con người đã biết bảo quản thực phẩm nhờ quá trình lên men
lactic. Cho đến nay, con người đã tạo ra rất nhiều sản phẩm lên men lactic từ
sữa, thực vật và động vật. Quá trình lên men này đã tạo ra một lượng axit
lactic làm thay đổi pH của môi trường nhờ đó sản phẩm không bị thối, hỏng
do các loại vi sinh vật khác không chịu được pH axit này. tuy nhiên, người ta
thấy rằng nếu chỉ sử dụng axit lactic từ một cách riêng rẽ thì không tạo ra
hiệu quả này. Điều kiện cần thiết để axit này phát huy sức mạnh là nó phải
được tạo ra đồng thời với sự hình thành một lượng nhất định axit axetic. Axit
17


propionic, axit béo, diaxetyl, H202, etanol và các kháng sinh bactenoxin như
nisin, lactocin, sakacin, bulgaricin, plantacin... Những chất này tương tác với
nhau tạo nên hiệu quả phối hợp.
Đặc tính của quá trình lên men lactic gợi mở ý tưởng về việc sử dụng
phương pháp bảo quản nhân tạo hiện nay. Người ta đang nghiên cứu việc sử
dụng cả hai biện pháp hoặc là bổ sung các chất tinh chế kể trên hoặc là bổ
sung cách dùng vi khuẩn lactic vào thực phẩm.
Một hướng ứng dụng có hiệu quả trong việc bảo quản thực phẩm là cấy vi

lên men, nên khi sử dụng tạo cảm giác khoan khoái, đỡ khát hơn. “ Kim chi”
gừng, bản chất là sự lên men của gừng. Cũng tương tự như các sản phẩm lên
men lactic khác. Kim chi lên men từ cải thảo, củ cải, tỏi, ớt... Dưa muối lên
men từ cải bẹ, bắp cải... Ngày nay, kim chi gừng dần trở lên phổ biến hơn với
mọi người. Nó mang đến cho người sử dụng nhiều lợi ích. Ngăn chặn sự tạo
thành cục máu đông, nhờ đó có thể ngăn ngừa chứng đau thắt ngực, nhồi máu
cơ tim. Chữa nôn mửa, không gây phản ứng phụ như các thuốc chống nôn
hóa dược. Giúp hệ thống tiêu hóa làm việc tốt hơn nhờ khả năng kích thích
tiết nước bọt, dịch mật, kích thích sự vận chuyển trong đường tiêu hóa.
Chống phù nề, giảm đau, chống hen...
1.2.2. Tình hình sản xuất “kim chi”.
1.2.2.1. Ở Việt Nam.
Mặc dù món ăn kim chi đã đến Việt Nam từ lâu nhưng cho đến hiện nay
kim chi hầu như chỉ được làm ở quy mô gia đình để cải thiện bữa ăn chứ
không mang mục đích dự trữ như Hàn Quốc. Cũng đã có một vài công ty chế
biến kim chi và bán cho các đại lý phân phối nhưng vẫn chưa phổ biến và
mặt hàng chưa đa dạng chủ yếu là kim chi từ cải thảo.

19