BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SỰ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
------------------------

Nguyễn Thị Lan Hương

TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT
KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA MỘT SỐ
CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN
CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT
Mã số: 604240

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS.TRẦN THANH THỦY

Tp.Hồ Chí Minh - 2009


Trang 1

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp
đỡ tôi từ khi thực hiện luận văn tốt nghiệp đến khi thực hiện luận văn thạc sĩ sinh
học. Cô luôn có mặt bên cạnh, giúp đỡ những khi em gặp khó khăn trong suốt quá
trình nghiên cứu, thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin ghi nhớ công ơn PGS.TS. Lương Đức Phẩm đã luôn tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong phòng thí nghiệm Vi sinh –
Sinh hóa, trường Đại học Sư phạm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành

đúng mức. Trong số các VSV tại đây thì NS chiếm số lượng rất lớn, giữ vai trò
quan trọng trong tuần hoàn vật chất và năng lượng nhờ có hệ enzym phong phú như
cellulase, protease, amylase,…
Nổi bật nhất cũng như được ứng dụng nhiều nhất trong hệ enzym thủy phân
của NS là amylase. Loại enzym phân giải tinh bột này mang lại vị ngọt cho thiên
nhiên và con người đã được nghiên cứu từ rất lâu, đến nay các nhà khoa học đã biết
khá rõ về nó. Hiện nay amylase là một trong những hệ enzym quan trọng nhất của
ngành công nghệ sinh học vì chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
khác nhau như công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp lên men, công
nghiệp dệt,..Tiếp tực tìm hiểu, khám phá những bí ẩn về cấu trúc và đặc tính của
amylase để nâng cao hiệu suất xúc tác của chúng là đề tài hấp dẫn đối với nhiều nhà
nghiên cứu.
Tuy vậy, nước ta chưa lưu ý nhiều đến lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất các
chế phẩm amylase từ VSV cũng như NS. Việc sản xuất amylase từ NS có rất nhiều
ưu việt như rút ngắn quá trình sản xuất, tận dụng được các nguồn nguyên liệu, phế
phẩm nông nghiệp góp phần giảm ô nhiễm MT, enzym có hoạt tính cao và giảm giá
thành sản phẩm.... so với các enzym có nguồn gốc từ TV và ĐV. Đặc biệt nếu thu
được các chủng NS có khả năng sinh amylase cao và sinh trưởng trong những điều
kiện khắc nghiệt như RNM Cần Giờ sẽ rất có ích vì bổ sung thêm được những


chủng NS có đặc tính quý, đầy tiềm năng và ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn
nuôi. Mặc dù vậy, việc nghiên cứu NS sinh amylase từ RNM hiện vẫn chưa được
khai thác đúng mức.
Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận amylase từ NS, cũng
như mong muốn thu nhận được nguồn amylase mang đặc tính quý, chúng tôi tiến
hành đề tài “Tuyển chọn và khảo sát khả năng sinh amylase của một số chủng
NS từ RNM Cần Giờ Tp.HCM”.
Mục đích của đề tài.
Tuyển chọn được các chủng NS sinh amylase cao từ RNM Cần Giờ.

Nam trên 400.000 ha, đến năm 1996 giảm còn 290.000 ha và 279.000 vào năm
2006. Với diện tích này thì RNM Việt Nam cũng chiếm một phần khá lớn trong khu
vực. RNM nguyên sinh tự nhiên hiện nay hầu như không còn. Đa số RNM hiện nay
là rừng trồng (62%) còn lại là rừng thứ sinh nghèo hoặc rừng mới tái sinh trên bãi
bồi. HST RNM phân bố dọc bờ biển Việt Nam thuộc 28 tỉnh và thành phố, tập trung
chủ yếu ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, bán đảo Cà Mau và hai tỉnh phía Bắc
là Nam Định và Thái Bình. Các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long có diện tích RNM
chưa đến 100.000 ha. Riêng RNM Cần Giờ hay rừng Sác, sau những nỗ lực khôi
phục thành công, hiện nay có diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha [74].
Với diện tích đạt được như trên, cùng với độ đa dạng sinh học bậc nhất trong
các RNM ở Đông - Nam Á , RNM Cần Giờ đã được Tổ chức Văn hóa, Khoa học và
Giáo dục LHQ (UNESCO) công nhận là Khu dự trữ sinh quyển của thế giới từ
tháng 1-2000. Đây cũng là Khu dự trữ sinh quyển RNM đầu tiên của nước ta và
cũng được xem lá “lá phổi” rất quan trọng của Tp.HCM [69].
Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng
Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Tp.HCM:
Về tọa độ địa lý: vĩ độ Bắc 10o22’ – 100o40’09”, kinh độ Đông 106046’ –
107°00’59”.
Về ranh giới, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển
Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa –
Vũng Tàu. Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35km, từ Đông sang Tây là


30km. Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó:
vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [5].
RNM Cần Giờ phát triển trên nền một đầm mặn mới, do phù sa sông mang
đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng
tụ trầm tích đất sét, phèn hóa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết
chặt nên không có khả năng tạo thành đất nền rắn chắc, có hàm lượng lưu huỳnh
dạng khử khá cao và một lượng muối cao không có lợi cho nông nghiệp [21].

Hình 1.1. Bản đồ tổng quan về RNM Cần Giờ và vị trí 5 xã thu mẫu [65]
Ký hiệu

: vị trí thu mẫu.

Do những đặc điểm trên, RNM Cần Giờ có vai trò là “lá phổi xanh” làm
giảm ô nhiễm MT, giảm sự nóng lên của Trái đất và ngăn ngừa tình trạng dâng lên
của nước biển. RNM Cần Giờ còn là “chiếc lọc sinh học” trong xử lý chất thải, xử
lý chất dinh dưỡng từ đất liền và giữ vai trò vùng đệm chống lại các dòng chảy ô
nhiễm đồng thời lọc thức ăn cho các ĐV biển; giúp bảo vệ các loài ĐV trên đất liền
khi nước triều lên cao và sóng lớn; bảo vệ bờ biển và cửa sông tránh tình trạng tác
hại và xói lở của bão, sóng đối với hệ thống đê biển, giảm chi phí tu bổ đê điều
hàng năm; là nơi có lợi nhuận kinh tế cao, cung cấp nguồn hải sản phong phú để sử
dụng trong nước và xuất khẩu cũng như các nguồn lợi khác từ rừng,....RNM chính


là HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST, nơi hội tụ sự đa dạng của cả
SV biển và đất liền. Vì thế, nó còn là PTN sống để nghiên cứu về khả năng chịu
đựng và phục hồi của các tổ hợp gen, khả năng phát tán và định cư của các dạng
sống [74].
1.2. Sơ lược về NS.
1.2.1. Hình thái và cấu trúc NS.
NS là VSV có nhân chuẩn, dị dưỡng. Sợi nấm có thể có vách ngăn như các
lớp nấm bậc cao như Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes hay không có
vách ngăn như các nấm bậc thấp Oomycetes và Zygomycetes. Các sợi nấm vừa phát
triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn và phân nhánh tạo hệ sợi nấm còn gọi là
khuẩn ty. Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn,
lỏng hay mềm. KL NS phát triển từ một bào tử có dạng tròn hay gần tròn. Bề mặt
KL có thể mượt, nhung mịn, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp,
phẳng, có vết khía xuyên tâm, có rãnh hay lồi lõm không đều; mép KL có thể trơn

sinh trưởng phát triển và tổng hợp enzym của VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào
khí hậu bên ngoài, nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzym theo quy mô công
nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm (đây là lợi thế rất quan trọng) và VSV có thể sinh tổng
hợp cùng một lúc nhiều loại enzym khác nhau. Ngày nay, nhiều loại enzym ngoại
bào của NS đã được nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng phổ biến như: amylase,
protease, cellulase, pectinase, chitinase,....[9, 25].


 Khả năng sinh các chất KS.
KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV
với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển
của VSV khác. KS được tạo ra từ VSV đang rất được quan tâm và ngày càng phát
triển mạnh mẽ trong thời đại hiện nay.
Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỉ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp Nấm
bất toàn. Các chất KS được sử dụng chủ yếu trong y tế hiện nay như Penicillin,
Cephaco-sporin-C,...[11].
 Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng [19,73].
Ngày nay, nhu cầu sử dụng các axit hữu cơ ngày càng nhiều trong thực
phẩm, công nghiệp. Một số axit hữu cơ phổ biến được sản xuất từ NS như: axít
xitric từ Asp.niger; axít gluconic thu nhận từ Asp.niger và Asp. foetidus; axít lactic
sản xuất từ Rhizopus oryzae (Mattey, 1992).
Tại Nhật Bản, các nhà khoa học đã tổng hợp được chất kích thích sinh
trưởng Giberelin từ hai chủng NS Furasium monoforme và Furasium oxysporum.
Ngoài lên men sản xuất KS, enzym, các axit hữu cơ,..., Penicillium
chrysogenum và Asp. niger còn tạo ra một lượng lớn sản phẩm phụ của sự lên men.
Khuẩn ty của nấm không độc là một thành phần thức ăn lý tưởng bởi vì nó có hàm
lượng đạm thô cao (xấp xỉ 12% trên trọng lượng tươi). Khuẩn ty được sử dụng như
thành phần thức ăn gia súc. NS cũng được sử dụng làm giàu thêm đạm cho thức ăn
gia súc,....
Tuy vậy, rất nhiều loài NS cũng gây ra những tác hại cho đời sống như mọc

này dao động trong khoảng 40 – 70oC và kéo dài 30 giây đến 1 phút.
- Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được nâng lên đến 72oC để DNA polymerase
hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình
tự DNA, thường kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút.
Sau đó, người ta sẽ tiến hành giải trình tự các axit nucleic
Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên
tắc.


- Nguyên tắc hóa học (Phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản
ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA tạo thành một tập hợp nhiều phân
đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleotid.
- Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và phương pháp cải biên) :
dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase.
Với việc tổng hợp thêm các deoxynucleotid cùng với các deoxynucleotid thông
thường. Kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có
kích thước chênh nhau 1 nucleotid.
Ở cả 2 phương pháp, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên
gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình
tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ ghi từ bản điện di [61].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu NS sinh amylase.
Ở nước ta và trên thế giới đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu về NS
sinh amylase đặt nền móng cho việc sản xuất chế phẩm enzym này và là cơ sở để
ứng dụng vào đời sống.
Trên thế giới, trong thời gian gần đây có một số công trình nghiên cứu về
amylase của NS khá nổi bật như:
Từ năm 1990, Marianne Graber và Didier Combes đã có công trình nghiên
cứu “Kiểu hoạt động của anpha-amylase từ chủng Asp.oryzae trong MT đậm đặc”
[52].
Trong công trình nghiên cứu năm 1997, P.Woloshuk đã nghiên cứu về các

Nổi bật nhất trong các nghiên cứu gần đây nhất là các nhà khoa học thuộc
Viện Sinh học Nhiệt đới đã nghiên cứu và sản xuất thành công hai loại thức ăn kích
thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi (kể cả thuỷ sản) là sản phẩm lên men từ bã sắn
và góp phần giải quyết ô nhiễm MT. Hai sản phẩm đó có tên gọi là ProBio-S và
Bio-E (quá trình lên men tạo ra ba loại enzym là α – amylase, glucoamylase và
cellulase) . Kết quả thử nghiệm sơ bộ trên 15-20 lợn con một tháng tuổi cho thấy
sau ba tháng được ăn hai chế phẩm trên, lợn tăng trọng nhanh hơn 1,1-1,3kg so với
những con đối chứng [14, 40].


1.3. Tinh bột và hệ enzym amylase.
1.3.1. Tinh bột.
Tinh bột gồm hai cấu tử là amylose (chiếm 20 – 30%) và amilopectin (chiếm
khoảng 70 – 80%).
Amylose có phân tử lượng thấp, phân bố phía bên trong hạt tinh bột, cấu trúc
thẳng, các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,4-glucoside, dài
khoảng 300 – 1000 gốc glucose xoắn theo kiểu lò xo, mỗi vòng xoắn có khoảng 6
gốc glucose. Nhờ cấu trúc xoắn amylose có thể kết hợp với các nguyên tử khác, tạo
màu xanh khi kết hợp với iod. Nếu đun nóng liên kết hydro bị cắt đứt, chuỗi
amylose duỗi thẳng iod tách khỏi amylose và dung dịch mất màu xanh.
Amilopectin có các gốc glucose gắn với nhau không chỉ nhờ liên kết α-1,4glucoside mà còn nhờ liên kết α-1,6-glucoside, chính liên kết này hình thành cấu
trúc nhánh trong amilopectin. Phân tử amilopectin chứa khoảng 200.000 đến
1.000.000 phân tử glucose, phân bố ở mặt ngoài hạt tinh bột. Amilopectin chỉ hoà
tan khi đun nóng và tạo nên dung dịch có độ nhớt cao, amilopectin tạo màu đỏ với
iod. [7, 8, 29, 33]
1.3.2. Hệ enzym amylase.
Amylase là tên gọi của một nhóm enzym có tác dụng xúc tác thủy phân liên
kết glucoside trong polysaccharide (tinh bột) và các dextrin cuối. Cơ chất tác dụng
của amylase là tinh bột và glycogen. Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là
glucose, maltose và dextrin. [8,11]

- Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số liên kết trong phân tử cơ
chất bị thủy phân, tạo một lượng dextrin và độ nhớt từ hồ tinh bột giảm nhanh.
Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình
thành tiếp tục tạo các dextrin phân tử thấp hơn, maltose, isomaltose và glucose.
Tuy nhiên, thông thường trong một thời gian ngắn (30 – 60 phút), α –
amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít
đường maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α – amylase là tính chất đặc trưng của


nó. Vì vậy người ta còn gọi loại amylase này là amylase dextrin hay amylase dịch
hóa.
Những chủng VSV có khả năng tổng hợp α – amylase có ý nghĩa công
nghiệp: Baccillus subtilis, Baccillus licheniformis, Asp.oryzae [7].
b. β – amylase (α -1,4 – glucan – mantohidrolase) chỉ phân cắt các liên kết
α – 1,4 glucoside ở đầu mạch. Enzym này phổ biến ở TV, nhiều ở hạt nảy mầm. β –
amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vô hoạt hoàn toàn ở 70oC nhưng trong dịch nấu thì
nhiệt độ tối thích là 60 – 65oC. Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3 – 4. Đa số
β – amylase hoạt động mạnh hơn ở MT pH 4,5 – 5 và vẫn giữ được hoạt tính khi
không có canxi.
Điểm khác biệt cùa enzym này so với α – amylase là hầu như không tác dụng
lên tinh bột sống mà chỉ phân giải mạnh hồ tinh bột. Chúng phân giải 100%
amylose và 54 – 58% amylopectin thành maltose.
β – amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có canxi. [15, 29].
c. Glucoamylase (γ – amylase hay α – 1,4 – glucan – glucohydrolase) thủy
phân liên kết α-1,4 glucosid và α-1,6 glucosid trong chuỗi polysaccharide. Enzym
này có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin dextrin cuối,
panose, isomatose và maltose tới glucose (Azarova, 1981; Jerebtxov, Pankratov,
1977; Dobrolinxkaia, Rodzevits, 1974; Logina Karpukhina, 1978).
Phân tử lượng gucoamylase thường không ổn định, dao động từ 50.000 đến
95.000 dalton. Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng

thành enzym của VSV. MT nuôi cấy VSV phải bảo đảm có đầy đủ các thành phần
dinh dưỡng và tỉ lệ các chất dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với nhu cầu của từng VSV
cụ thể.
 Ảnh hưởng của nguồn C.
Thành phần và hàm lượng C có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp enzym.
Nhiều tác giả cho rằng: muốn thu được hàm lượng amylase cao thì trong MT nuôi
cấy VSV không được chứa nguồn C dễ hấp thu. Nói chung amylase thủy phân tinh


bột là enzym cảm ứng nên sự có mặt của cơ chất tinh bột thường thúc đẩy quá trình
tạo amylase [25].
Theo Grigorev, ảnh hưởng nguồn C đến cường độ sinh tổng hợp amylase có
thể xếp theo thứ tự sau:
-

Đối với α – amylase: tinh bột > dextrin > maltose > lactose > glucose >
saccharose > galactose > manose > arabinose.

-

Đối với glucoamylase: tinh bột > dextrin > maltose > saccharose >
glucose > lactose > arabinose > galactose > manose [31].

Nồng độ nguồn C trong MT cũng ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzym.
Mỗi loài VSV chỉ có thể tạo lượng amylase cao nhất ở một nồng độ hydratcacbon
nhất định. Ví dụ trên MT Czapek, nồng độ tinh bột ảnh hưởng rõ rệt đến sinh tổng
hợp enzym amylase. Nồng độ tinh bột tối thích cho sinh tổng hợp α – amylase là
6% , đối với glucoamylase là 3%.
Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy NS thu amylase thường là những nguyên
liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các

Ngô

250

760

4

220

800

Mì

250

760

2

110

800

Mì đen

300

770


tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ
muối, MT bị acid hóa, quá trình tổng hợp enzym sẽ chuyển theo hướng tích cực
tổng hợp glucoamylase và ức chế tổng hợp α – amylase.
Sự cân bằng giữa C và N trong MT có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh
khối VSV và sự tạo thành amylase. Khi MT có đủ lượng C và N cần thiết sẽ tích lũy
được lượng amylase cực lớn. Tỉ lượng tối ưu của C và N cho sinh tổng hợp amylase
là 10:1 đến 40:1. Trong MT Czapeck, tỉ lượng giữa tinh bột và NaNO3 tối ưu cho
sinh tổng hợp các amylase vào khoảng 18:1.[25]
 Các nguồn dinh dưỡng khoáng.
Magie ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzym. Thiếu MgSO4 sẽ ảnh hưởng
xấu đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối
ưu của muối này cho sự tổng hợp α – amylase và glucoamylase là 0,05%.