i

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến:
Các Thầy Cô giáo trong viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường cũng như
toàn thể các Thầy Cô đã dạy em trong suốt thời gian học tập tại trường và đặc biệt
là TS. Tạ Thị Minh Ngọc, người đã tận tình hướng dẫn để em có thể hoàn thành
một cách tốt nhất đồ án tốt nghiệp này.
Các Thầy Cô giáo, anh chị đang công tác tại Trung tâm thí nghiệm thực hành,
Trường Đại học Nha Trang đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em, tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong thời gian làm nghiên cứu.
Cảm ơn gia đình và bạn bè những người đã luôn bên cạnh cổ vũ động viên em
trong suốt bốn năm học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Nha Trang.
Nha Trang, tháng 7 năm 2012
Sinh viên thực hiện

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
KÝ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT vii
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1.1 Tổng quan về nấm men 2
1.1.1. Đặc điểm phân bố 2

lipolytica 15
1.5. β-carotene 16
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Đối tượng – vật liệu 18
2.1.1. Đối tượng 18
2.1.2. Vật liệu 18
2.1.2.1. Thiết bị 18
2.1.2.2. Hóa chất 18
2.1.3. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 19
2.1.3.1. Môi trường hoạt hóa, giữ giống 19
2.1.3.2. Môi trường quan sát đặc điểm khuẩn lạc ở các nhiệt độ nuôi cấy
khác nhau 19
2.1.3.3. Môi trường nuôi cấy khảo sát đường cong sinh trưởng của nấm men
21
2.2. Các phương pháp nghiên cứu 21
2.2.1. Phương pháp giữ giống, cấy chuyền 21
2.2.2. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm men 21
2.2.2.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc 21
2.2.2.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống 21

iv

2.2.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm khuẩn lạc trên các điều kiện nuôi cấy
khác nhau 22
2.2.4. Xây dựng đường cong sinh trưởng trên các môi trường khác nhau 22
2.2.5. Phương pháp xác định lượng sterol trong màng tế bào 22
2.2.6. Phương pháp xác định tính thấm của màng tế bào nấm men đối với chất
kỵ nước β-carotene trên các điều kiện nuôi cấy được lựa chọn 23
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24
3.1. Kết quả nghiên cứu: 24

trường khác nhau ở các nhiệt độ khác nhau 34

vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của màng sinh chất 5
Hình 1.2: Hiện tượng nhập bào 10
Hình 1.3: Hiện tượng xuất bào 10
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của β-carotene 16
Hình 1.5: Quang phổ hấp thụ của β-carotene 17
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của Y. lipolytica W29 trên môi trường YPDA ở 27
o
C 24
Hình 3.2: Hình thái tế bào Y. lipolytica W29 khi nuôi trên YPDA ở 27
o
C 25
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc Y. lipolytica 0544 trên môi trường YPDA ở 27
o
C 26
Hình 3.4: Hình thái tế bào Y. lipolytica 0544 khi nuôi trên môi trường YPDA ở 27
o
C 26
Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc của S. cerevisiae TNS.c trên môi trường YPDA ở 27
o
C 27
Hình 3.6: Hình thái tế bào của S. cerevisiae TNS.c trên môi trường YPDA ở 27
o
C 28
Hình 3.7: Đường cong sinh trưởng của Y. lipolytica W29 trên một số môi trường 36

nhau. Các nguồn dinh dưỡng chính đối với sinh trưởng của nấm men gồm nguồn
cacbon (đường, tinh bột, các chất kỵ nước như ankan, lipid, các acid béo ) và
nguồn nitơ (cao nấm men + pepton, các acid amin cơ bản ). Các nguồn dinh dưỡng
này tác động mạnh đến sinh trưởng nấm men cũng ảnh hưởng đến các bộ phận
trong tế bào, đặc biệt là bề mặt tế bào. Để khảo sát khả năng sinh trưởng và phát
triển cũng như ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng này ảnh hưởng như thế nào
đến tính chất bề mặt của màng tế bào nấm men nên chúng tôi thực hiện đề tài:
“Khảo sát khả năng sinh trưởng của một số chủng nấm men và ảnh hưởng của
môi trường nuôi cấy tới tính chất bề mặt của tế bào nấm men” gồm các bước
thực hiện sau:
- Xây dựng đường cong sinh trưởng của một số chủng nấm men trên các điều
kiện nuôi cấy khác nhau.
- Khảo sát tính chất bề mặt của màng tế bào nấm men trên một số điều kiện
nuôi cấy lựa chọn.
Vì đây là lần đầu tiên làm quen với công tác nghiên cứu, với kinh nghiệm thực
tế và kiến thức bản thân còn hạn chế, thời gian thực hiện có hạn nên trong quá trình
thực hiện đề tài không tránh khỏi những thiếu sót, sai lầm. Rất mong nhận được sự
đóng góp ý kiến của quý Thầy Cô và các bạn để đề tài được hoàn thiện hơn.

2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về nấm men
1.1.1. Đặc điểm phân bố
Nấm men phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi
trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật
mía, rỉ đường, mật ong, trong đất vườn trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu
mỏ
Trong các sản phẩm như sữa, sữa chua, bánh mì cũng chứa một lượng lớn
các loài nấm men như Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus,

men bia là đường maltose, lên men rượu vang là đường fructose sau là glucose.
Đối với những disaccharide trước khi được nấm men sử dụng phải trải qua quá
trình thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men.
Các acid béo được làm nguồn cacbon dinh dưỡng phụ thuộc vào từng
chủng loại nấm men, nồng độ axit, chiều dài mạch cacbon trong phân tử acid và
mức độ điện ly. Mạch từ C
2
- C
4
làm nguồn cơ chất khá tốt ở nồng độ tương đối
thấp.
Ngoài ra có thể sử dụng nguồn cacbon từ dầu mỏ và khí đốt nhưng vẫn
còn nhiều e ngại nếu ứng dụng sinh khối nấm men vào các sản phẩm như thức
ăn chăn nuôi do có thể tồn dư các chất nào đó hoặc rất ít, không thể xác định
được chúng có ảnh hưởng đến sức khỏe của người và động vật hay không.
1.1.3.2. Nguồn nitơ
Là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường.
Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotide
purin, protein, pirimidin và một số vitamin. Nấm men có khả năng tổng hợp
được tất cả các acid amin, đa số nấm men không đồng hóa được nitrate.
Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid
vô cơ cũng như hữu cơ: amoni phosphate, muối acetat, lactat, malat…
1.1.3.3. Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ
Được quan tâm trước hết là phospho, sau đó đến kali, magie, lưu huỳnh…

4

Khi không đủ P trong môi trường, sự trao đổi chất ở nấm men bị thay đổi
đáng kể liên quan đến sự phá vỡ nhu cầu và sử dụng hydratcacbon và nitơ. Nhu
cầu sinh lý về phospho đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10-13mg P.

1.1.3.4. Dinh dưỡng các chất sinh trưởng
Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các base purin,
pyrimidin. Các acid amin cũng đóng vai trò là chất kích thích sinh trưởng cho
một số chủng nấm men. Nhu cầu riêng biệt này rất nhỏ.
1.2. Màng tế bào
1.2.1. Đặc điểm, cấu trúc của màng
Màng tế bào được tạo thành từ lớp lipid kép dày khoảng 7.5nm, chúng
hình thành mặt phân cách giữa tế bào và môi trường tế bào. Vì vậy, nó ngăn
chặn các phân tử nội bào đi ra ngoài và các phân tử tự do bên ngoài đi vào trong
tế bào. Màng tế bào có tính thấm chọn lọc, cho phép một số chất đi qua dễ dàng
hơn các chất khác, thường thì chúng chỉ cho các phân tử có kích thước nhỏ hơn
600 Da thấm qua. Màng còn là nơi chứa các enzyme truyền tín hiệu, enzyme
sinh tổng hợp năng lượng, là nơi đến đầu tiên của các phần tử mang thông tin
như hoocmon, các phân tử truyền nơron…

5

Màng tế bào gồm 3 thành phần cơ bản của sự sống: protein, lipid và
glucide. Ba thành phần này kết hợp lại tạo thành một màng lỏng, tách biệt với
môi trường bên trong tế bào và cho phép nó tương tác với các bộ phận khác của
tế bào.

1.2.1.2. Protein màng
Căn cứ vào cách liên kết với màng lipid, người ta chia protein màng ra
làm 2 loại: protein xuyên màng và protein ngoại vi.
Protein xuyên màng: các protein này trôi nổi trong tầng lipid kép như
những cái phao trên hồ, tạo ra các kênh đi qua màng tế bào, nhờ đó mà các phân
tử và thông tin đi qua lại được tế bào. Protein xuyên màng có hình sợi, có thể
xuyên qua màng một lần nhưng cũng có loại lộn vào lộn ra để xuyên qua màng
nhiều lần, có khi tới 6-7 lần. Chúng không cố định một chỗ mà di chuyển qua lại
và chiếm khoảng 70% protein màng tế bào.
Protein ngoại vi: chiếm khoảng 30% thành phần protein màng, gặp ở mặt
ngoài hay mặt trong màng tế bào.
1.2.1.3. Glucide
Glucide màng là những đoạn dextrin ngắn, thường liên kết với
phospholipid tạo thành glycolipid hoặc protein tạo thành glycoprotein phân bố ở
mặt ngoài màng tạo nên tính bất đối xứng của màng, tham gia tạo nên khối chất
nền ngoại bào giữa các tế bào trong mô của cơ thể đa bào. Chất nền ngoại bào
không chỉ có chức năng dính kết các tế bào trong mô mà còn có chức năng
truyền đạt thông tin giữa các tế bào.

7

1.2.2. Phương thức vận chuyển chất qua màng
Có 3 cách để vận chuyển các chất qua màng
1.2.2.1. Vận chuyển thụ động (passive transport)
Đây là hình thức vận chuyển nước và các chất theo gradient nồng độ và
không tiêu tốn ATP của tế bào.
 Hiện tượng thẩm thấu và khuếch tán qua màng tế bào
Tùy thuộc vào điều kiện môi trường và nồng độ các chất bên trong, nước
và các chất hòa tan trong nước có thể vào hoặc ra khỏi tế bào cho đến khi đạt
mức độ cân bằng về áp suất và nồng độ. Hiện tượng nước đi từ nơi có nồng độ

2
O…) không được vận chuyển trực tiếp qua màng phospholipid kép
mà được vận chuyển nhờ các protein mang đặc hiệu trên màng (carrier protein).
Những chất này được vận chuyển qua màng theo gradient nồng độ, không tiêu
tốn ATP của tế bào.
Các protein mang này có thể vận chuyển một chất (kênh vận chuyển đơn)
hoặc nhiều chất (kênh vận chuyển kép) ra hoặc vào trong tế bào.
1.2.2.2.Vận chuyển chủ động (active transport)
Là hình thức vận chuyển ion và các chất qua màng tế bào chất ngược
chiều gradient nồng độ và tiêu tốn ATP của tế bào.
 Bơm Na-K
Bơm Na-K là phức hợp enzyme Na
+
-K
+
adenosine triphosphatase (Na
+
-
K
+
ATPaes) trên màng tế bào, giúp điều hòa nồng độ các ion Na
+
và ion K
+

trong và ngoài tế bào. Cơ chế hoạt động gồm 4 bước:
Bước 1: ba phân tử Na
+
liên kết vào đầu cuối bên trong của hai dưới đơn
vị dẫn đến làm thay đổi hình thể của phức hệ protein xuyên màng.


màng. Cấu hình mới có ái lực với ion K
+
nên nó được tách ra và khuếch tán ngay
trong tế bào. Với hình thể ban đầu nó lại có ái lực cao với các ion Na
+
. Khi các
ion này kết hợp vào, chu kỳ bơm khác lại bắt đầu.
Đặc tính duy nhất của bơm Na-K là quá trình vận chuyển tích cực các ion
Na
+
, K
+
từ vùng có nồng độ thấp đến vùng có nồng độ cao. Sự vận chuyển này
xảy ra được là nhờ sự tiêu phí năng lượng trao đổi chất dưới dạng ATP.
 Bơm proton
Là phức hợp protein đặc hiệu trên màng tế bào, thực hiện chức năng vận
chuyển các ion H
+
ngược chiều gradient nồng độ nhờ năng lượng ATP do tế bào
cung cấp. Bơm proton hoạt động, luôn đưa các ion H
+
ra khỏi tế bào, làm cho
nồng độ ion H
+
trong tế bào luôn thấp hơn bên ngoài tế bào, tạo sự chênh lệch
điện thế màng cần thiết cho hoạt động của tế bào. Điều này có thể làm cạn kiệt
ion H
+
bên trong tế bào. Để đảm bảo lượng ion H

hoocmon… từ lưới nội chất và phức hệ golgi được đưa đến màng tế bào chất,
được màng tế bào đưa ra khỏi tế bào.
Nhập bào và xuất bào là hình thức vận chuyển các chất đặc biệt của tế
bào liên quan đến sự biến đổi cấu trúc màng tế bào chất để đưa các chất vào
hoặc ra khỏi tế bào.

Hình 1.3: Hiện tượng xuất bào

11

(trích Giáo trình sinh học tế bào, Nguyễn Như Hiền, NXB Giáo Dục,
2006)
1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm men
1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Nguồn cacbon trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình
sinh trưởng của vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng. Nấm men có hệ
thống enzyme phong phú và khả năng chuyển hóa nhanh những nguồn cacbon
khác nhau trong môi trường nuôi cấy qua các con đường trao đổi chất. Phổ
cacbon của nấm men rất rộng, chúng có khả năng sử dụng những hợp chất
cacbon khác nhau như: các loại đường đơn, đường đôi, các acid hữu cơ…cho
quá trình sinh trưởng. Một số nấm men Candida phân lập từ nước biển có khả
năng sử dụng nguồn cacbon là ethanol cho quá trình sinh trưởng.
Một số chủng nấm men nếu sử dụng nguồn cacbon khác nhau thì tính
chất bề mặt sẽ khác nhau: loài Candida tropicalis khi nuôi cấy trong môi trường
có ankan thì bề mặt sẽ trơn nhẵn hơn trong môi trường có glucose (Osumi et al.,
1975), bề mặt Yarrowia sẽ xuất hiện các chỗ lồi (Fickers et al., 2005), bề mặt tế
bào có nhiều hạt lipid bám vào, đồng thời màng tế bào sẽ linh động hơn.
1.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Trong quá trình sinh trưởng, nấm men chịu ảnh hưởng của nguồn nitơ có
trong môi trường nuôi cấy. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với tế bào nấm men

tố khoáng thường được bổ sung vào môi trường là P, Mg, K…
1.3.4. Ảnh hưởng của oxy
Mặc dù nấm men mọc được trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí nhưng oxy
và độ thoáng khí rất cần thiết cho sự sinh trưởng của nấm men. Đồng thời nó còn
ảnh hưởng lớn đến quá trình trao đổi chất của nấm men như quá trình lên men.
Nấm men hấp thụ oxy một cách nhanh chóng và sử dụng oxy cho quá trình sinh
tổng hợp các acid béo không no và sterol cho màng tế bào. Do đó, oxy có vai trò
hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng của nấm men để đem lại hiệu quả
cao nhất. Ví dụ như chủng nấm men lên men bia, một số enzyme của nấm men
chỉ phản ứng với oxy mà không gây phản ứng với bất kỳ một chất nhận hydro
nào khác, điển hình như enzyme oxygenase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp
các acid béo không no và các sterol. Do đó, nếu lượng oxy đầy đủ thì lượng
sterol trên màng tế bào ổn định nếu thiếu oxy có thể làm cho màng lỏng hơn.
1.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Một nhân tố khác ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và trao đổi chất
của nấm men là nhiệt độ. Hoạt động trao đổi chất của nấm men có thể coi là kết
quả của các phản ứng hóa học. Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào

13

nhiệt độ nên yếu tố nhiệt độ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của tế
bào. Tế bào thu được nhiệt chủ yếu từ môi trường bên ngoài và một phần cũng
do cơ thể thải ra từ kết quả hoạt động trao đổi chất. Tùy theo quá trình sinh lý
khác nhau mà đòi hỏi những nhiệt độ tối thích khác nhau. Biên độ nhiệt độ cho
quá trình sinh trưởng của nấm men rất rộng nhưng nhìn chung nấm men sinh
trưởng tốt ở 28-30
o
C. Ở nhiệt độ 4
o
C, nấm men vẫn có thể sinh trưởng được

1.4.1. Saccharomyces cerevisiae
1.4.1.1. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của S. cerevisiae
Phân loại:
Bộ: Saccharomycetales

14

Họ: Saccharomycetaceae
Giống: Saccharomyces
Loài: Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces thuộc nhóm vi sinh vật rất phổ biến trong tự nhiên. Đây là
loài nấm men được sử dụng lâu đời trong lên men cồn và sản xuất bánh mì.
Chúng có dạng hình cầu hay hình trứng, có kích thước nhỏ, từ 5- 14µm, khuẩn
lạc của chúng dạng bột nhão, màu trắng.
S. cerevisiae lên men hầu hết các loại đường trừ lactose và cellobiose.
Tuy nhiên, khả năng tăng trưởng của S. cerevisiae trên các loại đường khác nhau
là khác nhau (Chen, 2009). S. cerevisiae sinh sản chủ yếu bằng cách nảy chồi
nhưng cũng có thể sinh sản hữu tính. S. cerevisiae là loài có thể phát triển trong
điều kiện hiếu khí hay kỵ khí, ở điều kiện hiếu khí sinh trưởng tăng sinh khối
nhanh, điều kiện yếm khí chủ yếu lên men tạo cồn; pH phát triển trong khoảng 4
– 6,8, tối ưu ở pH 5,8; nhiệt độ phát triển trong khoảng 27 – 35
o
C, tối ưu ở 32
o
C.
Nguồn dinh dưỡng carbohydrate chính là các loại đường, thích hợp nhất là
đường fructose, có thể sử dụng nguồn nitơ vô cơ lẫn hữu cơ.
1.4.1.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng của
S. cerevisiae
Điều kiên nuôi cấy có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của S.

Fickers et al., 2005). Nấm men này có thể được phân lập từ bơ sữa hay các sản
phẩm từ sữa bị hư hỏng như bơ, sữa chua, xúc xích. Ngoài ra chúng cũng có thể
được phân lập từ đất, nước thải và môi trường bị ô nhiễm dầu.
Các chủng phân lập từ tự nhiên thường là thể đơn bội, một số ít là thể
lưỡng bội. Cả 2 thể đơn bội và lưỡng bội đều bền vững dưới điều kiện phòng thí
nghiệm. Bào tử hình thành trong điều kiện tăng trưởng cụ thể và tạo ra 4 bào tử
có hình lưỡi liềm có thể được tách ra bằng máy vi xử lý (Barth và Gaillardin,
1996).
Y. lipolytica có thể tăng trưởng trong môi trường có bổ sung lipid như
ricinoleic (dầu thầu dầu), sử dụng lipid để tổng hợp thành lacton do hoạt động
của enzyme lipase và esterase (Ficker et al., 2005)
1.4.2.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh trưởng của
Y. lipolytica
Y. lipolytica là loài nấm men hiếu khí cho nên yêu cầu phải có đầy đủ
lượng oxy để sinh trưởng và phát triển, do đó tốc độ lắc cũng ảnh hưởng đến khả

16

năng phát triển của nó. Đồng thời cũng đảm bảo yếu tố nhiệt độ và một số yếu tố
khác.
Ngoài ra, chúng có khả năng tăng trưởng trong môi trường có bổ sung các
hợp chất kỵ nước (Peters và Nelson, 1948; Klug và Markovetz, 1967). Sử dụng
các chất kỵ nước này như nguồn cacbon để sinh trưởng và phát triển, chuyển hóa
thành một số hợp chất thơm như α-,γ-decalactone…Tuy nhiên, nếu những hợp
chất này tích lũy cao trong tế bào có thể gây độc và ức chế hoạt động của nấm
men (Feron et al., 1996).
1.5. β-carotene
β-carotene là một loại carotenoid phổ biến được tìm thấy nhiều trong một
số trái cây và rau quả có màu đỏ như: gấc, khoai lang đỏ, cà rốt…Là tiền thân
chủ yếu của vitamin A (cơ thể có thể chuyển β-carotene thành vitamin A).


18

CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng – vật liệu
2.1.1. Đối tượng
Chủng Y. lipolytica W29 được cung cấp bởi trường AgroSup Dijon, Pháp. Chủng
Y. lipolytica 0544 và S. cerevisiae HNS.c được cung cấp bởi Viện Công nghiệp
Thực phẩm, Hà Nội.
Chủng S. cerevisiae TNS.c được cung cấp bởi trường Đại học Khoa Học
Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh.
2.1.2. Vật liệu
2.1.2.1. Thiết bị
- Cân điện tử - Máy đo OD
- Kính hiển vi quang học - Tủ lạnh
- Tủ ấm- Bếp nung
- Tủ sấy- Bể ổn nhiệt
- Nồi hấp thanh trùng - Máy ly tâm
- Máy lắc - Các dụng cụ khác: pipet, đầu
típ, nồi, đĩa petri, ống nghiệm,
bình tam giác, lam kính…
2.1.2.2. Hóa chất
- NaCl
- Glucose
- Cao nấm men
- Pepton
- Acid amin cơ bản
- Tween 80
- Cồn tuyệt đối
- Glycerol