BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ NHUNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH
PROTEASE CỦA TẾ BÀO
Bacillus subtilis natto ĐƢỢC CỐ ĐỊNH
TRONG GEL ALGINATE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI



LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
cô giáo ThS. Kiều Thị Hồng và TS. Đàm Thanh Xuân, giảng viên Bộ môn Công
nghiệp Dược, những người thầy đã luôn quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi
thực hiện khóa luận này.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới DS. Lê Ngọc Khánh, ThS.
Nguyễn Khắc Tiệp đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ
môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo
trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã
động viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập
và nghiên cứu vừa qua.

Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Nguyễn Thị Nhung
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

2.3. Phương pháp nghiên cứu: 17
2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy chủng Bacillus subtilis natto: 17
2.3.2. Phương pháp làm sữa đậu nành: 18
2.3.3. Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginate: 18
2.3.4. Phương pháp phá hạt: 18
2.3.5. Phương pháp thử hoạt tính enzyme protease: 18
2.3.6. Phương pháp xác định số lượng tế bào: 19
2.3.7. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm: 20
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22
3.1. Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel
alginate: 22
3.2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi
trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: 25
3.2.1. Định tính enzyme protease có trong dịch nuôi cấy hạt alginate cố định B.
subtilis natto: 25
3.2.2. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: 32

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35
Kết luận: 35
Kiến nghị: 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Lactobacillus acidophilus
L. casei
Lactobacillus casei
L. delbrueckii
Lactobacillus delbrueckii
L. helveticus
Lactobacillus helveticus
L. plantarum
Lactobacillus plantarum
L. rhamnosus
Lactobacillus rhamnosus
NCBI
National center for Biotechnology Information
(Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh
học)
s
Độ lệch chuẩn
S. cerevisiae
Sacharomyces cerevisiae
TB
Trung bình
VSV
Vi sinh vật
Z. mobilis
Zymomonas mobilis
28
7
3.5. So sánh đường kính vòng phân giải casein của enzyme
protease trong dịch lên men của các môi trường khác nhau
theo thời gian nuôi cấy hạt gel cố định B. subtilis natto
29
8
3.6. Số lượng tế bào B. subtilis natto cố định được trong 1
gam hạt gel alginate ban đầu và hạt gel lưu giữ trong 1 tháng
33
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

STT
Tên hình
Trang
1
1.1. Hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc của Bacillus subtilis natto
3
2
1.2. Cấu trúc không gian của acid (M)
và acid (G)
5
3
1.3. Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG

của nhiều nhà khoa học trên thế giới và ngày càng có nhiều sản phẩm sinh học được
sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào ở quy mô công nghiệp.
Vi khuẩn Bacillus subtilis natto là một trong các vi khuẩn có khả năng sinh
nhiều enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose… trong đó protease là
enzyme được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con
người. Cố định tế bào B. subtilis natto có thể phát huy được các ưu điểm của
phương pháp bất động tế bào hướng tới mục tiêu sản xuất enzyme protease. Vì vậy,
khóa luận “Khảo sát khả năng sinh protease của tế bào Bacillus subtilis natto được
cố định trong gel alginate” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel
alginate.
2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi
trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt.

2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto:
Tên khác: Bacillus subtilis subsp. natto; Bacillus var. natto
Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis
được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [29].
1.1.1. Phân loại khoa học:
B. subtillis natto là một vi khuẩn nhân thật (EurobacterEur) thuộc: Giới:
Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi:
Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [29]. Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto
[29], [42].
Khi mới được phát hiện, Bacillus subtilis natto được coi như là một loài vi

triển, trong môi trường không có biotin các tế bào dinh dưỡng không thể phát triển,
bào tử cũng không nảy mầm được [27].
1.1.5. Đặc điểm sinh lý:

4

B. subtilis natto là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, sử dụng khí oxy làm chất nhận
điện tử khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Vi khuẩn có thể phát triển ở
nồng độ oxy lớn hơn 3%.
Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng. Nhiệt độ thích hợp cho B.
subtilis natto phát triển là 30 – 50
0
C, nhiệt độ tối thích là 37
0
C. Ở 55
0
C, vi khuẩn
ngừng phát triển và sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy
mầm của bào tử là 40
0
C, bào tử vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0
0
C.
B. subtilis natto phát triển ở pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu
cho sự sinh trưởng là 7,2 – 7,6. Ở pH 4,5 thì sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế
[29], [27].
1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto:
Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B. subtilis natto có khả năng sinh
nhiều sản phẩm trao đổi chất: -PG A; levan (fructan); trong đó đặc biệt là nhóm
các enzyme ngoại bào: nhóm enzyme -transpeptidase, phytase, amylase, cellulose

Hình 1.3. Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG [45]
1.2.2. Tính chất của alginate:
- Độ hòa tan: Các muối kim loại hóa trị I (Na
+
, K
+
…), muối amoni và các
muối của các amin phân tử lượng thấp của acid alginic tan được trong nước. Còn
các muối của acid alginic với các kim loại đa hóa trị (Ca
2+
, Ba
2+
…) thì không tan
được (trừ muối Mg
2+
). Các muối alginate hòa tan được trong các dung môi thân
nước như alcol, ceton… và hòa tan dễ dàng hơn khi đun nóng [13].

6

- Độ nhớt: Natri alginate khi tan trong nước tạo thành dung dịch có độ nhớt
dao động trong khoảng từ 10-3.500 cps. Độ nhớt này tăng tỷ lệ thuận với khối
lượng phân tử trung bình của alginate, với nồng độ alginate sử dụng và giảm đi khi
tăng nhiệt độ. Độ nhớt của dung dịch alginate còn bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của
các ion kim loại có trong dung dịch [13].
- Độ ổn định: Alginate khô giống như các polysaccharid tự nhiên khác, rất
không bền với oxy, nhiệt độ và ion kim loại. Khi có mặt các tác nhân này alginate
sẽ bị rã ra. Độ ổn định của các muối aginate xếp theo thứ tự: Natri alginate > Amoni
alginate > Acid alginic, càng xếp cuối các muối càng kém ổn định. Ngoài ra thêm
một lượng nhất định ion Ca

thải xạ, thuốc trị bệnh đau dạ dày, làm tá dược dính…)… [12]
1.3. Phƣơng pháp cố định (bất động) tế bào:
1.3.1. Lịch sử phát triển: [9]
Năm 1916, Nelson và Griffin tình cờ nhận thấy enzyme invertase của nấm
men khi hấp phụ trên than hoạt vẫn giữ nguyên hoạt tính cho phản ứng thủy phân
đường mía. Đây là phát hiện đầu tiên về bất động enzyme. Sau đó đã có rất nhiều
nghiên cứu và báo cáo về bất động enzyme trên thế giới.
Phương pháp cố định tế bào ngày nay bắt nguồn từ phương pháp cố định
enzyme. Nguyên lý của phương pháp cố định enzyme có thể được mô tả như
sau: "Enzyme đã tinh chế ở dạng tinh khiết được gắn hoặc gói trong những polymer
không hòa tan trong nước. Các hạt chứa enzyme sẽ được nhồi vào các cột hình trụ
có kích thước thích hợp, cho dung dịch cơ chất chảy qua cột, enzyme sẽ thực hiện
phản ứng phân cắt cơ chất thành sản phẩm tương ứng" [1].

8

Đặc điểm của enzyme cố định: Enzyme cố định có đặc điểm như sau: [44]
 Hoạt tính của enzyme cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzyme tự do
cùng loại.
 Enzyme cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhưng có
một số sai khác nhất định: xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất
mang hoặc xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán.
 Enzyme cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzyme tự do.
 Enzyme cố định thường có pH tối ưu không trùng enzyme tự do cùng loại.
 Enzyme cố định có chất mang chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzyme tự do.
 Enzyme cố định có thể tái sử dụng và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách
dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzyme cố định cao hơn enzyme tự do.
So với các enzyme ở dạng tự do, các enzyme được bất động có nhiều ưu
điểm nổi bật hơn: [32], [19]
 Cho phép sử dụng enzyme nhiều lần, từ đó giá thành sản xuất một đơn vị sản

giữa các chất xúc tác sinh học (tế bào, enzyme…) với chất mang không tan trong
nước thông qua liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý hoặc liên kết sinh
học đặc biệt. Đặc tính của vật liệu làm chất mang là có độ cứng cơ học, ổn định về
mặt sinh học và không gây độc với tế bào để có thể liên kết với các chất xúc tác
sinh học.
Các vật liệu thường sử dụng làm chất mang là: các polysaccharid không tan
trong nước (celluluse, dextran, dẫn chất của agarose…), các protein (gelatin,
albumin…), các polymer nhân tạo (dẫn xuất của polystyrene, polyurethane, nhựa
trao đổi ion…) và các vật liệu vô cơ (cát, thủy tinh, ceramic…) [18],[10].
Phương pháp liên kết với chất mang thường ít được sử dụng cho bất động tế
bào vì các chất mang thường là các chất độc với tế bào và việc tìm kiếm điều kiện
để bất động tế bào thường gặp khó khăn.

10

 Phương pháp tạo liên kết ngang:
Phương pháp tạo liên kết ngang không sử dụng chất mang để cố định tế bào
mà các tế bào được liên kết với nhau bằng các liên kết ngang tạo thành dạng pellet,
tác nhân tạo thành liên kết ngang thường là glutaraldehyd, các diisocyanat… trong
đó glutaraldehyd là tác nhân phổ biến nhất. Các nhóm amino của glutaraldehyd tạo
thành các liên kết ngang liên kết các tế bào. Các tác nhân nhóm diisocyanat như:
toluen diisocyanat, hexa methyl diisocyanat… lại tạo liên kết ngang bằng cách liên
kết nhóm urea với các nhóm amino. Enzyme aspertase của E. coli và Bacillus
coagulans cũng đã được bất động bằng phương pháp này với glutaraldehyd hoặc
toluen diisocyanat [18], [10], [28], [9].
 Phương pháp bẫy:
Dựa vào tính chất của vật liệu dùng để bẫy các tế bào vi khuẩn mà phương
pháp bẫy được phân chia thành 4 dạng, đó là: dạng lưới, dạng nang nhỏ
(microcapsule), dạng liposome và dạng màng.
 Dạng lưới:

Kháng sinh là nhóm thuốc rất cần thiết cho cuộc sống con người và hầu hết
các kháng sinh thu được bằng con đường lên men vi sinh vật. Theo các phương
pháp truyền thống, các kháng sinh thường được sản xuất bằng phương pháp lên men
mẻ trong các bình lên men. Tuy nhiên, để nâng cao hiệu suất sản xuất kháng sinh
người ta đã tìm cách chuyển từ lên men mẻ sang lên men liên tục. Điều này khó có
thể thực hiện được với các tế bào tự do, khi đó bất động tế bào trở thành giải pháp
hiệu quả nhất. Nhiều kháng sinh đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp từ các
nguyên liệu ban đầu được tạo ra từ phương pháp bất động tế bào như:
oxytetracyclin, penicillin, bacitracin, neomycin, candicidin, cephalosporin… [18].
 Sản xuất các acid hữu cơ:
Bên cạnh phương pháp tổng hợp hóa học thì hiện nay một số acid hữu cơ
cũng được sản xuất bằng bất động tế bào như: acid citric, acid lactic, acid acetic…
Ví dụ: Để sản xuất acid citric, hiện nay chủ yếu sử dụng các tế bào Yarrowia
lipolytica [38] hoặc Aspergillus niger cố định trên cơ chất khác nhau như alginate,
agarose, polyacrylamid hay cho hấp phụ lên cột bọt polyurethane hoặc bẫy vào các
sợi rỗng với chất mang sử dụng là cellulose xốp… Tiến hành theo phương pháp lên
men gián đoạn.
Để sản xuất acid lactic, hiện nay các nhà khoa học hay sử dụng các chủng
Lactobacillus như: L. helveticus [21], L. casei [22], [26], L. delbrueckii [25], [31],
L. plantarum [33], L. rhamnosus… hay chủng Lactococcus lactic [30], [37], được
cố định trên các chất mang khác nhau như: alginate, k-carrageenane… và tiến hành
theo phương pháp lên men mẻ, lên men liên tục…
Lên men bất động tế bào còn được ứng dụng để sản xuất một số acid hữu cơ
khác như: acid propionic, acid gluconic, acid fumaric, acid succinic…

13

 Sản xuất enzyme:
Vi sinh vật là nguồn tốt nhất để sản xuất enzyme, đặc biệt phương pháp bất
động tế bào là kỹ thuật thích hợp nhất để sản xuất các enzyme ngoại bào.

2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị:
2.1.1. Chủng vi sinh vật sử dụng:
Bacillus subtilis natto
Nguồn gốc: Nhật Bản
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng:
Bảng 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Hóa chất
Nguồn gốc
Hóa chất
Nguồn gốc
Pepton
Ấn Độ
CaCl
2
.2H
2
O
Trung Quốc
Cao thịt
Ấn Độ
Xanh methylen
Việt Nam
NaCl
Trung Quốc
Đậu tương
Việt Nam
Thạch bột
Việt Nam
Natri alginate
Ấn Độ

Tên thiết bị
Nguồn gốc (Hãng)
Tủ cấy vô trùng
Italia (UV Bioair)
Tủ ấm, tủ sấy
Đức (Memmert)
Nồi hấp tiệt trùng
Nhật (ALP)
Lò vi sóng
Hàn Quốc (Daewoo)
Tủ lạnh
Nhật (Toshiba)
Máy li tâm
Đức
Máy lắc
Đức (Bioshaker)
Cân phân tích
Đức (Satorius)

16

Cân kỹ thuật
Đức (Satorius)
Máy khuấy từ
Hàn Quốc (Wisd)
Máy làm sữa đậu nành
Hà Lan (Philips)
Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, cốc có mỏ, ống đong, cốc có chân, đĩa
petri nhựa (đường kính 8,8cm), đĩa petri thủy tinh (đường kính 9cm), ống nghiệm,
pipet bấm, đầu côn, ống li tâm, thước kẹp Palmer….