ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC
Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA
PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC
Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA
PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

Đặng Thị Kim Anh

K21-Sinh học thực nghiệm

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 21
CHƢƠNG 1 – TỔNG QUAN ............... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.1. AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE ...................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.2. ENZYME PHÂN GIảI PHYTATE (PHYTASE) ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.2.1. Phân loại enzyme phytase ...........................Error! Bookmark not defined.
1.2.2. Nguồn phytase............................................Error! Bookmark not defined.
1.3. ỨNG DụNG CủA PHYTASE .......................... ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
1.3.1. Trong chăn nuôi ..........................................Error! Bookmark not defined.
1.3.2. Trong công nghệ thực phẩm .......................Error! Bookmark not defined.
1.3.3. Trong công nghiệp giấy ..............................Error! Bookmark not defined.
1.3.4. Trong cải tạo đất.........................................Error! Bookmark not defined.
1.3.5. Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphateError! Bookmark not
defined.
1.4. CÁC NGHIÊN CứU TÁCH DÒNG BIểU HIệN PHYTASE TRÊN THế GIớI........... ERROR!
BOOKMARK NOT DEFINED.
1.5. CÁC NGHIÊN CứU Về ENZYME PHYTASE ở VIệT NAM.. ERROR! BOOKMARK NOT
DEFINED.

1.6. CấU TRÚC PROTEIN LIÊN QUAN ĐếN KHả NĂNG HồI TÍNH CủA PHYTASE Từ A. NIGER
VÀ A. FUMIGATUS ............................................. ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

2.2.11. Lọc enzyme bằng thiết bị Viva Flow 200 ..Error! Bookmark not defined.
2.2.12. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước .....Error!
Bookmark not defined.
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬNERROR!
DEFINED.

BOOKMARK

NOT

3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PHYTASE .. ERROR! BOOKMARK NOT
DEFINED.

3.1.1. Phân tích đặc tính các gen phyA đã được tách dòng tại Viện Công nghiệp
Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt ....................Error! Bookmark not defined.
3.1.2. Tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin bằng Mega-PCRError! Bookmark
not defined.
3.1.3. Tạo plamid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểmError! Bookmark not
defined.
3.2. CHUYỂN GEN PHYA VÀO TẾ BÀO NẤM MEN PICHIA PASTORISERROR!
BOOKMARK NOT DEFINED.
3.2.1. Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp
xung điện ...................................................................Error! Bookmark not defined.
3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa phytase trong genome của Pichia pastoris .....Error!
Bookmark not defined.
3.2.3. Sàng lọc các thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp .... Error! Bookmark not
defined.
3.3. THU HỒI VÀ TINH SẠCH ENZYME PHYTASE TÁI TỔ HỢP ........ ERROR!
BOOKMARK NOT DEFINED.
K21-Sinh học thực nghiệm

APS

Ammonium Persulfate

BMGY

Buffered Glycerol Complex Medium

BMMY

Buffered Methanol Complex Medium

cDNA

complementary Deoxyribonucleic acid

CNTP

Công nghiệp thực phẩm

DNA

Deoxyribonucleic acid

EC

Enzyme Commission

FTU


Optical Density

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

rpm

Revolutions per minute

SDS-PAGE

Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SSC

Saline Sodium Citrate

TAE

Tris-Acetate-EDTA

TBE

Tris-Borate-EDTA


Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi enzyme phytase tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lọc luân
hồi Viva Flow 200 với kích thƣớc màng 5 kDa ....................................................... 42

K21-Sinh học thực nghiệm

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexakis dihydrogen
phosphate (axit phytic) ............................................................................................. 3
Hình 1.2. Cấu trúc protein của 4 nhóm enzyme phytase......................................... 5
Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của enzyme phytase từ Aspergillus fumigatus............. 14
Hình 1.4. Các cấu trúc đóng vai trò trong khả năng hồi tính của phytase
A. fumigatus.............................................................................................................. 16
Hình 2.1. Sơ đồ cấu trúc của vector pPICZαA, B, C .............................................. 18
Hình 2.2. Phƣơng pháp Mega-PCR cơ bản ............................................................. 22
Hình 3.1. Mô tả thí nghiệm tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin trên gen phyA
.................................................................................................................................. 31
Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 1 trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 32
Hình 3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 2 trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5 ................................................................................................ 33
Hình 3.4. Kết quả biến nạp sản phẩm ghép nối gen phyA mang 4 đột biến điểm vào
vector pPICZαA ....................................................................................................... 34
Hình 3.5. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt giới hạn trên gel agarose 1% trong đệm
TAE ×0.5 .................................................................................................................. 35
Hình 3.6. Kết quả phân tích trình tự 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1 - 5 sau khi
tạo đột biến điểm bằng phần mềm Bioedit 7.2.5 ..................................................... 36


MỞ ĐẦU
Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng phospho dự trữ chủ yếu
của thực vật. Axit phytic có thể chiếm 65 – 80% lƣợng phospho trong các loại ngũ
cốc, hạt các cây họ đậu và họ cải. Ngoài chức năng dự trữ phospho, axit phytic còn
liên kết chặt chẽ với các nguyên tố khoáng nhƣ Ca, Mg, Fe, Zn ... Axit phytic có
tính chất kháng tiêu hóa do khả năng liên kết với các protein, enzyme trong dịch
tiêu hóa của động vật.
Enzyme

phytase

(myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate

phospho-

hydrolase) có vai trò quan trọng trong chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy
phân axit phytic thành những gốc phospho đơn vô cơ và các dẫn xuất đơn giản của
myo-inositol. Do vậy, khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase không chỉ có tác
dụng làm tăng khả năng hấp thu phospho, các nguyên tố khoáng mà còn cải thiện
khả năng tiêu hóa các hợp chất khác, đồng thời làm giảm lƣợng phospho thải ra
ngoài, góp phần bảo vệ môi trƣờng.
Phytase thƣơng phẩm hiện nay đƣợc sản xuất chủ yếu dựa trên nguồn gen từ
nấm mốc Aspergillus niger. Phytase từ A. niger có một số ƣu điểm nhƣ hoạt động ở
pH thấp, phù hợp với môi trƣờng axit của dịch dạ dày, có tính đặc hiệu cơ chất với
phytate cao, và bền với tác động của pepsin. Phytase từ A. niger có nhƣợc điểm là
kém bền nhiệt. Trong công đoạn ép viên, thức ăn chăn nuôi thƣờng đƣợc gia nhiệt
tới 70-80°C để diệt Salmonella. Chính vì vậy, enzyme bổ sung vào thức ăn chăn
nuôi phải đáp ứng yêu cầu về độ bền nhiệt.
Để đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao, enzyme công nghiệp thƣờng đƣợc

Bacillus subtilis trên E. coli BL21 (DE3) và bước đầu ứng dụng enzyme tái tổ
hợp cho chăn nuôi, Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Trƣờng đại học Sƣ
phạm Hà nội.
6. Ngô Thanh Xuân, Mai Thị Hằng, Nguyễn Phƣơng Linh, Đinh Thị Mỹ Hằng,
Vũ Nguyên Thành, (2012), “Phân tích trình tự gene (phyA) mã hóa phytase
thành thục từ một số chủng Aspergillus niger”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,
10(1), tr. 115-122.
Tiếng anh
7. Anderson R. J., (1914), “A contribution to the chemistry of phytin”, J. Biol.
Chem., 17, pp. 171 –190.
8. Anno T., Nakanishi K., Matsuno R., Kamikubo T., (1985), “Enzymatic
elimination of phytate in soybean milk”, J. Japan Soc. Food Sci. Techno.l, 32,
pp. 174-180.
9. Baruah K., Pal A. K., Sahu N. P., Jain K. K., Mukherjee S. C., Debnath D.,
(2005), “Dietary protein level, microbial phytase, citric acid and their
K21-Sinh học thực nghiệm

22

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
interactions on bone mineralization of Labeo rohita (Hamilton) juveniles”,
Aquacult. Res., 2005, 36, pp. 803–812.
10. Baruah K., Sahu N. P., Pal A. K., Debnath D., Yengkokpam S., Mukherjee S.
C., (2007), “Interactions of dietary microbial phytase, citric acid and crude
protein level on mineral utilization by Rohu, Labeo rohita (Hamilton),
juveniles”, J. W. Aquacult. Soc., 38, pp. 238–249.
11. Billington D. C., (1993), “The Inositol Phosphates. Chemical Synthesis and

Plenum Press, New York, pp. 125-138.
18. Dawei F., Huoquing H., Huiying L., Yaru W., Peilong Y., Kun M., (2008), “A
highly pH-stable phytase from Yersinia kristeensenii: Cloning, expression, and
characterization”, Enz. Microbiol. Tech., 42, pp. 499-505.
K21-Sinh học thực nghiệm

23

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
19. Debnath D., Pal A. K., Sahu N. P., Jain K. K., Yengkokpam S., Mukherjee S.
C, (2005), “Effect of dietary microbial phytase supplementation on growth and
nutrient digestibility of Pangasius pangasius (Hamilton) fingerlings”,
Aquacult. Res., 36, pp. 180–187.
20. Deshpande S. S., Cheryan M., (1984), “Effect of phytic acid, divalent cations,
and their interactions on alpha-amylase activity”, J. F. Sci., 49, pp. 516-524.
21. Ellestad L. E., Angel R., Soares J. H., (2002), “Intestinal phytase II: A
comparison of activity and in vivo phytate hydrolysis in three teleost species
with differing digestive strategies”, Fish. Physiol. Biochem., 26, pp. 259–273.
22. Findenegg G. R., Nelemans J. A., (1993), “The effect of phytase on the
vailability of P from myo-inositol hexaphosphate (phytate) for maize roots”,
Plant Soil, 154, pp. 189-196.
23. Forsberg C. W., Phillips J. P., Golovan S. P., Fan M. Z., Meidinger R. G.,
Ajakaiye A., Hilborn D., Hacker R. R., (2003), “The enviropig physiology,
performance, and contribution to nutrient management advances in a regulated
environment: the leading edge of change in the pork industry”, J. Anim. Sci.,
81, pp. 68–77.
24. Freund W. D., Mayr G. W., Tietz C., Schultz J. E., (1992), “Metabolism of

33. Irving G. C. J., Cosgrove D. J., (1971), “Inositol phosphate phosphatase of
microbial origin, Observations on the nature of the active center of a bacterial
(Pseudomonas sp.) phytase”, Austral. J. Biol. Sci., 24, pp. 1559-1564.
34. Jog S. P., Garchow B. G., Mehta B. D., Murthy P. P. N., (2005), “Alkaline
phytase from lily pollen: Investigation of biochemical properties”, Arch.
Biochem. Biophys., 440, pp. 133–140.
35. Laboure A. M., Gagnon J., Lescure A. M., (1993), “Purification and
characterization

of

a

phytase

(myo-inositol

hexakisphosphate

phosphohydrolase) accumulated in maize (Zea mays) seedlings during
germination”, Biochem. J., 295, pp. 413-419.
36. Li Z., Zhao A., Wang X., Jin X., Li J., Yu M., (2013), “Cloning, expression,
and functional characterization of a phytase from the genus Bacillus”, J. Mol.
Microbiol. Biotechnol., 23, pp.193-202.
37. Liu B. L., Rafiq A., Tzeng Y. M. and Rob A., (1998), “The induction and
characterization of phytase and beyond”. Enzyme Microbiol. Technol., 22, pp.
415-424.

K21-Sinh học thực nghiệm


(2003),

“myo-Inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphates”,

Phytochemistry, 64, 1033–1043
46. Rao D. E., Rao K. V., Reddy T. P., Reddy V. D., (2009), “Molecular
characterization, physicochemical properties, known and potential applications
of phytases: An overview”, Crit. Rev. Biotechnol., 29(2), pp. 182-98.
47. Reddy N. R., Pierson M. D., Sathe S. K., Salunkhe D. K., (1989), “Phytates are
cereals and legumes”, CRC Press. Inc. Boca Raton. Fla, pp. 218-227.
48. Rimbach G., Pallauf J., (1992), “The effect of a supplement of microbial
phytase on zinc availability”, Z. Ernahrungswiss, 31, pp. 269-277.
K21-Sinh học thực nghiệm

26

Đặng Thị Kim Anh


Luận văn thạc sĩ
49. Sajjadi M., Carter C. G., (2004), “Effect of phytic acid and phytase on feed
intake, growth, digestibility and trypsin activity in Atlantic salmon (Salmo
salar, L)”, Aquacult. Nutr., 10, pp. 135–142.
50. Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T., (1989), Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New
York, pp. 123-128.
51. Sandberg A. S., Hulthen L. R., and Turk M., (1996), “Dietary Aspergillus
niger phytase increases iron absorption in humans”, J. Nutr., 126, pp. 476-480.
52. Shah V., Parekh L. J., (1990), “Phytase from Klebsiella sp. No. PG-2:
Purification and properties”, Indian J. Biochem. Biophys., 27, pp. 98-102.

“Balance trials withAfrican catfish Clarias gariepinus fed phytase-treated
soybean mealbased diets”, Aquacult. Nutr., 5, pp. 135–142.
63. Viveros A., Centeno C., Brenes A., Canales R., Lozano A., (2000) “Phytase
and acid phosphatase activities in plant feedstuffs”, J. Agr. F. Chem., 48, pp.
4009–4013.
64. Vohra A., Satyanarayana T., (2001), “Phytase production by the yeast, Pichia
anomala”, Biotechnol. Lett., 23, pp. 551–554.
65. Volfova O., Dvorakova J., Hanzlikova A., Jandera A., (1994), “Phytase from
Aspergillus niger”, Folia Microbiol, 39, pp. 481-484.
66. Winterstein, E., (1897), “Uber einen phosphorhaltigen Pflanzenbestandteil,
welcher bei der Spaltung Inosit liefert”, Berichte. Deutsch. Chem. Ges., 30,
pp. 2299 –2302
67. Xiang T., Liu Q., Deacon A. M., Koshy M., Kriksunov I. A., Lei G. X., Hao
Q., Thiel D J., (2004), “Crystal structure of a heat-resilient phytase from
Aspergillus fumigatus, carrying a phosphorylated histidine”, J. Mol. Biol., 339,
pp.437-445.
68. Xiong A. S., Yao Q. H., Peng R. H., Han P. L., Li X., Fan H. Q., Guo M. J.,
Zhang S. L., (2004), “Isolation, characterization, and molecular cloning of the
cDNA encoding a novel phytase from Aspergillus niger 113 and high
expression in Pichia pastoris”, J. Biochem. Mol. Biol., 37(3), pp. 282-291.
69. Yan L., Li C., Chen H., Wu Q., Shan Z., Han X., (2013), “Site-directed
mutagenesis improves the thermostability and catalytic efficiency of
Aspergillus niger N25 phytase mutated by I44E, T252R”, Appl. Biochem.
Biotechnol., pp. 25- 37.

K21-Sinh học thực nghiệm

28

Đặng Thị Kim Anh