i

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM HỒNG ĐIỆP

NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA
ENZYME POLYPHENOL OXIDASE Ở MỘT SỐ
GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG Ở THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - NĂM 2014


Người hướng dẫn khoa học: TS. HOÀNG THỊ THU YẾN
THÁI NGUYÊN - NĂM 2014
iii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả Phạm Hồng Điệp


Thái Nguyên, tháng 9 năm 2014.
Tác giả Phạm Hồng Điệp

v

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
i
LỜI CẢM ƠN
ii
MỤC LỤC
iii
NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
viii
MỞ ĐẦU
1

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
22
2.1. VẬT LIỆU
22
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
22
2.1.2. Hóa chất thiết bị
23
vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
23
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
23
2.2.2. Phương pháp điện di trên gel agarose
25
2.2.3. Phương pháp nhân gen bằng PCR
25
2.2.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR
27
2.2.5. Tách dòng gen mã hóa PPO……………….………………
28
2.2.6. Phương pháp xác định trình tự nucleotide
32
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu
32

Cặp base
Base pair
cDNA
cDNA
Complementary DNA
CTAB
CTAB
Cetyltrimethylammonium Bromid
DNA
Axit Deoxynucleic
Deoxyribonucleic Acid
dNTP
dNTP
Deoxynucleoside triphosphate
Đtg
đồng tác giả
et al
EDTA
EDTA
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
EtBr
EtBr
Ethidium Bromide
FAO
Tổ chức nông lương
thế giới
Food and Agriculture Organization
Gb
Gb
Giga bazơ

Axit Ribonucleic
Ribonucleic Acid
SDS
SDS
Natri Dodexyl Sulfat
TAE
TAE
Tris Acetate EDTA
Taq
Vi khuẩn chịu nhiệt
Thermus aquaticus


26
2.4
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
26
2.5
Thành phần phản ứng ghép nối gen PPO vào vector
pTZ57R/T
29
2.6
Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn SacI và XhoI
31
3.1
Hệ số tương đồng di truyền của các giống chè nghiên cứu so
với các trình tự đã công bố dựa trên trình tự nucleotide gen
PPO
42
3.2
Hệ số tương đồng di truyền các giống chè nghiên cứu so với
các trình tự đã công bố dựa trên trình tự amino acid suy diễn
từ gen PPO
42
x

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

giống chè Trung Du, Keo Am Tích và LDP1 với các
trình tự đã công bố
41
3.6
Mối quan hệ về trình tự gen PPO giữa các giống chè
nghiên cứu và chè Trung Quốc đã công bố
43 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
,
[8].
, p
, ,… [8]. Tỉnh Thái Nguyên là vùng chè trọng
điểm của cả nước, với diện tích chè hơn 18.500 ha, trong đó có gần 17.000 ha
chè kinh doanh, năng suất đạt 109 tạ/ha, sản lượng đạt gần 185 nghìn tấn.
Thái Nguyên được biết đến với danh trà Tân Cương. Vùng chè đặc sản Tân


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

3.
- Nhân, tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa polyphenol oxidase của 3
giống chè Trung Du, Keo Am Tích, LDP1.
- So sánh trình tự gen mã hóa polyphenol oxidase giữa các mẫu nghiên cứu và
với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen.

4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

Các nhà khoa học Trung Quốc đã có rất nhiều nghiên cứu chứng minh
giải thích nguồn gốc cũng như phân bố của cây chè cụ thể:
Carl Von Linnaeus là người đầu tiên xác nhận Trung Quốc là nguyên sản
của cây chè và định tên khoa học của chè là Theaceaae sinensis, phân thành
hai thứ chè là Thea bohea (chè đen) và Thea viridis (chè xanh) [6]. Bên cạnh
đó, các nhà khoa học Trung Quốc đã giải thích sự phân bố của chè mẹ như
sau: tỉnh Vân Nam là nơi bắt đầu hàng loạt các con sông lớn đổ về các con
sông ở Việt Nam, Lào, Campuchia và Mianma. Đầu tiên chè mọc ở Vân Nam,
sau đó lan dần ra các nơi khác [9].
* Cây chè có nguồn gốc từ vùng Atxam (Ấn Độ):
Năm 1823, Bruce đã phát hiện được những cây chè dại lá to ở vùng
Atxam (Ấn Độ), từ đó các học giả người Anh cho rằng: nguyên sản của cây
chè là vùng Atxam chứ không phải là ở vùng Vân Nam (Trung Quốc) [9].
* Cây chè có nguồn gốc từ Việt Nam:
Djemukhatze (1961- 1976) đã có những công trình nghiên cứu về phức
chất catechin của lá chè, so sánh về thành phần các chất catechin giữa các loại
chè được trồng và chè mọc hoang dại đã nêu luận điểm về sự tiến hóa hóa
sinh của cây chè, trên cơ sở đó ông đã kết luận: “Nguồn gốc cây chè chính là
ở Việt Nam” [6], [8].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây chè
Cây ch
[8]:
a. Hình thái
6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu



Hệ rễ: gồm rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu nâu hay nâu
đỏ và rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà.
b.
22 - 28
o

-
-
- 3 - 4 %
[1].
c.
) [29].
là thành phần quan trọng và chủ yế 75 –
80
, liên quan trực tiếp đến các quá trình hóa
sinh trong búp chè và có ảnh hưởng đến sự hoạt động của các enzyme.Trong
chế biến chè, nước có vai trò quan trọng trong các quá trình biến đổi, tạo nên
mùi vị và ngoại hình của búp chè, nó có liên quan trực tiếp đến chất lượng chè
nguyên liệu và chất lượng chè thành phẩm.
8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
– , g ,
pectin, (cellulose), protein, amino acid (cafein, theofilin,
theobromin (enzyme ) .
Tanin là hợp chất quan trọng trong lá chè, chủ yếu quyết định đến phẩm

b.
. cafein
10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
.
c. -
.
, .
d.
,… [1].
1.1.4. Tình hình sản xuất chè trên thế giới và ở Việt Nam
Theo thống kê của FAO năm 2010 (bảng 1.1), sản lượng chè thế giới
năm 2000 là 2,96 triệu tấn, tới năm 2010 là 4,1 triệu tấn, tăng trung bình
4,1%/ năm, 17 nước trồng chè ở Châu Á đã chiếm 89% diện tích trồng chè
trên thế giới, tiếp theo là châu Phi với 18 nước chiếm 9%.
Bảng 1.1. Sản lƣợng chè của một số nƣớc trên thế giới
Nƣớc
2006
2007
2008
2009
2010
Trung Quốc
1028,1
1165,5
1257,9

177,3
180,8
(Nguồn: Số liệu thống kê của FAO, năm 2010)
Ở Việt Nam, chè là cây công nghiệp dài ngày được bắt đầu sản xuất từ
hơn 3000 năm trước. Trước đây nhân dân chỉ trồng làm bóng mát và lấy búp
làm đồ uống giải nhiệt trên quy mô nhỏ lẻ. Do có khí hậu nhiệt đới gió mùa
ẩm với 2/3 diện tích lãnh thổ là đồi núi, cây chè đã trở thành cây trồng mang
tính chất sản phẩm hàng hóa, sản phẩm chè được đưa ra bán ở nhiều thị
trường là các quốc gia trên toàn thế giới. Theo thống kê của Tổng cục Hải
quan năm 2013, ản xuất và xuất khẩ 5
thế giới. Hiện nay, cả nước có 35 tỉnh trồng chè với diện tích khoảng 131
nghìn ha. Diện tích trồng chè còn tăng qua các năm. Tuy nhiên diện tích
trồng chè tập trung chủ yếu thuộc miền núi, trung du phía Bắc, tỉnh Nghệ An,
Lâm Đồng phát triển mạnh nhất ở các tỉnh Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hà
Giang, Phú Thọ, Yên Bái, Sơn La, Lạng Sơn. Số lượng các doanh nghiệp sản
xuất chè quy mô công nghiệp khoảng 700 doanh nghiệp. Có 230 doanh
nghiệp xuất khẩu trực tiếp ra nước ngoài tới khoảng hơn 100 nước trên thế
giới. Số lượng người lao động trong ngành chè là khoảng 1,5 triệu người.
Bảng 1.2. Diện tích, sản lƣợng, xuất khẩu chè của Việt Nam
Năm
Tổng diện
tích (ha)
Sản lƣợng
(tấn khô)
Số lƣợng XK
(tấn khô)
Kim ngạch
(triệu USD)
Giá XK bình
quân (USD/tấn)

2005
123.742
133.350
87.920
96,9
1.102
2006
125.574
142.500
105.116
111,6
1.062
2007
127.300
150.820
112.000
130,0
1.161
2008
129.600
158.000
104.361
146,9
1.408
2009
131.000
159.000
134.000
179,5
1.340

Các loại sản phẩm
Phƣơng pháp chế biến
Chè xanh
Sản phẩm thu được sau khi chế biến chè tươi theo sơ đồ
công nghệ: diệt men, sấy nhẹ hoặc không sấy nhẹ, vò, làm
tơi chè vò, sấy hoặc sao khô và phân loại.
Chè lục
Một dạng của chè xanh, trong đó toàn bộ quá trình chế biến
đều tiến hành trong chảo sao.
Chè đen
Sản phẩm thu được sau khi chế biến chè tươi theo sơ đồ
công nghệ: làm héo, vò, phân loại chè vò, lên men, sấy khô
Chè vàng
Chè vàng thuộc loại chè trung gian giữa chè xanh và chè đen
có đặc tính gần với chè xanh hơn. Sản phẩm thu được sau
khi chế biến chè tươi theo sơ đồ công nghệ: làm héo, diệt
men, vò phơi nắng hoặc sấy sơ bộ, ủ nóng, sấy khô, giữ
nhiệt chè bán thành phẩm và phân loại.
Chè đỏ
Chè đỏ là loại chè trung gian giữa chè đen và chè xanh, có
đặc tính gần với chè đen hơn. Sản phẩm thu được sau khi
chế biến chè tươi theo sơ đồ công nghệ: làm héo và lên men
kết hợp cùng một lúc (khi làm héo có định kỳ, lắc nhẹ, làm
dập tế bào để khi tiếp tục làm héo thì phần lá bị dập được lên
men) sau đó diệt men, vò, sấy khô và phân loại.
Chè mạn
Sản phẩm trung gian giữa chè đen và chè đỏ
Chè già
Chè khô thu được từ chè lá hoặc chè cành đã chế biến theo
sơ đồ công nghệ: xử lý nguyên liệu, diệt men, vò hoặc

sản lượng đạt gần 185 nghìn tấn. Xác định chè là cây trồng mũi nhọn, những
năm qua, tỉnh Thái Nguyên đã triển khai nhiều biện pháp để nâng cao năng
suất, chất lượng sản phẩm chè. Thái Nguyên đã chú trọng đến việc chọn lựa,
xây dựng cơ cấu giống chè phù hợp [5], [6].
15

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Bảng 1.4. Cơ cấu giống chè của tỉnh Thái Nguyên giai đoạn 2001 – 2010
Chủng loại/
Giống chè
Năm 2001
Năm 2005
Năm 2010
DT
(ha)
Tỷ lệ
(%)
DT
(ha)
Tỷ lệ
(%)
DT
(ha)
Tỷ lệ
(%)
Tổng diện tích
13.524

chè mới chọn tạo và các giống chè nhập nội. Điều đó cho thấy sự tăng lên về
năng suất cũng như chất lượng.
a. 1
(18 - 25 cm
2
-
-
- 6 -
.
–
- 139,23 mg/g
c .
b. Giống chè Keo Am Tích

Trích đoạn NHÂN GEN PPO Ở CÁC MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU

---