vbbvb

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VÕ THỊ MỸ THU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH BAO GÓI
CAROTENOID SỬ DỤNG TẾ BÀO NẤM MEN YARROWIA
LIPOLYTICA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

VÕ THỊ MỸ THU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH BAO GÓI
CAROTENOID SỬ DỤNG TẾ BÀO NẤM MEN YARROWIA
LIPOLYTICA

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Ngành:

Công nghệ sau thu hoạch

Mã số:


năm 2016

Tác giả luận văn

Võ Thị Mỹ Thu

iii


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện đề tài, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ của quý
phòng ban trƣờng Đại học Nha Trang, đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi đƣợc hoàn
thành đề tài. Đặc biệt là sự hƣớng dẫn tận tình của TS.Tạ Thị Minh Ngọc đã giúp đỡ
tôi hoàn thành tốt đề tài. Qua đây, tôi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến sự giúp đỡ của cô.
Xin cám ơn quý thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm và các cán bộ Trung tâm thí nghiệm thực hành Trƣờng Đại học Nha Trang đã tận tình giúp đỡ và tạo
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua. Xin cám ơn các thầy cô phản biện đã cho tôi
những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu đƣợc hoàn thành có chất lƣợng.
Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và tất cả bạn bè đã
giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày

tháng

năm 2016

Tác giả luận văn

Võ Thị Mỹ Thu



Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 31
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................................. 31
2.2. Môi trƣờng nuôi cấy nấm men ............................................................................... 31
2.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ................................................................................... 31
2.3.1. Hóa chất ............................................................................................................... 31
2. 3.2. Thiết bị sử dụng .................................................................................................. 32
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 32
2.4.1. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS ............................................. 32
2.4.2. Phƣơng pháp nuôi cấy nấm men ......................................................................... 33
2.4.3. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng BC thấm qua màng tế bào ............................ 33
2.4.4. Phƣơng pháp đếm tỷ lệ sống chết của tế bào nấm men....................................... 35
2.4.4.1. Phƣơng pháp nhuộm xanh methylene .............................................................. 35
2.4.4.2. Phƣơng pháp đếm tế bào sống chết bằng buồng đếm hồng cầu...................... 35
2.4.4.3. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc ............................................................................ 36
2.4.5. Phƣơng pháp xác định tính kỵ nƣớc và tính acid/base của bề mặt tế bào nấm
men ................................................................................................................................ 37
2.5. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm ............................................................................... 38
2.5.1. Xây dựng quy trình bao gói hợp chất carotenoid sử dụng tế bào nấm men đƣợc
thể hiện thông qua sơ đồ ................................................................................................ 38
2.5.2. Xác định tỉ lệ nồng độ BC đối với tế bào nấm men ............................................ 39
2.5.3. Xác định nhiệt độ tiếp xúc của BC với tế bào nấm men ..................................... 40
2.5.4. Xác định điều kiện tiếp xúc ................................................................................. 42
2.5.5. Xác định thời gian tiếp xúc giữa BC với tế bào nấm men .................................. 44
2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu ...................................................................................... 45
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................... 46
3.1. Xác định nồng độ BC thích hợp cho quá trình tiếp xúc tế bào nấm men............... 46
vi



A0

: Độ hấp thụ tại bƣớc sóng 600 nm của tế bào trƣớc khi trộn với dung môi.

A

: Độ hấp thụ đo tại bƣớc sóng 600 nm của tế bào sau khi trộn với dung môi.

viii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
BC

Beta caroten

BHT

Butylated hydroxy toluene

C

Cacbon

N

Nitơ

YPD

Bảng 1.4. Một số bƣớc sóng của caroten khi chiết trong các dung môi khác nhau ......21
Bảng 1.5. Một số nguyên liệu thích hợp để chế tạo vi nang .........................................25
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng (g/L) .......................................................................31
Bảng 3.1. Số khuẩn lạc của tế bào nấm men 0544 và W29 trên đĩa thạch (CFU/ml) ...55

x


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tế bào nấm men Y. lipolytica .........................................................................5
Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc của Y. lipolytica W29 trên môi trƣờng YPDA ở 27°C ...6
Hình 1.3. Hình thái tế bào Y. lipolytica W29 trên YPDA ở 27 °C ..................................6
Hình 1.4. Hình thái khuẩn lạc Y. lipolytica 0544 trên môi trƣờng YPDA ở 27 °C .........6
Hình 1.5. Hình thái tế bào Y. lipolytica 0544 trên môi trƣờng YPDA ở 27 °C ..............6
Hình 1.6. Sơ đồ phân loại carotenoid ............................................................................18
Hình 1.7. Công thức cấu tạo của β-caroten ...................................................................18
Hình 1.8. Công thức cấu tạo của  -caroten...................................................................19
Hình 1.9. Công thức cấu tạo của Lutein và zeaxanthin .................................................20
Hình 1.10. Công thức cấu tạo của astaxanthin ..............................................................20
Hình 1.11. Sơ đồ quy trình tạo vi nang BC bằng tế bào nấm men ................................ 27
Hình 1.12. Cấu trúc tế bào nấm men và bao vi nang ....................................................27
Hình 1.13. Sự vận chuyển hợp chất kỵ nƣớc qua màng tế bào .....................................29
Hình 1.14. Sự giải phóng hoạt chất khỏi màng tế bào ..................................................30
Hình 2.1. Sơ đồ xác định hàm lƣợng BC thấm qua màng tế bào bằng phƣơng pháp
UV-VIS ..........................................................................................................................34
Hình 2.2. Trình tự pha loãng mẫu theo dãy thập phân ..................................................36
Hình 2.3. Quy trình bao gói hợp chất carotenoid sử dụng tế bào nấm men ..................39
Hình 2.4. Sơ đồ lựa chọn nồng độ carotene/dầu ăn thích hợp ......................................40
Hình 2.5. Sơ đồ lựa chọn nhiệt độ tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men ..............41
Hình 2.6. Sơ đồ lựa chọn điều kiện tiếp xúc thích hợp giữa BC với nấm men ............43

giúp ngăn ngừa đáng kể các bệnh. Do đó ngày nay, các hợp chất carotenoid rất đƣợc
quan tâm nghiên cứu, nhằm mục đích ứng dụng trong sản xuất thuốc chữa bệnh và
thực phẩm chức năng.
Việc sử dụng màng tế bào nấm men trong công nghệ bao gói vi nang sẽ là bƣớc
quan trọng giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất độc hại trong quy trình, đồng thời cũng
làm đơn giản hóa quy trình. Sử dụng tế bào nấm men làm vật liệu bao gói các hoạt
chất theo phƣơng pháp vi sinh là một vấn đề hoàn toàn mới.
Do đó, mục tiêu của đề tài nhằm: nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói
carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y. lipolytica, đồng thời nghiên cứu quá trình thẩm
thấu các hợp chất kị nƣớc qua màng tế bào nấm men, ứng dụng để bổ sung vào thực
phẩm và nuôi trồng thủy sản, sử dụng màng tế bào nấm men bao gói các hợp chất kị
nƣớc.
Các tế bào nấm men Y. lipolytica chủng W29 và chủng 0544 đƣợc nuôi cấy trên
môi trƣờng YPD tại 27°C, tốc độ lắc 150 rpm và cho tiếp xúc với hợp chất kị nƣớc.
Sau đó, thu sinh khối, đem sinh khối nấm men tiếp xúc với dầu carotene theo các điều
kiện khác nhau bao gồm: tỉ lệ nồng độ beta caroten/dầu ăn, thời gian tiếp xúc với nhũ
tƣơng dầu beta caroten, nhiệt độ tiếp xúc. Bên cạnh đó, tỉ lệ sống chết của tế bào trƣớc
và sau khi tiếp xúc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp nhuộm xanh methylen. Tính chất
xiii


bề mặt của tế bào đƣợc xác định theo phƣơng pháp test Microbial adhesion to solvents
(Test MATS).
Từ đó, đề tài đã rút ra đƣợc các điều kiện tốt nhất cho quy trình bao gói
carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y. lipolytica là: nồng độ BC/dầu ăn sử dụng:
1mg/ml, tiến hành tiếp xúc tế bào nấm men với nhũ tƣơng dầu caroten, nhiệt độ tiếp
xúc 27°C và thời gian tiếp xúc là 16 h.
Kết quả của nghiên cứu này góp phần làm sáng tỏ cơ chế tƣơng tác giữa màng
tế bào nấm men và các hợp chất kỵ nƣớc (hay khả năng thấm của màng tế bào) với yếu
tố ảnh hƣởng nhƣ: tỉ lệ nồng độ caroten/dầu ăn khi sử dụng, thời gian tiếp xúc, nhiệt

nay cùng với nguồn thực thẩm phong phú ở Việt Nam, việc phát triển công nghệ vi
nang trong ngành thực phẩm ở nƣớc ta là rất có triển vọng.
Hiện tại, phƣơng pháp sử dụng tế bào nấm men trong công nghệ bao gói vi
nang vẫn còn ít đƣợc công bố trên thế giới và trong nƣớc. Cụ thể, đó là các nghiên cứu
về:
-

Nghiên cứu của TS.Waché, Agrosup Dijon–France về bao gói bằng tế bào nấm

men. Trong đó, nghiên cứu này sử dụng chủng nấm men ƣa béo Y. lipolytica để bao
gói beta-caroten [39].
-

Nghiên cứu của Amaral và cộng sự về tính chất màng tế bào Y. lipolytica và sự

tƣơng tác của nó với perfluorocarbon (PFC) [9].

1


-

Nghiên cứu của Aguedo và cộng sự về tính chất bề mặt của Y. lipolytica và sự

liên quan của nó đến sự hình thành γ-decalactone từ cơ chất methyl ricinoleate [8].
-

Nghiên cứu của Aguedo và cộng sự về quá trình cho và nhận điện tử, ảnh

hƣởng của sự bám dính giữa các giọt dầu với tế bào nấm men Y. lipolytica đƣợc đánh

- Hạn chế trong việc chọn vật liệu bao gói, tƣơng tác với lõi, tính ổn định….
- Quá trình chế biến phức tạp, đôi khi không đạt chuẩn thực phẩm nhƣ chọn hệ
dung môi để rửa…
Do đó, dựa trên sự tƣơng đồng giữa cấu trúc của tế bào nấm men và vi nang
cùng với những đặc tính ƣu việt của nó, màng tế bào nấm men đƣợc xem là một màng
bao bảo vệ rất tốt cho các chất chứa bên trong nó. Trong đó, một số chủng nấm men ƣa
béo nhƣ Y. lipolytica đang đƣợc các nhà nghiên cứu quan tâm trong nghiên cứu ứng
dụng các hợp chất kị nƣớc nhằm sản xuất và bao gói các hợp chất thiên nhiên có giá trị
cao nhƣ tinh dầu gừng, polyphenol, curcumin, beta-caroten... Sử dụng màng tế bào
nấm men sẽ là bƣớc quan trọng giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất độc hại trong quy
trình, đồng thời cũng làm đơn giản hóa quy trình tạo vi nang.
Xuất phát từ thực trạng trên tôi đã chọn hƣớng đề tài: “Nghiên cứu xây dựng
quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men Yarrowia Lipolytica”
Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men Y.
lipolytica nhằm ứng dụng để bổ sung vào thực phẩm và nuôi trồng thủy sản.
Tính mới của đề tài
Công nghệ bao gói vi nang dùng trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt
là bao gói BC hiện nay đều dựa trên tính chất vật lý, hóa lý, hóa học giữa vật liệu vỏ
và hoạt chất lõi.Việc sử dụng tế bào nấm men làm vật liệu bao gói các hoạt chất
theophƣơng pháp vi sinh là vấn đề hoàn toàn mới, giúp loại bỏ việc sử dụng hóa chất
độc hại trong quy trình, đồng thời cũng làm đơn giản hóa quy trình tạo vi nang.
Nội dung nghiên cứu
 Xây dựng quy trình bao gói carotenoid sử dụng tế bào nấm men qua các thông
số sau:
 Nồng độ beta carotene/dầu ăn khi sử dụng
 Nhiệt độ tiếp xúc
3



Đây là một nấm men lƣỡng hình hình thành các tế bào chồi, các sợi nấm hoặc
giả sợi nấm tùy theo điều kiện nuôi cấy nhƣ thông gió, nguồn carbon hoặc nguồn nitơ,
pH… [30]. Khuẩn lạc của Y. lipolytica có nhiều hình dạng khác nhau nhƣ nhẵn và lấp
lánh, cuộn xoắn, sần sùi và màu trắng đục.
5


a 1a
a2

Figure 1
Figure 2
Figure 3
Figure 4
Figure 5
Figure 6
Hình 1.2 1
Hình 1.2 2

Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc của Y.

Hình 1.3. Hình thái tế bào Y. lipolytica

lipolytica W29 trên môi trƣờng YPDA ở

W29 trên YPDA ở 27 °C

27°C

Hình 1.4. Hình thái khuẩn lạc Y.

cellulase cho nên không sử dụng trực tiếp đƣợc tinh bột, cellulose, hemicellulose mà
sử dụng đƣờng hexose. Y. lipolytica có khả năng phân hủy nhiều loại đƣờng hexose
nhƣ glucose, fructose và mannose. Đối với Y. lipolytica hệ thống vận chuyển glucose
hoạt động không phụ thuộc vào nồng độ glucose trong môi trƣờng [27, 32].
Các hexose nội bào đi vào chu trình đƣờng phân sau giai đoạn photpho hóa.
Glucose, fructose và mannose đƣợc phosphoryl hóa bằng hexokinases. Hầu hết các
hexokinases bị ức chế bởi threalose -6P, một thành phần quan trọng trong thủy phân
glucose ở S. cerevisiae. Hexokinases ở Y. lipolytica chƣa đƣợc bị ức chế bởi trehalose
[30].
Nồng độ glucose cao không ảnh hƣởng đến tốc độ hô hấp, hàm lƣợng và tỉ lệ
phân tử của cytochrome hoặc tính chất của ti lạp thể trong Y. lipolytica. Tuy nhiên, sản
xuất Y. lipolytica IMUFRJ 50682 dƣới sự kiềm chế hay không kiềm chế glucose thì
không phụ thuộc vào chất cảm ứng. Saccharose không thể đƣợc sử dụng bởi chủng Y.
lipolytica hoang dã vì thiếu enzyme chuyển hóa saccharose.
7


Bên cạnh đó, Y. lipolytica cũng có thể sử dụng ethanol làm nguồn C ở nồng độ
lên đến 3%. Nồng độ ethanol cao hơn sẽ là chất độc. Một số enzyme NAD+ và NADP+
dehydrogenases đã đƣợc nghiên cứu có trong nấm men Y. lipolytica. Sự tổng hợp của
hai enzyme dƣờng nhƣ không bị kiềm chế bởi glucose hoặc cảm ứng bởi ethanol.
Glycerol cũng đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn C trong điều kiện hiếu khí ở nhiều
loài nấm men [5], đƣợc đồng hóa thông qua con đƣờng glycerol-3-phosphate hoặc
dihydroxyacetone. Một số nấm men đƣợc cho là đồng hóa glycerol qua
dihydroxyacetone. Ban đầu glycerol đƣợc oxy hóa thành dihydroxyacetone bởi
glycerol dehydrogenase và sau đó đƣợc phosphoryl hóa thành phosphate
dihydroxyacetone bởi dihydroxyacetone kinase. Papanikolaou và cộng sự đã sử dụng
thành công glycerol thô trong việc nuôi Y. lipolytica và sản xuất acid citric. Môi
trƣờng glycerol ban đầu cao (40 g/l) với N hạn chế dẫn đến việc tiết ra acid citric lên
đến 35 g/l (sản lƣợng 0,42 – 0,44 g acid/g glycerol tiêu thụ).

trƣờng phát triển ankan của Y. lipolytica. Chất nhũ hóa sinh học này đƣợc gọi là Liposan
bao gồm 83% carbohydrate và 17% protein. Một chủng Y. lipolytica khác cũng có khả
năng sản xuất chất nhũ hóa sinh học, với thành phần tƣơng tự, chỉ có mặt của glucose nhƣ
nguồn cacbon, cho thấy việc sản xuất các tác nhân hoạt động bề mặt là một đặc tính cấu
thành của nấm men này [29].
Bảng 1.1. Nguồn C đƣợc vi sinh vật sử dụng [2]
Nguồn C

Các dạng hợp chất

Đƣờng

Glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột,
galactose, lactose, mannite, cellobiose, cellulose,
hemicellulose, chitin...

Acid hữu cơ

Acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao,
acid béo bậc thấp, aminoacid...

Rƣợu

Ethanol

Lipid

Lipid, phospholipid

Hydrocarbon

phẩm phân hủy của protein (peptone, peptide, aminoacid…), muối amon, nitrat, N
phân tử, purine, pyrimidin, ure, amin, amid, cyanid [3].
Bảng 1.2. Nguồn N đƣợc vi sinh vật sử dụng [2]
Nguồn N

Các dạng hợp chất

Protein và các sản

Peptone, peptide, aminoacid... (một số vi sinh vật tiết

phẩm phân giải của

men proteinase phân giải protein thành các hợp chất phân tử

protein

nhỏ hơn rồi mới hấp thu đƣợc vào tế bào)

Ammone và muối

NH3, (NH4)2SO4, ... (dễ đƣợc hấp thu)

ammone
Nitrate

KNO3 (dễ đƣợc hấp thu)

N phân tử


hóa một cách hiệu quả và các tế bào có thể đối phó với tăng áp suất. Khi áp suất dƣới 6
bar thì khối lƣợng sinh khối và tốc độ phát triển tăng tƣơng ứng 5 và 3,4 lần.
 Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hƣởng không những đối với sự sinh trƣởng, phát triển của vi
sinh vật mà còn đối với sự trao đổi chất của chúng (ảnh hƣởng đến tốc độ của các phản
ứng hóa học và sinh hóa học).
Nấm men là những vi sinh vật ƣa mát (chúng có nhiệt độ tối ƣu ở khoảng 25°C,
nhƣng cũng có thể thích nghi ở 0°C), nhƣng cũng có một số nấm men có thể phát triển
đƣợc ở 45°C.
Nhiệt độ thấp thƣờng không làm chết vi sinh vật ngay mà nó tác động lên khả
năng chuyển hóa các hợp chất, làm giảm hoạt động của các hệ enzyme, làm chậm quá
trình trao đổi chất của vi sinh vật. Vì vậy nhiệt độ càng thấp sẽ làm cho vi sinh vật mất
khả năng phát triển và sinh sản. Nhiều trƣờng hợp vi sinh vật sẽ bị chết nhƣng khả
năng gây chết hết sức từ từ không giống nhƣ đối với nhiệt độ cao. Nhiệt độ cao thƣờng
11