SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01

Khóa luận tốt nghiệp

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----

-----

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG
VIÊM, TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH CỦA POLISACCARIT TỪ CÂY
THUỐC XUÂN HOA P. PALATIFERUM

Người hường dẫn

: TS VÕ HOÀI BẮC

Sinh viên thực hiện

: VŨ THỊ THU TRANG

Lớp

: 12-01

HÀ NỘI - 2016



MỤC LỤC
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 2
1.1. Giới thiệu chung về cây Xuân Hoa.....................................................................2
1.1.1. Đặc điểm thực vật. ................................................................................ 2
1.1.2. Kinh nghiệm dân gian sử dụng lá cây Xuân Hoa. ................................. 3
1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa. .. 5
1.1.4. Những nghiên cứu in vitro về dược tính. ............................................... 5
1.1.5. Những nghiên cứu in vivo về dược tính. ................................................ 6
1.2. Polisaccarit. ..........................................................................................................8
1.2.1.Oligosaccarit. ........................................................................................ 8
1.2.2. Polisaccarit. ......................................................................................... 9
1.3. Vai trò sinh học và tác dụng của polisaccarit thực vật. ....................................13
1.3.1. Vai trò sinh học và ý nghĩa kinh tế...................................................... 13
1.3.2. Tác dụng chữa bệnh của một số polisaccarit thực vật. ....................... 14
PHẦN II ....................................................................................................... 17
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯÚ ....................................... 17
2.1. Vật liệu...............................................................................................................17
2.1.1. Nguyên liệu thực vật. .......................................................................... 17
2.1.2. Hóa chất, thiết bị. ............................................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................17
2.2.1. Xử lý nguyên liệu. ............................................................................... 17
2.2.2. Các phản ứng định tính đặc trưng. ..................................................... 17



2. Đề nghị..................................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 38
PHỤ LỤC .................................................................................................... 44


SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
A490

: Bước sóng

A585

: Bước sóng 585nm

BSA

: Bovine seurum albumin

CY

: Cyclophosphamide

OD

: Optical density


Bảng 3.6: Sự thay đổi trọng lượng của chuột trong 5 ngày thí nghiệm ......... 35
Bảng 3.7: Trọng lượng tương đối của tuyến ức , lách, hàm lượng
hemoglobin(Hb), số lượng hồng cầu (HC), bạch cầu(BC) ............................ 35


SV: Vũ Thị Thu Trang – Lớp:12-01

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Phản ứng định tính nhận biết polisaccarit ..................................... 24
Hình 3.2 Sơ đồ chiết rút chế phẩm polisaccarit............................................. 30
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ ánh sáng của polisaccarit chiết từ lá
cây Xuân Hoa ............................................................................................... 31
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của pH đến chế phẩm polisaccarit 32
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến chất lượng chế phẩm
polisaccarit ................................................................................................... 32


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Theo Y học cổ truyền, nhiều vị thuốc chứa chất nhầy được dùng phổ
biến trong tạo máu, chống viêm, chữa lành vết thương... Trong những năm
gần đây polisaccarit là những nhóm hợp chất rất được các nhà khoa học trên
thế giới quan tâm do các tác dụng quan trọng của chúng về tăng cường miễn
dịch, kháng bổ thể, kháng viêm, chống loét, chống đông máu, phân hủy fibrin.
Các nghiên cứu trước đây cho thấy trong lá cây Xuân Hoa P. palatiferum
chứa hàm lượng cao polisaccarit.
Cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk thuộc họ
Ôrô Acanthaceae được dùng trong dân gian Việt Nam để chữa nhiều bệnh

(2000), chi Pseuderanthemum có khoảng 196 loài. Ở Việt Nam, chi
Pseuderanthemum có 9 loài và 2 thứ.
Đề tài của chúng tôi nghiên cứu polisaccarit trên đối tượng là cây Xuân
Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk.
Mô tả: Cây có thể mọc cao từ 1-2m sống lâu năm, thân cây xanh màu
tím lục, khi già chuyển thành màu nâu, phân ra nhiều nhánh, lá mọc đối
diện có hình mũi mác, dài từ 12-15cm, rộng 3,5-5cm, nếp lá nguyên, cuống
lá dài 1-2,5cm, cụm hoa dài 10-16cm. Hoa mọc ở kẽ lá hoặc ở đầu cành.
Hoa lưỡng tính, không đều.
Phân bố: Cây Xuân Hoa mọc hoang ở nhiều nơi, được coi là cây thuốc
quí có uy tín trong dân gian ở các tỉnh thành miền Bắc, nhất là thủ đô Hà Nội.
Từ năm 1998, rộ lên việc trồng cây Xuân Hoa để chữa những bệnh thuộc về
nhóm bệnh đường tiêu hóa.

2


Hình 1.1: Cây Xuân Hoa
1.1.2. Kinh nghiệm dân gian sử dụng lá cây Xuân Hoa.
Năm 2005, bác sĩ Xuân Lục đưa ra một số bài thuốc từ kinh nghiệm
dân gian đã sử dụng lá cây Xuân Hoa:
• Chữa bệnh về đường tiêu hóa (đi lỏng, rối loạn tiêu hóa, táo bón, đau
bụng không rõ nguyên nhân): ăn từ 7-9 lá, khoảng 2-3 lần/ngày cho đến khi
khỏi, có thể nấu canh nhạt để ăn.
• Bệnh kèm theo chảy máu (chảy máu dạ dày, đường ruột, đái ra máu,
phân ra máu kể cả đái buốt, đái rắt,…): ăn lá khi đói hoặc sắc nước lá đặc để
uống, có thể nấu canh độ một bát nhỏ. Ăn 1-5 lần, máu sẽ cầm, nên ăn ngày 2
lần.
• Các bệnh ung thư thời kì phát bệnh: ăn lá xong, cơn đau giảm dần,
người tỉnh táo, ăn ngủ tốt, có cảm giác như khỏi bệnh. Thử nghiệm qua một số

uống. Với vết thương kín, có thể nhai để đắp, vết thương hở thì nên giã để
đắp.
• Chữa cảm cúm: nếu kéo theo rối loạn tiêu hóa, đau đầu, mệt mỏi,
nhiệt độ cao, nên ăn lá cách 2 giờ, cơn sốt nhanh chóng hạ đồng thời rối loạn
tiêu hóa cũng khỏi. Sau cơn sốt, nên ăn cháo có lá thuốc trộn vào giúp cho
người bệnh mau chóng trở lại bình thường.
• Khôi phục sức khỏe: khi mệt mỏi toàn thân hoặc cần nâng cao sức
chịu đựng cường độ cao, nên ăn như liều đinh 5-7 lá trước nửa giờ. Trẻ con đi
lỏng nên lấy từ 1-2 lá giã lấy nước cho uống.
4


1.1.3. Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học trong lá cây Xuân Hoa.
Năm 2000, Nguyễn Thị Minh Thu và cộng sự đã cô lập được các hợp
chất phytol, β-sitosterol, hỗn hợp hai đồng phân stigmasterol và
poriferasterol, β-sitosterol 3- β-O-D-glucopyranoside từ lá cây Xuân Hoa
[Nguyễn Thị Minh Thu, 2000].
Năm 2003, Phan Minh Giang và cộng sự đã cô lập từ lá khô cây Xuân
Hoa hợp chất 1-pentacosanol, palmitic acid, β-sitosterol, stigmasterol, hỗn
hợp

β-sitosterol

3-O-β-D-glucopyranoside

và

stigmasterol

3-O-β-D-

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes), nấm mốc (Aspergillus
niger, Fusarium oxysporum, Pyricularia oryzae, Rhezoctonia solanii), nấm
men (Saccharomyces cerevisiae, Candidaalbicans)[Trần Công Khánh, 1998].
Các nhà khoa học [Phan Minh Giang, 2005] đã khảo sát sơ bộ hoạt tính
kháng khuẩn và kháng nấm của cao ethyl acetate và n-butanol (ở nồng độ 10
mg/ml) từ lá cây Xuân Hoa, các kết quả cho thấy cả hai loại cao trích đều thể
hiện khả năng kháng các chủng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis,
Staphylococcus aureus), Gram âm (Escherichia coli) và vi nấm (Candida
albicans, Candida stellatoides), trong đó cao trích ethyl acetate có hoạt tính tốt
hơn cao trích n-butanol. Kết quả cũng cho thấy cao trích ethyl acetate kháng tốt
các chủng Salmonella typhi 158, Shigella flexneri và Escherichia coli, đây là
những vi khuẩn gây bệnh về đường ruột, tiêu chảy, viêm ruột, lị.
b) Hoạt tính kháng oxy hóa.
Các nghiên cứu [Phan Minh Giang, 2005] đã nghiên cứu hoạt tính
kháng oxy hóa của các loại cao ethyl acetate và n-butanol từ lá cây Xuân Hoa
bằng phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các loại cao này lên độ hoạt
động của enzyme peroxydase trong máu. Kết quả cho thấy cả hai loại cao
ethyl acetate và n-butanol từ lá cây đều có tác dụng kháng oxy hóa .
1.1.5. Những nghiên cứu in vivo về dược tính.
a) Thử độc trên động vật thử nghiệm.
Năm 1999, Lê Thị Lan Oanh và cộng sự đã khảo sát độ độc của dịch chiết
lá cây Xuân Hoa trên cá chọi. Kết quả cho thấy dịch chiết lá không độc với cá
chọi vì với nồng độ 50% cá vẫn không chết sau 5 ngày [Lê Thị Lan Oanh,
1999].

6


Kết quả thử nghiệm độc tính của lá khô cây Xuân Hoa cũng đã được
thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế, áp dụng trên thỏ và chuột thí


hàm lượng men gan có giảm nhưng không đáng kể, có dấu hiệu bình phục tế
bào gan [Nguyễn Thị Minh Thu, 1999].
c) Tác dụng trị tiêu chảy.
Năm 2006, Diệu HK và cộng sự đã xác định hiệu quả của bột lá Xuân
Hoa trong trị bệnh tiêu chảy heo con theo mẹ, so sánh với hai chế phẩm Colinorgent và Cotrimxazol. Kết quả 3 ngày điều trị cho thấy bột lá khô có tỉ lệ
khỏi bệnh cao hơn và tỉ lệ tái phát thấp hơn so với kháng sinh Coli-norgent
(90,48% / 9,52%) và Cotrimxazol (83,33% / 14,29%)[ Diệu, 2006].
1.2. Polisaccarit.
Polisaccarit là các saccarit bao gồm từ hai đến hiều gốc đường đơn kết
hợp với nhau. Polysaccarit được chia thành 2 phân nhóm oligosaccarit và
polisaccarit.
1.2.1.Oligosaccarit.
Oligosaccarit bao gồm không quá 10 gốc monosaccarit kết hợp với
nhau bằng liên kết O-glucozit. Oligosaccarit phổ biến nhất là nhóm disaccarit
bao gồm các đường kép điển hình. Ngoài disaccarit còn có trisaccarit,
tetrasaccarit.
Các disaccarit phổ biến là mantoz,lactoz và saccatoz. Ví dụ :
+ Mantoz( còn gọi là đường mạch nha), được cấu tạo từ 2 phân tử α-Dglucoz. Liên kết glucozit được tạo thành giữa một OH-glucozit với OH ở C4
của gốc glucoz thứ hai. Do đó phân tử manozo vẫn còn chứa một nhóm OHglucozit tự do, nên vẫn giữ được tính khử nhưng chỉ bằng một nửa của
glucoz.
+ Saccaroz (đường mía) được cấu tạo từ α-D-glucoz và β-D-glucoz. Hai
monosaccarit này kết hợp với nhau qua liên kết glucozit được tạo thành giữa hai
nhóm OH-glucozit của chúng. Vì vậy sacaroz không có tính khử, sacaroz hòa
tan tốt trong nước.
+ Trisaccarit phổ biến và được biết rõ hơn cả là rafinoz. Rafinoz được
cấu tạo chủ yếu từ 3 monosaccarit là glucoz và fructoz.

8




thành dextran. Dextran được dùng làm chất thay thế huyết thanh của máu và
nó cũng là nguyên liệu ban đầu sản xuất sephadex – là những rây phân tử có
nhiều ứng dụng thực tế trong phòng thí nghiệm.
• Polisaccarit động vật điển hình [Phạm Thị Trân Châu,1997]:
Trong hàm lượng nhỏ hơn so với polisaccarit ở thực vật nhưng
polisaccarit ở động vật giữ vai trò quan trọng trong cơ thể động vật.
Polisaccarit ở động vật chia thành các loại như glicogen, kitin, heparin,…
+ Glicogen cũng thuộc glucan, là polysaccarit dự trữ ở động vật và
người. Trong đó, glicogen có cấu tạo phân nhánh tương tự amilopectin của
tinh bột nhưng có độ phân nhánh nhiều hơn. Phần lớn các gốc glucoz trong
phân tử kết hợp với nhau tạo liên kết α-1→4-glucozit, liên kết α-1→6glucozit ở chỗ phân nhánh của phân tử. Glicogen có thể bị thủy phân dưới tác
dụng của enzymee hoặc axit, khi thủy phân hoàn toàn nhận được α-D-glucoz.
Glicogen hòa tan trong nước nóng, và có màu đỏ tím hoặc đỏ nâu với Iot. Ở
động vật glicogen tập trung chủ yếu ở gan và cơ [Trần Thị Áng,1997]
+ Kitin do các gốc N-axetil β-glucozamin kết hợp với nhau bằng liên
kết β-1→4-glucozit. Kitin là hợp phần chính của bộ khung bên ngoài của
ngành chân khớp và một số động vật không xương sống khác. Về số lượng
kitin chiếm vị trí thứ 2 trong xenluloz, trong các hợp chất hữu cơ có trên quả
đất. Nếu xử lý kitin bằng kiềm đặc kết hợp với nung nóng 1 phần nhóm Naxetil sẽ bị tách và tạo thành chitozan. Chitozan đang được ứng dụng rộng rãi
trong các lĩnh vực khác nhau: thực phẩm, dược phẩm, công nông nghiệp…
+ Heparin là một mucopolysaccarit có tính chất sinh học quan trọng, là
chất chống đông máu. Heparin có trong nhiều tổ chức của cơ thể, nhưng chủ
yếu là ở gan , phổi và cơ. Thường heparin được liên kết với protein.
• Các polisaccarit thực vật điển hình [Phạm Thị Trân Châu ,1997 ]:
Trong tự nhiên polisaccarit thực vật có tầm quan trọng đặc biệt đối với
cuộc sống và có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị.

10

11


dịch có độ nhớt rất cao. Amiloz có phân tử lượng 10.000-100.000 Da, còn
phân tử lượng của amilopectin lại xê dịch 50.000-1.000.000 Da. Hóa tính đặc
trưng nhất của tinh bột là phản ứng màu với iot. Tinh bột tương tác với iot tạo
màu xanh và đôi khi thấy màu đỏ. Tinh bột được dùng để sản xuất glucoz,
rượu etylic, thuốc thử iot, tá dược trong viên nén,…
+ Xenluloz là polisaccarit cấu trúc phổ biến nhất của thực vật và cũng là
chất hữu cơ phổ biến nhất trên hành tinh của chúng ta. Hằng năm lượng
xenluloz do cây trồng tổng hợp nên là 1011tấn. Xenluloz là thành phần chính
của màng tế bào thực vật. xenluloz chiếm 50% trong gỗ và 90% trong bông.
Xenluloz là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucoz kết hợp với
nhau qua liên kết β-1→4-glucozit. Số gốc glucoz trong xenluloz xê dịch
50.000-106 Da. Xenluloz và dẫn xuất của nó có giá trị to lớn trong nhiều
ngành (sợi, giấy sợi nhân tạo, chất dẻo, chất nổ...).
+ Pectin là những chất polisaccarit pectin có phân tử lớn mà phần tử
chính của phân tử cấu tạo bởi axit poligalacturonic, do đó được xếp vào nhóm
poliuronic. Pectin thường gặp trong các bộ phận của cây và một tảo. Đặc biệt
cùi trắng của một số cây họ cam quýt (rutaceate) như bưởi, cam, chanh chứa
hàm lượng pectin rất cao, có thể lên đến 30%. Pectin chia làm 2 loại : pectin
hòa tan có trong dịch tế bào và protopectin là dạng không hòa tan nằm trong
thành tế bào và các lớp gian bào.
+ Gôm và các chất nhầy : Gôm là những polisaccarit được tiết ra ở
dạng dịch keo khô ở những vết nứt, vết chặt, lỗ đục sâu,…như gôm arập từ
cây Acacia verele mọc ở ven vùng sa mạc Ai cập. Gôm có nguồn gốc bệnh lý
và sự tiết ra gôm là một phản ứng với điều kiện bất lợi.
+ Chất nhầy phần lớn là polisaccarit thuộc nhóm galactomannan,
thường có cấu trúc mạch thẳng chủ yếu tạo bởi gốc D- manopiranoz, kết hợp
với nhau bằng mối liên kết β - 1→4 nhưng cũng có mạch nhánh tạo bởi các

nghiệp khác.
- Ngoài ra nhóm polisaccarit nhầy với cấu trúc phức tạp và đa dạng có
vai trò quan trọng trong y học, dược học, công nghiệp thực phẩm,…

13


1.3.2. Tác dụng chữa bệnh của một số polisaccarit thực vật.
Theo y học cổ truyền thì nhiều vị thuốc chứa chất nhầy được dùng phổ
biến trong tạo máu, chống viêm, chữa lành vết thương,…[Lê Xuân
Thám,1999]. Trong những năm gần đây polisaccarit là những nhóm hợp chất
rất được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm do các tác dụng quan trọng
của chúng về tăng cường miễn dịch, kháng bổ thể, kháng virut, chống loét,
chống đông máu, phân hủy fibrin [Zheng, 2009]. Một số công trình nghiên
cứu về tính chất hóa học và tác dụng chữa bệnh của polisaccarit đã được công
bố trên tạp chí khoa học.
Năm 1992, Puhlann. J công bố hai loại polisaccarit peptin chứa ion kim
loại chiết xuất từ Achyrocline Satureioides có hoạt tính miễn dịch và kháng
bổ thể trong môi trường in vitro đã công bố quy trình tách chiết và phương
pháp nghiên cứu tính chất hóa học của polisaccarit từ cây cedrelatubifiora có
hoạt tính kháng bổ thể intro [Grabowska, 1997]. Một số galaclomannan và
các dẫn xuất chứa sunfat của chúng được chiết xuất từ một số cây họ đậu có
hoạt tính chống đông máu, phân hủy fibrin và kháng virut CB5 invitro
[Ooi,2000]. Polisaccarit trung tính (Seleroglucan) từ Selerotium glucanicum
có tác dụng kháng virut mụn rộp Herpes loại [Stimpel, 1984].
Nhiều nghiên cứu cho thấy các polysaccarit từ thực vật có khả năng
điều hòa miễn dich [Nath, 1992], kháng viêm [Ooi, 2000], làm tan các cục
máu đông [Puhlann,1992], cải thiện hệ tuần hoàn máu ở tim [Zeny, 2009], khả
năng quét các gốc tự do và chống ung thư [Ooi, 2000; Kainoor, 2009] . Ví dụ
các polysaccarit tách từ Agaricus subrufescens [Lowry,1951], Lentinula edodes

thành bột mịn.
2.1.2. Hóa chất, thiết bị.
Hóa chất: Glucoz, phenol đỏ,axit sunfuaric, xanh bromnothymol,
butanol, trichloroaxetic, cresol, etalnol 96o, chlorophom, Na2SO4, HCl,
H2SO4, NaOH, xanh metylen, axetat chì. Dung dịch BSA (bovine seurum
albumin) , anthron, Các hóa chất khác có độ sạch phân tích.
Máy móc,

thiết bị:

máy quang

phổ 8452 ADIODEARAY

SPECTROPHOTOMETER, máy li tâm Sorvall RC26 plus, Máy đo độ nhớt
Fann VG, máy vontexed, tủ sấy, máy xay, cân kĩ thuật, bể ổn nhiệt, buret,ống
phancol, ống ependoc,..và các dụng cụ thủy tinh cần thiết
2.2. Phương pháp nghiên cứu.
2.2.1. Xử lý nguyên liệu.
Lá cây Xuân Hoa sau khi thu hái, rửa sạch, phơi chỗ râm mát đến ráo
nước rồi sấy khô ở nhiệt độ khoảng 50-60oC ở trong tủ sấy, xay nhỏ lá thành
bột.
2.2.2. Các phản ứng định tính đặc trưng.
+ Cho 1ml dung dịch mẫu đã chiết vào ống nghiệm, thêm 3ml etanol
96º,nếu xuất hiện tủa màu trắng chứng tỏ có polisaccarit.
+ Lấy 1ml dung dịch mẫu đã chiết vào ống nghiệm, trộn đều trong 1ml
NaOH 10% , nếu có polisaccarit thì dung dịch chuyển sang màu vàng.
17




Kết quả

(1mg/ml)

(µl)

glucoz

5%

sunfuric

đo OD

(µg)

(µl)

(ml)

(490nm)

(µl)
1

10

390


200

1

0,44

4

40

360

40

200

1

0,62

5

50

350

50

200