BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
--------------

--------------

NGUYỄN HẢI ðĂNG

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT
KHÁNG THỂ ðƠN DÒNG KHÁNG PROGESTERON

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành
Mã số

: CHĂN NUÔI
: 60.62.40

Người hướng dẫn khoa học

: TS. ðỖ THỊ THẢO

HÀ NỘI - 2008


LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan các kết quả nghiên cứu của tôi trong luận văn
này là hoàn toàn trung thực, do tôi thực hiện và chưa sử dụng ñể bảo
vệ một học vị nào.
Các trích dẫn trong luận văn ñược ghi rõ tên tài liệu trích dẫn, tác


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii


MỤC LỤC
Lời cam ñoan...................................................................................................i
Lời cảm ơn .................................................................................................... ii
Mục lục ........................................................................................................ iii
Danh mục các chữ vết tắt................................................................................v
Danh mục các bảng .......................................................................................vi
Danh mục các hình ..................................................................................... vii
Danh mục các sơ ñồ .................................................................................. viii
1. MỞ ðẦU ................................................................................................................... 1
1.1. Tính cấp thiết của ñề tài...........................................................................1
1.2. Mục ñích của ñề tài là..............................................................................3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................................... 4
2.1. Miễn dịch và ñáp ứng miễn dịch..............................................................4
2.2. Hiểu biết về hormon sinh dục- Progesteron ........................................... 28
2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực ñề tài............ 33
3. ðÔI TƯỢNG, NỘi DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................... 36
3.1. ðỐI TƯỢNG......................................................................................... 36
3.2. NỘI DUNG ........................................................................................... 37
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................... 37
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 43
4.1. ðánh giá kết quả gây ñáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA ..... 43
4.2. Lai tạo tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng P3 - Al................... 48
4.3. Tách dòng tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng progesteron ......... 51
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii




DMSO

(Dimethyl Sulphoxide)

EIA

(Enzyme Immuno Assay)

ELISA

(Enzyme Linking Immuno Sorbent)

FBS

(Fetal Bovine Serum)

FSH

(Follicle Stimulating Hormone)

FDA

(Food and Drug Adminitration)

GnRH

(Gonadotropin Releasing Hormone)

HPRT


KN

(Kháng nguyên)

KTðD

(Kháng thể ñơn dòng)

PTL

(Phân tử lượng)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số bảng

Tên bảng

Trang

1. Kết quả ñáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm............................................ 44
2. Sự có mặt của kháng thể kháng ñặc hiệu Progesteron trong các mẫu huyết
thanh thu từ các chuột gây ñáp ứng miễn dịch với P3 – Al (n=5) .................... 47
3. Tỷ lệ giếng có tế bào lai trên tổng số giếng thực hiện dung hợp. ................. 50
4. Tỷ lệ giếng có kháng thể kháng progesteron trên tổng số giếng có tế bào lai
.................................................................................................................................. 53


kháng progesteron trên nền tế bào feeder. (B) Tế bào lai hybridoma giữa
dòng P3X-Ag18 với tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào
feeder; ..................................................................................................... 51
9. (A) Clone tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B
kháng progesteron sau quá trình tách dòng; (B) Clone tế bào lai hybridoma
giữa dòng P3X-Ag18 với tế bào lympho B kháng progesteron sau quá
trình tách dòng......................................................................................... 53
10. Kiểm tra hiệu giá kháng thể ñơn dòng ở các ñộ pha loãng khác nhau; (A)
Dịch nổi; (B) Dịch báng pha loãng 20 lần................................................ 60

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii


DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ
Số sơ ñồ

Tên sơ ñồ

Trang

1. Quy trình sản xuất kháng thể ñơn dòng..................................................... 21
2a. Quá trình hình thành progesteron............................................................ 30
2b. Quá trình thái biến của progesteron ........................................................ 30

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………viii


1. MỞ ðẦU
1.1


lược trong phát triển ngành nông nghiệp nước ta. ðời sống người dân ngày
càng ñược nâng cao, nhu cầu về các sản phẩm thịt, trứng, sữa tăng mạnh, do
ñó công tác phát triển nhanh ñàn gia súc, gia cầm cần ñược quan tâm, chú
trọng. Bên cạnh việc ứng dụng các kích dục tố ñể nâng cao khả năng sinh sản
thì hướng nghiên cứu sử dụng kháng thể ñơn dòng ñể chẩn ñoán sớm có thai,
phát hiện các rối loạn sinh sản ở con cái…có giá trị thực tiễn. Do trong thời
gian ñầu của quá trình mang thai, bào thai còn quá nhỏ, toàn bộ cơ quan sinh
dục còn biến ñổi chưa nhiều nên rất khó chẩn ñoán khi khám bằng phương
pháp quan sát bên ngoài, sờ, nắn, gõ, nghe, khám qua trực tràng, khám qua
âm ñạo…Mặt khác, còn có thể nhầm với triệu chứng một số bệnh ở cơ quan
sinh dục nên càng khó khăn hơn. Ngoài ra, do mối liên quan giữa hệ thống
màng nhung của nhau thai và niêm mạc tử cung chưa chặt chẽ nên dễ gây xảy
thai.
Progesteron là hormon sinh sản ñược tiết ra chủ yếu từ thể vàng buồng
trứng và một phần do nhau thai. Hàm lượng progesteron có liên quan chặt chẽ
ñến ñộng thái của quá trình sinh sản. Progesteron là hormon “chìa khóa" ñể
thiết lập và duy trì một chu kì sinh sản bình thường của con cái.
Các nghiên cứu trong và ngoài nước về ñịnh lượng progesteron trong
huyết thanh, sữa và nước tiểu ñã cho kết quả trong ứng dụng chẩn ñoán có
thai sớm và các bệnh sinh sản liên quan. Tuy nhiên, các phương pháp hóa lí
ñòi hỏi nồng ñộ progesteron phải cao (mg/ml), tách chiết, tinh sạch phức tạp
mới xác ñịnh ñược kết quả. Phương pháp ELISA sử dụng kháng thể ñơn dòng
(monoclonal antibody) cho kết quả nhạy (µg/ml) không ñòi hỏi tách chiết và
tinh sạch, ñộ chính xác cao hơn.
Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài:
"Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng
progesteron".
2



a. ðƯMD tự nhiên tuyệt ñối
ðây là ðƯMD mà trong bất cứ ñiều kiện nào, hoàn cảnh nào cũng không
bị mất ñi, có thể tiêm vào cơ thể ñộng vật một lượng lớn mầm bệnh cũng
không có khả năng gây bệnh, ví dụ: Bất cứ dưới ñiều kiện nào, bò không bao
giờ mắc bệnh tị thư của ngựa, bệnh dịch tả lợn, ngựa không bao giờ mắc bệnh
dịch tả trâu bò…
b. ðƯMD tự nhiên tương ñối
Là tính miễn dịch có thể thay ñổi khi chịu một sự tác ñộng nào ñó trong
một ñiều kiện và thời gian nhất ñịnh như khi chịu tác dụng cao của ñộc lực vi
sinh vật, hoặc thay ñổi nhiệt ñộ hay sức ñề kháng của cơ thể giảm …

4


Ví dụ: bình thường gà không bao giờ mắc bệnh nhiệt thán nhưng khi ngâm
chân gà trong nước lạnh cho thân nhiệt giảm xuống rồi gây nhiễm vi khuẩn
nhiệt thán thì gà bị bệnh.
2.1.2. ðƯMD thu ñược
ðƯMD thu ñược có hai loại: ðƯMD thu ñược chủ ñộng và ðƯMD thu
ñược bị ñộng.
Trong ðƯMD thu ñược chủ ñộng, cơ thể tiếp nhận kháng nguyên và có
thể tự tổng hợp ra kháng thể. Trong ðƯMD thu ñược bị ñộng, cơ thể ñược
tiếp nhận trực tiếp kháng thể (ví dụ: tiêm truyền kháng thể hay kháng huyết
thanh).
a. Miễn dịch thu ñược chủ ñộng tự nhiên
Là tính miễn dịch mà cơ thể có ñược sau khi mắc một số bệnh nhất ñịnh
trong tự nhiên mà qua khỏi. Loại miễn dịch này có thể kéo dài rất lâu có khi
suốt ñời.
Ví dụ: Sau khi mắc bệnh ñậu mùa mà qua khỏi thì không bao giờ mắc lại
nữa; hay nếu bị bệnh sởi mà qua khỏi thì không bao giờ mắc nữa.

nhân tạo ứng dụng trong chữa bệnh. Ví dụ: tiêm giải ñộc tố uốn ván cho
người nhiễm uốn ván, tiêm kháng huyết thanh phòng dại…
2.1.3. Các cơ quan và tế bào tham gia vào ñáp ứng miễn dịch
Thực chất của quá trình ðƯMD là hoạt ñộng của hai loại tế bào
lympho B và lympho T với sự tham gia của ñại thực bào và sự phối hợp ñiều
khiển của các cơ quan dạng lympho.
2.1.3.1. Các cơ quan dạng lympho
Các cơ quan dạng lympho trung tâm là nơi mà quá trình biệt hóa của
lympho bào xảy ra không cần ñến sự kích thích của kháng nguyên, ñó là nơi
biệt hoá của các tế bào nguồn thành các tế bào lympho T chín hoặc lympho B
chín.
Các cơ quan dạng lympho gồm có:

6


*Tủy xương (Bone narrow): là cơ quan tạo máu của cơ thể ñóng vai trò quan
trọng trong việc sản xuất ra các tế bào nguồn của các dòng lympho bào khác
nhau và của ñại thực bào. Các tế bào lympho nguồn (non) sẽ ñi ñến các cơ
quan lympho khác ñể biệt hóa thành tế bào lympho B hoặc lympho T.
*Tuyến ức (Thymus): nằm ngay sát sau xương ức, xuất hiện ở tháng thứ ba
của thời kì bào thai, hoàn thiện và ñạt tối ña về hoạt ñộng ở giai ñoạn trước
tuổi dậy thì. Tuyến ức có các nang làm nhiệm vụ sản xuất các tế bào lympho.
Các tế bào lympho ñược sinh ra từ tuyến ức hay từ tủy xương di tản xuống
ñều ñược tuyến ức huấn luyện, biệt hóa trở thành tế bào lympho phụ thuộc
tuyến ức hay còn gọi là lympho T (Thymus).
*Túi Fabricius (Brusa Fabricius)
Túi này chỉ có ở loài chim, nằm phía trên trực tràng, sát lỗ huyệt. Túi
có cấu tạo gồm rất nhiều nang, các nang này là nơi sản xuất các tế bào
lympho. Các tế bào lympho một phần do túi Fabricius tiết ra, một phần di tản

chặt chẽ với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch.
* Lympho B: Các tế bào lympho nguồn từ tủy xương di tản ñến túi
fabricius (ở chim) hay lách (của thú) ñược huấn luyện, biệt hóa thành tiền
lympho B, sau ñó tiếp tục ñược biệt hóa thành các lympho chưa chín. Ở hệ
máu ngoại vi, các lympho chưa chín ñược biệt hóa thành các lympho B chín,
rồi trở thành tương bào plasma, chính các tương bào này mới là các tế bào
trực tiếp sản xuất ra các kháng thể dịch thể (IgM, IgA, IgG, IgD, IgE)
(Nguyễn Như Thanh, 1997) [16]. Kháng thể này ñi vào máu, tồn tại trong
huyết thanh và dịch của cơ thể. Tương bào (plasma) có vai trò chủ yếu trong
ðƯMD dịch thể, một tỉ lệ nhỏ tế bào lympho B là những tế bào mang “trí nhớ
miễn dịch”. Ở người và ñộng vật không có túi fabricius thì tủy xương và các
cơ quan lympho khác như hạch, lá lách…ñảm nhận chức năng của túi
Fabricius trong quá trình hình thành tế bào lympho B.

8


* Lympho T: các tế bào lympho nguồn từ tủy xương di tản xuống
tuyến ức và ñược tuyến ức huấn luyện, biệt hóa trở thành tiền lympho T,
chúng tiếp tục ñược biệt hóa ở vùng vỏ tuyến ức ñể trở thành lympho T chưa
chín. Các lympho T chưa chín ñược tiếp tục biệt hóa thành lympho T chín ñi
vào hệ máu ngoại vi và ñi ñến các cơ quan, tổ chức khác tại các vùng phụ
thuộc tuyến ức của hạch, lách. Khi ñại thực bào ñưa thông tin kháng nguyên
ñến, các lympho T tiếp nhận rồi biệt hóa trở thành nguyên bào lympho T rồi
tiếp tục trở thành nhóm tế bào mẫn cảm với kháng nguyên có chứa kháng thể
ñặc hiệu trên màng tế bào, gọi ñó là kháng thể tế bào. Quá trình ðƯMD tế
bào do quần thể lympho T phụ trách, thể hiện khả năng tự bảo vệ của cơ thể.
Ví dụ: các bệnh nhiễm trùng gây bởi các vi sinh vật kí sinh trong nội bào (do
virus, vi khuẩn, nấm, ñộng vật ñơn bào), các mầm bệnh này chỉ có thể bị tiêu
diệt hoàn toàn khi có ðƯMD tế bào (Nguyễn Như Thanh, 1997) [16].

kháng thể và sự kết hợp ñặc hiệu với kháng thể do chính kháng nguyên kích
thích sinh ra. Hầu hết các kháng nguyên hoàn toàn có bản chất protein như
các cấu phần của cơ thể ñộng vật, thực vật, vi sinh vật, nọc ñộc ñộng vật…
Kháng nguyên không hoàn toàn (hapten) còn gọi là bán kháng nguyên,
là những chất có trọng lượng phân tử thấp không có tính kích thích sinh miễn
dịch nhưng có tính ñặc hiệu của kháng nguyên là khả năng kết hợp ñặc hiệu
với kháng thể tương ứng (Lê Văn Hùng, 2002) [08]. Hay nói cách khác là tự
bản thân không có khả năng kích thích cơ thể sinh kháng thể. ðể trở thành
kháng nguyên hoàn toàn, kháng nguyên không hoàn toàn phải gắn với một
chất mang (carrier), tạo thành phức hợp hapten- carrier và cơ thể phản ứng
với phức hợp này sinh ra kháng thể.
Carrier là những chất có trọng lượng phân tử lớn như BSA…dùng ñể
kết hợp với hapten tạo ra kháng nguyên hoàn toàn.
* ðiều kiện ñể kháng nguyên có tính miễn dịch:
- Kháng nguyên phải có kích thước phân tử lớn (Ngưỡng tối thiểu của
trọng lượng phân tử là 1000 Da) Tuy nhiên có chất có trọng lượng phân tử
10


nhỏ nhưng chúng tìm cách gắn với protein khác ñể trở thành kháng nguyên
hoàn chỉnh; ngược lại một số chất có trọng lượng phân tử lớn như Dextran tới
200.000 Da nhưng không có tính sinh miễn dịch hoặc có nhưng rất yếu.
- Kháng nguyên phải có ít nhất một epitope khác loài vì hệ thống miễn
dịch không phản ứng với epitope cùng loài.
Khái niệm epitope: là những cấu trúc trên bề mặt tác nhân gây bệnh, có
khả năng tác dụng tương hỗ riêng biệt với những thụ thể ñặc hiệu trên bề mặt
của một số tế bào lympho. Như vậy toàn bộ cấu trúc (tác nhân gây bệnh,
những hạt phân tử) mà trên ñó những epitope hiện diện ñược gọi là kháng
nguyên.
2.1.5. Kháng thể và phản ứng kháng nguyên- kháng thể

hiệu là CL. Các chuỗi nặng chứa 3 hoặc 4 domain hằng ñịnh, tùy theo lớp
kháng thể CH1, CH2, CH3 và CH4.
Các domain hằng ñịnh không có vai trò nhận diện kháng nguyên, chúng
làm nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể. Do ñó,

12


phần "chân" của chữ Y còn ñược gọi là Fc (tức là phần hoạt ñộng sinh học
của kháng thể F: fragment, c: cristallisable)
Các domain biến thiên mỗi immunoglobulin có 4 domain biến thiên (V,
variable) ở ñầu tận hai "cánh tay" của chữ Y. Sự kết hợp giữa 1 domain biến
thiên trên chuỗi nặng (VH) và 1 domain biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên
vị trí nhận diện kháng nguyên (còn gọi là paratope). Như vậy, mỗi
immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên. Hai vị trí này giống nhau
như ñúc, qua ñó một kháng thể có thể gắn ñược với 2 kháng nguyên giống
nhau. Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là phần nhận gắn kháng
nguyên, F: fragment, ab: antigen binding). Domain kháng nguyên nơi gắn vào
kháng thể gọi là epitope.
Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rất nhiều giữa
các kháng thể. Chính sự biến thiên ña dạng này giúp cho hệ thống các kháng
thể nhận biết ñược nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau.
Trong miễn dịch dịch thể, cơ thể sau khi chịu sự kích thích của tác nhân
gây bệnh, các tế bào lympho B ñược biệt hóa sản xuất kháng thể dịch thể ñặc hiệu,
ñây là chất dịch sinh học hòa tan trong huyết thanh và trong dịch của cơ thể.
Kháng thể dịch thể có tính ñặc hiệu với kháng nguyên mức ñộ ñặc hiệu
của kháng nguyên phụ thuộc vào tính riêng biệt của epitope mà nó phân biệt.
Trong huyết thanh có nhiều thành phần, ñó là α, β, γ globulin và albumin,
trong ñó chủ yếu là γ globulin, vì vậy người ta thường gọi kháng thể là globulin
miễn dịch hay imunoglobulin, kí hiệu là Ig. Hiện nay, người ta ñã biết có 5 loại

sẽ tiêu diệt các vi khuẩn xâm hại bằng cách (1) ñục các lỗ thủng trên vi khuẩn,

14


(2) tạo ñiều kiện cho hiện tượng thực bào, (3) thanh lọc các phức hợp miễn
dịch và (4) phóng thích các phân tử hóa hướng ñộng.

Hình 5. Các ñộc tố trên bị trung hoà bởi kháng thể

Hoạt hóa các tế bào miễn dịch
Sau khi gắn vào kháng nguyên ở ñầu biến thiên (Fab), kháng thể có thể
liên kết với các tế bào miễn dịch ở ñầu hằng ñịnh (Fc). Những tương tác này
có tầm quan trọng ñặc biệt trong ñáp ứng miễn dịch. Như vậy, các kháng thể
gắn với một vi khuẩn có thể liên kết với một ñại thực bào và khởi ñộng hiện
tượng thực bào. Các tế bào lympho NK (Natural Killer) có thể thực hiện chức
năng ñộc tế bào và ly giải các vi khuẩn bị opsonine hóa bởi các kháng thể
( [40].
Quy luật hình thành kháng thể ñặc hiệu
Kháng thể không sản sinh ra ngay sau khi kháng nguyên xâm nhập vào
cơ thể mà kháng thể chỉ xuất hiện sau 6 – 7 ngày, rồi sau ñó tăng dần, ñạt mức
ñộ tối ña sau từ 2 ñến 3 tuần, sau ñó từ từ giảm dần và biến mất sau vài tuần,
vài tháng hoặc vài năm.
Sau khi có kháng nguyên kích thích, các tế bào có thẩm quyền miễn
dịch tiếp nhận kháng nguyên và phải mất một thời gian biệt hóa, phân chia

15


thành tế bào sản xuất kháng thể, lúc ñó mới có kháng thể xuất hiện, sớm nhất