ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

MÔNG THỊ HƢƠNG
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN
CỦA DỊCH CHIẾT LÁ TRẦU KHÔNG VÀ DIẾP CÁ

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Khoa

: CNSH-CNTP

Khoá học

: 2011 – 2015

Giảng viên hƣớng dẫn: ThS. Bùi Tuấn Hà

Thái Nguyên, năm 2015


i

chiết Trầu không ............................................................................. 42
Bảng 4.3: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch
chiết Trầu không ............................................................................. 44
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch
chiết Diếp cá.................................................................................... 47
Bảng 4.5: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch
chiết Diếp cá.................................................................................... 48
Bảng 4.6: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn của dịch
chiết Diếp cá.................................................................................... 50


iii

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Cây Trầu không ............................................................................... 13
Hình 2.2: Cây Diếp cá ..................................................................................... 17
Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng
khuẩn của dịch chiết Trầu không .................................................... 42
Hình 4.2: Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian đến khả năng kháng
khuẩn dịch chiết Trầu không .......................................................... 43
Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến khả năng kháng
khuẩn dịch chiết Trầu không .......................................................... 45
Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn của dịch chiết Trầu không đối với các chủng vi
sinh vật thử nghiệm ......................................................................... 46
Hình 4.5: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng
khuẩn của dịch chiết Diếp cá .......................................................... 47
Hình 4.6: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến khả năng khảng khuẩn dịch chiết
Diếp cá ............................................................................................ 49
Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của dung môi đến khả năng kháng
khuẩn của dịch chiết Diếp cá. ......................................................... 51


EIEC

Enteroinvasive E.coli

EPEC

Enteropathogenic E.coli

ETEC

Enterotoxigenic E.coli

I

Intermediate ( trung gian)

MH

Mueller-Hinton

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

MRSA

Methicillin resistance S.aureus

PBS



v

MỤC LỤC
Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1
1.2. Mục đích nghiên cứu .............................................................................. 3
1.3. Yêu cầu ................................................................................................... 3
1.4. Ý nghĩa của đề tài ................................................................................... 4
1.4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................ 4
1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn ...................................................................... 4
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5
2.1. Tổng quan về các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật ....................... 5
2.1.1. Một số chất có hoạt tính tính sinh học từ thực vật .............................. 5
2.1.2. Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật .......................... 5
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết .......................................... 9
2.2. Tổng quan về các phương pháp đánh giá tác động kháng khuẩn ........... 9
2.2.1. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu ................................ 9
2.2.2. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán ............................ 11
2.2.3. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch ........................................ 12
2.3. Cơ sở khoa học ..................................................................................... 13
2.3.1. Tổng quan về Trầu không ................................................................. 13
2.3.2. Tổng quan về các vi sinh vật thử nghiệm ......................................... 20
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .......................................... 32
2.4.1. Trầu không ........................................................................................ 32
2.4.2. Diếp cá .............................................................................................. 33
Phần 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 36
3.1.1. Vật liệu .............................................................................................. 36

4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng kháng khuẩn dịch chiết
Diếp cá đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E. coli, S. aureus, E. ictaruli.. 46


vii

4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của dung môi chiết đến khả năng kháng khuẩn
dịch chiết Diếp cá đối với các chủng vi khuẩn thử nghiệm: E. coli, S.
aureus, E. ictaruli ........................................................................................ 49
PHẦN 5. KẾT LUẬN .................................................................................... 53
5.1. Kết luận ................................................................................................. 53
5.1.1. Dịch chiết Trầu không....................................................................... 53
5.1.2. Dịch chiết Diếp cá ............................................................................. 53
5.2. Kiến nghị............................................................................................... 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO


1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đất nước ta với nguồn tài nguyên dược liệu dồi dào, phong phú là một
thuận lợi trong việc nghiên cứu và điều chế ra những loại thuốc có nguồn gốc
tự nhiên để phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe con người.Với điều kiện
khí hậu nhiệt đới gió mùa, nước ta được xem là mảnh đất màu mỡ cho sự phát
triển của các chủng loại cây cỏ, trong đó có không ít loại cây được dùng làm
thuốc rất hiệu quả. Có những loại thảo mộc hết sức thông dụng trong dân gian
đã được các nhà khoa học chứng minh là có tác dụng trị bệnh không kém so
với các loại thuốc tân dược hiện nay. Điển hình là Trầu không và Diếp cá.

Ưu điểm của việc sử dụng các loại thảo dược này trong điều trị bệnh là
an toàn, không có các dụng phụ, không gây ra nhưng tai biến nguy hiểm chết
người như các loại thuốc kháng sinh thông thường, sử dụng trong điều trị vết
thương làm vết thương mau lành hơn, tuy hiệu quả sử dụng không được cao
nhưng chúng khắc phục được những nhược điểm của kháng sinh thông
thường như tính kháng thuốc, dị ứng với các thành phần phụ, khi điều trị lâu
dài cần phối hợp nhiều loại kháng sinh, ảnh hưởng tới gan, thận và dạ dày. Vì
vậy xu hướng sử dụng các loại thảo dược trong việc điều trị bệnh hiện nay
đang rất được chú trọng và phát triển, (Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thị Tho,
2013) [6].
Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền công nghiệp thì môi trường
xung quanh cũng trở nên ô nhiễm, kéo theo đó là sự gia tăng nhiều hơn số
lượng vi khuẩn có hại gây bệnh nguy hiểm cho con người và động vật như E.
coli- loại vi khuẩn đường ruột, thường gây ra bệnh tiêu chảy, một số chủng
khác có thể gây ra rối loạn máu, suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong;
Staphylococcus aureus- là một loại tụ cầu khuẩn, kí sinh trên da người, gây ra
các bệnh nhiễm trùng ở da và niêm mạc, tiết ra các độc tố gây ngộ độc thực


3

phẩm, (Lê Huy Chính, 2001) [4]; Edwardsiella ictalruli- loại vi khuẩn thường
gây các bệnh nhiễm trùng đường máu ở cá tra, là một trong những nguyên
nhân làm giảm năng suất và chất lượng loại cá xuất khẩu này của Việt Nam,
(Từ Thanh Dung và cs, 2011) [11]. Việc tìm ra các kháng sinh để ngăn chặn
hoặc hạn chế sự gây hại của chúng đã thành công nhưng với việc sử dụng lâu
dài sẽ gây ra tính kháng thuốc ngày càng cao và khó kiểm soát, tiêu biểu như
E. coli kháng Ampicillin lên tới 81,4%, vi khuẩn Staphylococcus aureus
kháng Methicillin và các loại kháng sinh liên quan, (Nguyễn Thanh Hải, Bùi
Thị Tho, 2013) [6].

cao giá trị sử dụng của 2 loại thực vật này.


5

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về các chất có hoạt tính sinh học từ thực vật
2.1.1. Một số chất có hoạt tính tính sinh học từ thực vật: (Đái Duy Ban,
2008) [2]
- Sulfur (tinh dầu từ củ hành- Allium fistuloseum) có chứa các thành
phần là chất kháng sinh allinin, allisufit. Có tác dụng lợi tiểu, lợi tiêu hóa,
chống viêm, chống thối, chống ung thư. Hành thường được dùng chữa cảm
lạnh, đau đầu, ngạt mũi, khó tiêu, các bệnh lên men đường tiêu hóa.
- Hoạt chất odorin trong cây Hẹ có tác dụng kháng sinh chống khuẩn.
Ngoài ra trong lá hẹ có hợp chất sulfur, saponi, chất đắng và vitamin C.
- Các dẫn xuất naptoquinon trong các cây Bóng nước (Impatines
balsamin Linn.), cây Lá móng (Lawascmia inermis Minn.) có tác dụng điều
trị các vết thương và mụn nhọt.
- Các alkaloid có nhân isoquinolein trong các cây Hoằng đằng, Hoàng
bá, Hoàng liên có tác dụng với vi khuẩn hình cầu Gram (+) và Gram (-).
- Các tinh dầu Sả, Quế, Hồi…dùng làm thuốc xông trị cảm cúm và cao
dán mụn nhọt.
- Các anthraglucosid trong các cây Muồng trâu, Đại hoàng, Chút chít, Hà
thủ ô có tác dụng chống nấm gây bệnh hắc lào.
2.1.2. Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật: (Viện Dược
Liệu- Bộ Y Tế) [14]
- Khái niệm: Là quá trình tách và phân ly một hoặc một số chất ra khỏi
nguyên liệu dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng
với một pha lỏng không hòa tan với nó.

+ Hàm lượng tinh dầu còn lại trong nước chưng tương đối lớn.


7

+ Tiêu tốn một lượng nước khá lớn để làm những tụ hỗn hợp hơi.
2.1.2.2 Tách chiết bằng dung môi:
- Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp để
hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành
dạng thích hợp ở nhiệt độ phòng. Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào
của nguyên liệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ
xuất hiện quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong dung môi với bên
ngoài dung môi do chênh lệch nồng độ. Sau khi chiết phải thực hiện quá trình
tách dung môi ở áp suất thấp để thu tinh dầu.
- Yêu cầu của dung môi chiết:
+ Có nhiệt độ sôi thấp, nhưng không quá thấp để hạn chế tổn thất dung
môi và thuận lợi trong việc ngưng tụ hơi dung môi.
+ Không tương tác hóa học với tinh dầu.
+ Có khả năng thu hồi tái sử dụng.
+ Độ nhớt thấp để không làm giảm tốc độ khuếch tán
+ Có khả năng hòa tan tinh dầu lớn, nhưng hòa tan hợp chất không được
hòa tan nước để tránh làm loãng dung môi và hạn chế khả năng hòa tan tinh
dầu của dung môi.
+ Dung môi phải tinh khiết, không được ăn mòn thiết bị, không gây mùi
lạ đối với tinh dầu và ít độc hại với con người.
+ Khi bay hơi dung môi không để lại cặn vì cặn còn lại từ dung môi có
thể ảnh hưởng xấu hoặc phá hủy mùi thơm của tinh dầu.
+ Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm.
2.1.2.3 Tách chiết bằng soxlet:

lỏng ở dạng ion tại nhiệt độ phòng, hệ 2 pha, hệ thống không có dung môi sử
dụng bề mặt bên trong của đất sét, zeolit, silic oxit và nhôm. Sử dụng phương
pháp chiết này cho phép thu được sản phẩm có độ tinh khiết, có màu sắc,


9

hương vị hoàn toàn giống với tự nhiên, không bị biến đổi như trong các
phương pháp chiết khác.
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: (Viện Dược Liệu- Bộ Y
Tế) [14]
- Nguyên liệu.
- Dung môi.
- Kỹ thuật chiết.
- Những yếu tố thuộc về thành phần cấu tạo của dược liệu: màng tế
bào, chất nguyên sinh, một số tạp chất.
- Những yếu tố thuộc về dung môi: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt.
- Những yếu tố thuộc về kỹ thuật: nhiệt độ, thời gian, độ mịn, sự khuấy trộn…
2.2. Tổng quan về các phƣơng pháp đánh giá tác động kháng khuẩn
2.2.1. Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC- Minimum
Inhibitory Concentration) (LakshmiArabewela và cs, 2010) [24], [31]
- Khái niệm: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC là nồng độ thấp nhất của
một chất kháng sinh có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau
khoảng 24h nuôi cấy.
- Các bƣớc tiến hành:
Chuẩn bị các dung dịch kháng sinh:
- Pha dung dịch kháng sinh đậm đặc (dung dịch mẹ)
- Dựa vào hoạt lực của kháng sinh (ghi trên nhãn lọ) để tính nồng độ
dung dịch mẹ cần pha. Khối lượng kháng sinh có hoạt lực a% cần để pha
10ml dung dịch mẹ nồng độ 5120 µg/ml được tính theo công thức: X(g)=


5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19


Dùng bộ cấy phiên bản 32 đầu (mỗi đầu chứa 1 µl) chấm vào giếng, sau
đó đặt nhẹ nhàng (không để chân đinh ấn sâu vào thạch), chính xác (chỉ đặt 1
lần, không di chuyển) lên đĩa thạch MH không có kháng sinh. Tiếp tục chấm và
đặt lên các đĩa thạch đã có sẵn kháng sinh từ nồng độ thấp đến nồng độ cao.


11

Cuối cùng trước khi kết thúc, chấm vào đĩa thạch MH không có kháng sinh một
lần nữa để làm chứng.
- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho khô.
- Lộn ngược các đĩa và ủ ấm ở 370C trong vòng 18-20 giờ.
Đọc kết quả:
- Đọc kết quả, lần lượt đọc từ đĩa thạch có nồng độ kháng sinh thấp nhất.
Nồng độ MIC được xác định ở đĩa môi trường mà ở đó các vi khuẩn bị ức chế
phát triển, nên mật độ vi khuẩn giảm hẳn chỉ còn 1-3 khuẩn lạc.
- Kết quả MIC của các chủng với mỗi kháng sinh được ghi theo bảng
mẫu trên một tờ giấy.
- Ở nồng độ thấp nhất, không có vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận
là nhỏ hơn hoặc bằng nồng độ đó. Trong trường hợp đến nồng độ cao nhất mà
vẫn thấy vi khuẩn mọc thì kết quả được ghi nhận là lớn hơn nồng độ đó.
- Kết quả MIC của các chủng sẽ được so sánh với nồng độ ranh giới
kháng để phân biệt thành 3 mức độ nhạy cảm, kháng hay ở mức độ trung
gian: nhạy cảm (Susceptible - viết tắt S), trung gian (Intermediate - viết tắt I)
hoặc đề kháng (Resistante - viết tắt R).
2.2.2. Phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
- Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoang giấy khuếch tán vào thạch
MH có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi
khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính vòng kháng vô khuẩn

- So sánh kết quả của chủng vi khuẩn với bảng chuẩn và ghi lại kết quả
của từng loại kháng sinh được thử nghiệm như là: nhạy cảm (S), trung bình
(I) và kháng (S).
2.2.3. Phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
-Nguyên lý: Kháng sinh được bơm vào các giếng thạch MH đã được
đục lỗ có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm, mức độ nhạy cảm của vi


13

khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính vòng kháng vô khuẩn
xung quang các giếng thạch có chứa kháng sinh.
- Các bƣớc tiến hành: Tương tự như 2 phương pháp trên, chỉ khác ở
bước đục lỗ trên đĩa thạch như sau: Vi khuẩn sau khi được láng trên bề mặt
thạch, tiến hành đục lỗ trên bề mặt tạo các giếng thạch, các chất kháng sinh sẽ
được bơm vào để thử nghiệm tính nhạy cảm, để yên trong 30 phút, đặt trong
tủ ấm 24 giờ và quan sát vòng vô khuẩn.
2.3. Cơ sở khoa học
2.3.1. Tổng quan về Trầu không
- Vị trí phân loại thực vật, (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3]: Trầu không còn có tên
gọi khác là cây trầu, trầu cay, trầu thược tương, trầu mòlu (Campuchia), hruê ê
ang ( Buôn Mê Thuật).
Giới : Plante
Ngành : Magnoliophyta
Lớp : Magnoliophyta
Bộ : Piperales
Họ : Piperaceae
Giống : Piper
Loài : P. betle.




15

eugenol, eugeny acetat, chavicol và diacetoxylbenzen, các hợp chất này đều là
dẫn xuất của phenol, có nhiệt độ sôi cao, tỷ trọng và chiết suất cao.
Bảng 2.1: Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi
(Võ Văn Chi, 2004) [16]
Hàm lƣợng

Thành phần

Hàm lƣợng

Nước

85-90%

Riboflavin

1,9-30μg/100g

Protein

3-3,5%

Tannin

0,1-1,3%


0,005-0,007%

Tinh dầu

0,08-0,2%

Năng lượng

44kcal/100g

Thành phần

Chất khoáng
Chất xơ
Chlorophyll
Cacbohydrate
Axit nicotinic
Vitamin C
Vitamin A
Thiamine

0,630,89mg/100g Iod
0,005-0,01%
1,99-2,99
mg/100g
10-70μg/100g

- Công dụng: Ngoài công dụng để ăn trầu (lá trầu không, vôi, cau và vỏ
cây), dân gian còn dùng nước lá trầu để sát trùng, chống lở loét, chống viêm
nhiễm…(Đỗ Tất Lợi, 2004) [3]. Các hợp chất polyphenol trong lá trầu có khả

giấp, Ngư tinh thảo. Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb. Saururaceae,
để tôn vinh Marteen Houttuyn là thầy thuốc nhà thực vật học Hà Lan, chuyên
về Rêu và Quyết thực vật, (Đỗ Tất Lợi, 2004) [3].
Hệ thống phân loại, (Võ Văn Chi, 2004) [16]:


17

Giới: Plantae
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Ngọc lan (Magnoliidae)
Bộ: Hồ tiêu (Piperales)
Họ: Lá giấp (Saururaceae)
Chi: Diếp cá (Houttuynia Thunb).

Hình 2.2: Cây Diếp cá
- Mô tả: cây Diếp cá là cây thuộc thân thảo, cao 20-40cm, ưa chỗ ẩm
ướt, có thân màu lục hay tía đỏ. Rễ mọc ngầm dưới đất, rễ nhỏ mọc ở các đốt.
Lá mọc so le, có bẹ; phiến là hình tim, khi vò ra có mùi tanh của cá. Hoa nhỏ,
nở vào tháng 5-8, không có bao hoa, màu vàng nhạt, mọc thành bông. Quả
nang mở ở đỉnh, hạt hình trứng hoặc trái xoan, nhẵn, (Dược Điển Việt Nam,
2002)[1], (Võ Văn Chi, 2004) [16].
- Phân bố và thu hái: Diếp cá có nguồn gốc ở Hymalaya và phân bố cả
ở Trung Quốc, Nhật Bản, Lào, Campuchia và Việt Nam. Ở nước ta, Diếp cá
phổ biến ở trạng thái hoang dại ở những nơi ẩm ướt, trên các bãi hoang, bờ
ruộng…và cũng được trồng lấy lá ăn sống, làm gia vị cùng các loại rau khác,
(Dược Học Cổ Truyền, 2006) [18].