BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ YẾN

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG IN VITRO
TRÊN SỎI TIẾT NIỆU CỦA Ý DĨ
(COIX LACHRYMA-JOBI L., HỌ LÚA POACEAE)

VÀ SƠ BỘ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN
HÓA HỌC CỦA PHÂN ĐOẠN
CÓ TÁC DỤNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2012
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ YẾN


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Quỳnh Chi, TS.
Phạm Thị Thanh Hà, TS. Nguyễn Hoàng Anh và Th.S Nguyễn Thu Hằng, những
thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tận tình trong quá trình em làm khóa luận.

Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên
của bộ môn Dược liệu và bộ môn Dược lực đã giúp đỡ em trong quá trình em làm thực
nghiệm.


2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ......................................................................................... 12
2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................................... 12
2.1.2. Thiết bị ................................................................................................................ 13
2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 14
2.3.1. Đánh giá tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần và các
phân đoạn dịch chiết của thân cây Ý dĩ ........................................................................ 14
2.3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn dịch chiết có tác dụng trên
sỏi tiết niệu in vitro ....................................................................................................... 17
2.3.3. Đánh giá tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của chất phân lập được .................. 17


Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................ 18
3.1. Đánh giá tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần và các
phân đoạn dịch chiết thân cây Ý dĩ ............................................................................... 18
3.1.1. Chuẩn bị dịch chiết ............................................................................................. 18
3.1.2 Đánh giá tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần và các
phân đoạn dịch chiết thân cây Ý dĩ ............................................................................... 20
3.2. Nghiên cứu thành phần hóa học phân đoạn dịch chiết ethyl acetat ....................... 25
3.2.1. Định tính một số nhóm chất trong phân đoạn ethyl acetat bằng các phản ứng
hoa học .......................................................................................................................... 25
3.2.2. Định tính phân đoạn ethyl acetat bằng sắc ký lớp mỏng .................................... 29
3.2.3. Phân lập chất từ phân đoạn ethyl acetat .............................................................. 30
3.2.4. Nhận dạng chất Y01 ............................................................................................ 33
3.3. Đánh giá tác dụng của acid (E)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic trên sỏi tiết
niệu in vitro ................................................................................................................... 33
3.4. Bàn luận ................................................................................................................. 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

4

1.2

Một số nghiên cứu trên thế giới về tác dụng của dược liệu trong

6

điều trị sỏi tiết niệu.
1.3

Một số bài thuốc / dược liệu trong nước đã được nghiên cứu tác

7

dụng trên sỏi tiế niệu.
2.1

Thành phần nước tiểu nhân tạo theo Kavanagh và cộng sự.

15

3.1

Tác dụng ức chế hình thành sỏi calci oxalat của natri citrat, dịch

21

chiết toàn phần và các phân đoạn dịch chiết của thân Ý dĩ.
3.2

Tên hình

Trang

1.1

Công thức các chất phân lập được từ thân cây Ý dĩ.

10

2.1

Cây Ý dĩ ( Coix lachryma-jobi L.).

12

2.2

Hình ảnh tinh thể dạng COM (a, b) và COD (c)dưới kính hiển vi

17

điện tử quét
3.1

Sơ đồ quy trình chiết xuất phân đoạn từ dịch chiết nước thân

19

cây Ý dĩ.

λ= 254 nm (a) và sau khi hiện màu bằng thuốc thử
vanilin/H2SO4 (b).
3.6

Tinh thể Y01 dưới kính hiển vi ở vật kính 10x.

32

3.7

Công thức acid (E)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-propenoic.

33

3.8

Tác dụng ức chế hình thành sỏi calci oxalat của acid (E)-3-(4-

36

hydroxyphenyl)-2-propenoic ở các nồng độ khác nhau.
3.9

Hình ảnh ở vật kính 40x của tinh thể calci oxalat tạo thành
trong điều kiện không có mặt của của chất thử (a), có mặt natri
citrat (b) và dung dịch acid p-coumaric ở nồng độ 1mg/ml (c);
0,1mg/ml (d); 0,01mg/ml (e), 0,001mg/ml (f).

36



2

lachryma-jobi L., họ Lúa Poaceae) và sơ bộ nghiên cứu thành phần hóa học của
phân đoạn có tác dụng” với các mục tiêu sau:
1. Đánh giá tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của dịch chiết nước toàn phần và các phân
đoạn dịch chiết của thân cây Ý dĩ.
2. Nghiên cứu thành phần hóa học của phân đoạn dịch chiết có tác dụng.


3

Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 Bệnh lý sỏi tiết niệu.
1.1.1. Định nghĩa và phân loại sỏi tiết niệu.
Sỏi tiết niệu là sự hình thành và hiện diện sỏi trong đường tiết niệu. Khi sỏi ở vị trí
nào thì có tên gọi theo vị trí giải phẫu đó: sỏi thận, sỏi niệu quản, sỏi bàng quang [1].
Dựa vào thành phần hóa học của sỏi người ta chia sỏi tiết niệu ra làm 5 loại sỏi :
sỏi calci oxalat, sỏi calci phosphat, sỏi urat, sỏi cystin và sỏi struvit. Ở Việt Nam, tất cả
các mẫu sỏi được phân tích đều có từ 2 thành phần trở lên, trong đó thành phần hay gặp
nhất là calci oxalat (tỷ lệ gặp 90,7%). Sau đó mới đến sỏi calci phosphat, sỏi struvit, sỏi
uric và sỏi cystin [9].
1.1.2. Đặc điểm dịch tễ.
Sỏi tiết niệu là bệnh lý hay gặp và hay tái phát, trên thế giới có những vùng có tỷ
lệ sỏi tiết niệu cao gọi là vành đai sỏi. Việt Nam nằm trong vùng vành đai sỏi của thế
giới. Tỷ lệ sỏi tiết niệu chiếm tỷ lệ khoảng 2% - 12% trong cộng đồng dân cư [9].
Ở Việt Nam sỏi thận chiếm 40%; sỏi niệu quản chiếm 28,27%; sỏi bàng quang
28,3%; sỏi niệu đạo 5,4% trong tổng số bệnh nhân bị sỏi tiết niệu nói chung. Sỏi tiết niệu
ở nam nhiều gấp 2 lần ở nữ, gặp nhiều ở tuổi trên 30 [3].
1.1.3. Nguyên nhân và cơ chế hình thành sỏi tiết niệu.


Tăng cystin niệu.

Struvit

Nhiễm khuẩn tiết niệu mạn tính và tái phát.

b. Theo y học cổ truyền.
Theo y học cổ truyền sỏi tiết niệu có nguyên nhân chính do thấp nhiệt hạ tiêu, thấp
tà, nhiệt tà xâm phạm hại tiêu (viêm đường tiết niệu), nhiệt kết bàng quang làm hư hao
thủy dịch, cặn lắng kết lại sinh sỏi. Tuệ Tĩnh giải thích: sỏi niệu do thận khí hư làm thủy
hỏa mất điều hòa, hỏa của tâm đi xuống hạ tiêu chưng khô nước tiểu mà thành thạch.
Thận âm hư sinh nội nhiệt, nội nhiệt làm hư hao tân dịch cho nên đi tiểu ít.
Sỏi tiết niệu còn do bệnh tật nằm lâu ngày bất động, khí huyết ứ trệ, thủy dịch kém
được lưu thông, cặn có điều kiện kết lắng mà hình thành sỏi [3].
1.1.3.2. Cơ chế hình thành sỏi.
Quá trình hình thành sỏi là một quá trình phức tạp, là kết quả của một loạt các quá
trình hóa lý bao gồm: sự quá bão hòa của các chất hòa tan trong nước tiểu, tạo mầm, tăng
trưởng mầm, kết tụ và lưu lại tại thận [27].


5

1.1.4. Điều trị sỏi tiết niệu
Việc lựa chọn phương pháp điều trị phụ thuộc vào các yếu tố như kích thước của
sỏi, mức độ nghiêm trọng của triệu chứng, mức độ tắc nghẽn, chức năng thận, vị trí của
sỏi và có kèm theo nhiễm trùng hay không nhiễm trùng [27].
1.1.4.1. Điều trị ngoại khoa.
Điều trị ngoại khoa thường áp dụng với những sỏi có đường kính từ 5mm trở lên,
khó có thể lọt qua được đường tiết niệu để đào thải ra ngoài. Các phương pháp điều trị


Tên

Herniaria

Bộ phận

Thử

dùng

nghiệm

Toàn cây

In vitro

hirsute L.

Kết quả nghiên cứu

Tài
liệu

Tăng số lượng nhưng giảm
kích thước của các tinh thể

In vivo

calci oxalat


In vitro

biflorus Linn.
4

Bergenia

ức chế sự kết tủa của calci

[31]

phosphat
Thân rễ

In vitro

ligulata Wall.

ức chế sự hình thành tinh thể
calci oxalat và sự kết tủa calci

In vivo

phosphat

[26],

Tăng thể tích nước tiểu, ngăn



7

6

Alisma

Thân rễ

In vitro

orientalis

ức chế sự chuyển calci
phosphat thành hydroxyapatit

(Sam.) Juzep.

In vivo

Làm giảm nồng độ của calci
oxalat trong thận, làm giảm sự

[45]

lắng đọng calci oxalat ở trên
mô và trong lòng ống thận
7

Ammi visnaga

Bảng 1.3: Một số bài thuốc / dược liệu trong nước đã được nghiên cứu
tác dụng trên sỏi tiết niệu.
STT

Bài thuốc / dược liệu

Thử nghiệm

Kết quả nghiên cứu

1

Ngũ linh tán (Kim tiền thảo,cối

In vivo, lâm

Bào mòn sỏi và

xay, bạch linh, trạch tả, bạch

sàng

tống sỏi kích thước

truật, trư linh, kê nội kim, quế)
2

Bài thuốc “bài sỏi” (Kim tiền

Tài liệu


tác dụng giảm đau

vương bất lưu hành, phục linh,

và giảm viêm

[17]

tang bạch bì, đan sâm, mộc
thông)
4

Chuối hột (Musa balbisiana

In vitro

Làm mòn sỏi và

Colla.)

In vivo

làm giãn cơ giúp

[13],[14]

giảm đau
5


Lâm sàng

Làm giãn cơ trơn
giúp giảm đau và

[10]

bài xuất sỏi

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu về cơ chế tác
dụng của dược liệu trên sỏi tiết niệu:
Một số dược liệu có tác dụng điều trị bệnh lý sỏi tiết niệu là do có vai trò “hòa tan”
(bào mòn) sỏi như Bergenia ciliate (Haw.) Sternb [28], bài thuốc Ngũ linh tán [20] hoặc
tác dụng hỗ trợ lợi tiểu, làm tăng lượng chất lỏng qua thận, từ đó tăng đào thải các chất
lắng cặn như Bergenia ligulata Wall. [26], Herniaria hirsute L. [24], Kim tiền thảo,
Chuối hột [14]…
Một số dược liệu có tác dụng ngăn cản sự kết tụ của tinh thể calci oxalat, ngăn cản
sự tạo mầm calci oxalat, ngăn cản sự lớn lên của tinh thể calci oxalat như Phyllanthus
niruri Linn. [25], Bergenia ligulata Wall. [31]…; Làm giảm sự lắng đọng các tinh thể ở
trên mô và trong lòng ống thận như Herniaria hirsute L. [24], Bergenia ligulata Wall.
[31], Ammi visnaga L. [53], Alisma orientalis (Sam.) Juzep. [45], Aerva lanata Linn.


9

[48]...; Làm tăng nồng độ của các chất ức chế sự hình thành sỏi trong thận như Aerva
lanata Linn. [48], Ammi visnaga L. [53]…; làm giảm nồng độ calci trong mô ở thận, cải
thiện tình trạng quá bão hòa calci oxalat như Alisma orientalis (Sam.) Juzep. [45].
Một số dược liệu chứa saponin có tác dụng phân rã hệ thống treo mucoprotein-là
tác nhân thúc đẩy sự kết tinh. Một số dược liệu có đặc tính kháng khuẩn, bảo vệ lớp chất

cắt cả cây đem về đập lấy quả, lấy nhân hạt phơi hoặc sấy khô để dùng làm thực phẩm
hoặc dùng làm thuốc.
 Rễ, thân, lá: ít được sử dụng làm thuốc.
1.2.3.Thành phần hóa học.
 Hạt Ý dĩ: Bên cạnh tinh bột, protein, các acid amin, các nhóm chất chính đã được
phân lập từ hạt Ý dĩ bao gồm : coixenolid, α-monolinolein, các policosanol, các
phytosterol, các amid, các hợp chất lactam, các hợp chất phenol, các polysaccharid
coixan A, B, C và một số acid béo. Cấu trúc các chất này được trình bày cụ thể trong
Khóa luận tốt nghiệp dược sỹ Đại học của Đỗ Văn Khái [11].
 Rễ: chứa tịnh bột, protein, chất béo, benzoxazolon, một số dẫn chất lignan và syringyl
glycerol [15],[21].
 Lá: chứa benzoxazolon [21].
 Thân: từ phân đoạn dịch chiết chloroform thân cây Ý dĩ, một số hợp chất đã được
phân lập theo định hướng tác dụng hạ đường huyết: stigmast-4-en-3-one, β-sitosterol và
stigmasterol, (E)-ethyl-3-(4-hydroxyphenyl) acrylate, 4-hydroxy benzaldehyd, acid
isovanillic [8],[11]. (Hình 1.1)

Hình 1.1: Công thức các chất phân lập được từ thân cây Ý dĩ.


11

1.2.4. Tác dụng dược lý và công dụng.
1.2.4.1. Tác dụng và công dụng của Ý dĩ theo y học cổ truyền.
Ý dĩ nhân có vị ngọt, tính bình hoặc hơi hàn, quy kinh tỳ, vị, phế, can, đại tràng.
Có tác dụng ích khí, kiện tỳ hóa thấp, lợi trường vị, thư cân giải kinh, tiêu viêm. Được
dùng làm thuốc giúp tiêu hóa, chữa tiêu chảy, viêm ruột, mụn nhọt, theo dân gian Ý dĩ
được dùng làm thuốc lợi sữa, thuốc bồi dưỡng cơ thể [6],[21].
Rễ dùng chữa viêm nhiễm đường niệu, sỏi thận, thủy thũng, phong thấp, đau
xương, trẻ em ỉa chảy, bạch đới, rối loạn kinh nguyệt, kinh bế [6],[21].

liệu được Bùi Hồng Quang – Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật định tên khoa học là
Coix lachryma – jobi L., họ Lúa (Poaceae). Tiêu bản được lưu trữ tại Phòng thực vật
Viện sinh thái tài nguyên sinh vật và Bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội.

Hình 2.1: Cây Ý dĩ (Coix lachryma-jobi L.)
 Dung môi: ethanol, chloroform, ethylacetat, n-hexan, methanol, toluen, acid formic,
aceton.
 Các thuốc thử định tính thường dùng.
 Hóa chất : natri clorid, kali clorid, dinatri hydrophosphat, amoni sulfat, amoni clorid,
magie clorid, kali citrat, calci clorid, acid oxalic dihydrat, natri citrat dihydrat.
 Bản mỏng : Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 của hãng Merck.
 Silicagel : Silicagel dùng cho sắc ký cột có kích thước 43 – 60 μm của hãng Merck.


13

2.1.2. Thiết bị
2.1.2.1. Một số thiết bị tại Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Dược lực - trường Đại học
Dược Hà Nội.
Thiết bị dùng cho thử tác dụng dược lý: Máy cất nước 2 lần Hamillton, Hoa Kỳ;
máy lọc nước RO Arium 611 Sartorius, Đức; thiết bị khuấy từ Heidolph, Đức; máy điều
chỉnh pH Euteck instruments pH 510, Singapore; bản nhọn 96 giếng, máy lắc Vortex
Genius 3 IKA, Đức; máy đọc khay vi thể Biotek, Mỹ; máy ủ lắc Star Fax–2200
Awareness Technology, Mỹ kết nối máy tính Sunpac của Phúc Anh, Việt Nam; tủ ủ ấm
Memmert, Đức; kính hiển vi Olympus CKX41 kết nối máy ảnh Canon, Nhật; pipet 1 đầu
côn loại 10-100 µl và loại 100-1000 µl; pipet 8 đầu côn loại 10-100 µl và loại 100-1000
µl.
Thiết bị dùng cho nghiên cứu phần hóa học: Đèn tử ngoại Vilbez Lourmat (Hai
bước sóng λ = 254nm và λ= 366nm), máy cất quay Buchi Rotavapor R-200, máy ly tâm
Harmonic Series, máy đo độ ẩm Sartorius, pipet vạch, pipet pasteur, pipet chính xác, cột

Chiết xuất phân đoạn từ dịch chiết nước toàn phần bằng phương pháp chiết lỏnglỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform, ethyl acetat.
2.3.1.2. Chuẩn bị nước tiểu nhân tạo, dung dịch acid oxalic và dung dịch chứng
dương natri citrat.
Chuẩn bị dung dịch nước tiểu nhân tạo: Dung dịch nước tiểu nhân tạo được pha
theo công thức trong bảng 2.1.
Dung môi sử dụng để pha nước tiểu nhân tạo là nước cất 2 lần được lọc qua máy
lọc RO, làm ấm đến 37oC, hòa tan lần lượt các thành phần và được điều chỉnh pH bằng
dung dịch HCl 1N đến pH = 6, ủ ở 37oC.


15

Bảng 2.1: Thành phần nước tiểu nhân tạo theo Kavanagh và cộng sự [39]
Thành phần

Đơn vị (mmol/l)

NaCl

368,0

KCl

188,825

Na2HPO4

57,5

(NH4)2SO4

2.3.1.4. Bố trí thí nghiệm và đánh giá kết quả.
Để đánh giá tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần thân Ý dĩ,
thí nghiệm được tiến hành trên 5 cột, mỗi cột 8 giếng của bản nhọn 96 giếng. Thành phần
cho vào mỗi giếng của từng cột:
+ Cột 1: 160 μl nước tiểu nhân tạo + 20 μl nước + 20 μl dung dịch acid oxalic.
+ Cột 2: 160 μl nước tiểu nhân tạo + 20 μl nước + 20 μl dung dịch natri citrat.


16

+ Cột 3: 160 μl nước tiểu nhân tạo + 20 μl dung dịch natri citrat + 20 μl dung dịch acid
oxalic.
+ Cột 4: 160 μl nước tiểu nhân tạo + 20 μl nước + 20 μl dung dịch Xo.
+ Cột 5: 160 μl nước tiểu nhân tạo + 20 μl dung dịch Xo + 20 μl dung dịch acid oxalic.
Trong đó: cột 1 gọi là mẫu trắng sỏi; cột 2,4 gọi là mẫu trắng dung dịch cần thử;
cột 3,5 gọi là mẫu thử (tạo sỏi trong sự có mặt của chất thử).
Để đánh giá tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của các phân đoạn dịch chiết, thí
nghiệm được bố trí tương tự như trên, trong đó 20 μl nước được thay thế bằng 20 μl cồn
tuyệt đối, dung dịch Xo lần lượt được thay bằng các dung dịch X1, X2 và X3, còn X4
làm tương tự.
Xác định mật độ quang OD620nm tại các thời điểm 5 phút khi tác dụng của chất thử
bắt đầu thể hiện rõ và tại thời điểm 30 phút khi tác dụng đã tương đối ổn định. Giá trị
trung bình OD620nm (ODTB) của mỗi nhóm là trung bình cộng giá trị OD620nm của 8 giếng
trong mỗi cột. Phần trăm ức chế (%UC) hình thành sỏi tiết niệu của chất thử được tính
theo công thức:

a: ODTB mẫu trắng sỏi.
b: ODTB mẫu trắng dung dịch thử.
c: ODTB mẫu tạo sỏi khi có mặt dung dịch thử.
+ Nếu %UC > 0: dịch thử có tác dụng ức chế quá trình hình thành sỏi do làm giảm số

Định tính sự có mặt của các chất trong phân đoạn bằng phương pháp sắc ký lớp
mỏng.
Phân lập thành phần chính trong phân đoạn bằng phương pháp sắc ký cột và
phương pháp kết tinh.
Nhận dạng chất phân lập được bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ
khối (MS).
2.3.3. Đánh giá tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của chất phân lập được: tiến hành
tương tự mục 2.3.1


18

Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Đánh giá tác dụng in vitro trên sỏi tiết niệu của dịch chiết toàn phần và các phân
đoạn dịch chiết thân cây Ý dĩ.
3.1.1. Chuẩn bị dịch chiết.
3.1.1.1. Chiết xuất dịch chiết toàn phần.
Cân 1kg dược liệu khô đã được tán nhỏ cho vào dụng cụ sắc, đổ nước ngập dược
liệu, sắc 3 lần, mỗi lần 60 phút. Lọc, gộp dịch chiết, cô đặc dịch chiết đến dạng cao lỏng
1:1 (1ml tương ứng với 1g dược liệu khô ban đầu).
3.1.1.2. Chiết xuất các phân đoạn.
Cao lỏng 1:1 được chiết phân bố lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân
cực tăng dần: n- hexan, chloroform, ethyl acetat. Cất thu hồi dung môi dưới áp lực giảm
đến cắn, thu được lần lượt các cắn tương ứng: cắn n-hexan (0,025%), cắn chloroform
(0,114%) và cắn ethyl acetat (0,254%). Phần nước còn lại sau khi lắc với dung môi hữu
cơ được cô đặc đến dạng cao lỏng 1:1 (1ml tương ứng với 1g dược liệu khô ban đầu).
Quy trình chiết xuất phân đoạn được tóm tắt theo sơ đồ hình 3.1.