I H C QU C GIA HÀ N I
TR

NG

I H C KHOA H C T

NHIÊN

-----------------------

Nguy n Ng c H ng

XÁC

NH M T S

AXÍT BÉO TRONG D U G C

B NG K THU T S C KÝ KHÍ

LU N V N TH C S KHOA H C

Hà N i – 2010


I H C QU C GIA HÀ N I
TR

NG




M CL C
Trang
M
U .......................................................................................................................... 1 
CH
NG 1: T NG QUAN ............................................................................................. 2 
1.1. Cây G c và d u G c ............................................................................................... 2 
1.1.1. Cây G c............................................................................................................... 2 
1.1.2.  D u G c .............................................................................................................. 3 
1.2. T ng quan v axít béo không no ............................................................................. 5 
1.2.1. Axít linoleic ........................................................................................................ 5 
1.2.2. Axít oleic ............................................................................................................ 7 
1.3. Các ph ng pháp phân tích axít béo....................................................................... 8 
1.3.1. Các ph ng pháp chung ..................................................................................... 8 
1.3.2. Các ph ng pháp s c ký ................................................................................... 12 
CH
NG 2:
I T NG - PH
NG PHÁP NGHIÊN C U ..................................... 24 
2.1.
i t ng, m c tiêu và nhi m v nghiên c u ...................................................... 24 
2.1.1.
i t ng và m c tiêu nghiên c u................................................................... 24 
2.1.2. Nhi m v nghiên c u ........................................................................................ 25 
2.2. Ph ng pháp nghiên c u ..................................................................................... 26 
2.2.1. Ph ng pháp s c ký khí ..................................................................................... 26 
2.2.2. nh l ng các axit béo b ng GC – FID ........................................................... 32 
2.2.3. Ph ng pháp x lý và đánh giá k t qu ............................................................. 33 


T xa x a, ông cha ta đã bi t s d ng các cây c trong thiên nhiên đ
làm thu c c ng nh các ch ph m sinh h c nh m t ng c
kh e c a mình. N

ng và b o v s c

c Vi t Nam n m trong khu v c nhi t đ i, gió mùa, thu n
c phát tri n, trong đó có cây G c. Các b ph n

ti n cho nhi u lo i th o d

c a G c có nhi u công n ng khác nhau, trong đó d u G c đã đ
đ dùng nh m t lo i th c ph m ch c n ng nh m t ng c

c chi t xu t

ng s c đ kháng,

ch ng lão hóa t bào, cung c p vitamin, … cho c th .
D u G c có ch a nhi u nhi u ch t b d

ng, trong đó có các axít béo

no và không no mà vai trò c a các axít béo không no là quan tr ng h n c .
Hi n nay đã có nhi u ph

ng pháp phân tích các axít béo không no v i nhi u

k thu t khác nhau, tuy nhiên khi áp d ng trong d u G c thì có r t ít công

Roxburgh.
m ts n

c, G c đ

c g i là: M c Mi t (Trung Qu c), Spiny bitter-

cucumber, Chinese bitter-cucumber, Chinese cucumber (Anh), Margones à
piquants (Pháp), Makkao (Kh me) [1,5].
1.1.1.1.

c đi m th c v t

G c là loài cây thân th o dây leo thu c chi M

p đ ng. Cây g c leo

kh e, chi u dài có th đ n 15m. Thân dây có ti t di n góc. Lá g c nh n, thùy
hình chân v t phân ra t 3 đ n 5 d , dài 8-18 cm. G c là loài đ n tính khác
g c (dioecious). Hoa s c vàng. Qu hình tròn, s c xanh, khi chín chuy n sang
màu đ cam, đ

ng kính 15-20 cm. V g c có gai r m. B ra m i qu th

ng

có sáu múi. Th t g c màu đ cam. H t g c màu nâu th m, hình d p, có khía.
G c tr hoa mùa hè sang mùa thu, đ n mùa đông m i chín. M i n m g c ch
thu ho ch đ


đi n Vi t Nam (1983) và D

c ghi vào D

c

c đi n Trung Qu c (1963, 2000).

D u G c (Oleum Momordicae) ép t màng đ bao xung quanh h t đã
ph i hay s y khô và đã đ

c ghi vào D

c đi n Vi t Nam I (1971).

R G c (Radix Momordicae) còn g i là Phòng k nam là r cây G c thu hái
vào mùa đông đã ph i khô.
1.1.2. D u G c
1.1.2.1. Các ph

ng pháp s n xu t

Mu n ch d u G c, tr
áp d ng m t trong các ph

c h t s y khô màng h t G c, sau đó tán nh r i

ng pháp sau [3]:

- Chi t b ng dung môi ete d u h a: L y ki t b ng dung môi ete d u

- T tr ng: D = 0,9151 – 0,9156 g/cm3

3

150C.


- Ch s khúc x : 1,4681 – 1,4685 [2].
- Thành ph n hóa h c: 100g d u này có 150 - 175mg

- caroten, kho ng

4g lycopen và 12mg alpha tocopherol (vitamin E thiên nhiên). Axít
panmitic (33,4%), axít stearic (7,9%), đ c bi t là các axít không no nh
axít oleic (44%) và axít linoleic (14,7%) là hai axít béo r t c n thi t cho
c th . D u G c c ng còn ch a các vi l

ng c n thi t nh : s t, đ ng,

coban, kali và k m ...[1,5].
1.1.2.3. Tác d ng sinh h c và công d ng
Khi vào c th ,

- caroten (ch t ti n vitamin A) s đ

c chuy n hoá

thành vitamin A tu theo nhu c u, vì v y khi dùng d u g c, không có hi n
t


th an toàn và không đ c h i cho gan.
D u g c còn có hàm l

ng lycopen r t cao nên có tác d ng làm gi m

nguy c ung th (nh t là ung th tuy n ti n li t và ung th d dày).

-

caroten và lycopen là các ch t carotenoid, lo i ch t ch ng oxy hoá c a th c
v t có tác d ng d n s ch các g c t do (các nguyên t và phân t

tr ng thái

không n đ nh, có ho t tính hoá h c r t cao) và các s n ph m oxy hoá đ c h i
do các g c t do sinh ra, giúp c th kho m nh và kéo dài tu i thanh xuân.
Có th ví ch t carotenoid nh cái ch i quét rác trong c th có nhi m v "quét
4


d n" th

ng xuyên các s n ph m oxy hoá không nh ng làm cho c th b già

nhanh, mà nó còn tham gia gây nhi u b nh hi m nghèo nh s v a đ ng
m ch, thoái hoá th n kinh, đ c thu tinh th m t, b nh Alzheimer, viêm
nhi m, ung th ...
D u g c còn có tác d ng phòng ng a và đi u tr b nh viêm gan, x gan
ho c nguy c phát tri n ung th gan, lo i tr đ c h i cho ng



ây là các axít quan

tr ng nh t vì nó c n thi t cho s phát tri n c a c th con ng
c ng đ

c g i là các vitamin F [7],[12],[30].

1.2.1. Axít linoleic
- Công th c c u t o

5

i. Các axít này


- Tên IUPAC: axít (9Z, 12Z) – octadeca – 9,12 – dienoic.
- Công th c phân t : C18H32O2.
- Kh i l

ng phân t : 280,45 g.mol-1.

- T kh i: 0,9 g.cm-3.
-

i m nóng ch y: - 5 0C.

-

i m sôi: 229 0C.

ng d

ng kém [27].

6

ng khô và r ng tóc [14] kh


1.2.2. Axít oleic
- Công th c c u t o

- Tên IUPAC: axít (9Z) – octadec – 9 – enoic.
- Công th c phân t : C18H34O2.
- Kh i l

ng phân t : 282,4614 g.mol-1.

- T kh i: 0,895 g.cm-3.
-

i m nóng ch y: 14 0C.

-

i m sôi: 360 0C.

- Tên khác: Omega 9.
- Tác d ng:
Axít béo c n cho s phát tri n bình th

ng pháp chung thông th

béo ch không th xác đ nh đ

ng dùng đ xác đ nh t ng các axít

c các axít riêng r . Có th chia chúng thành

ng pháp sau đây:

các ph

1.3.1.1. Ph
Ph

ng pháp chu n đ hóa h c
ng pháp chu n đ hóa h c dùng đ xác đ nh các axít béo v i n ng

đ b ng ho c l n h n 1mM. Ph

ng pháp này th

ng dùng đ xác đ nh ch

s axít trong d u th c v t và ch t béo.
Ph

ng pháp chu n đ hóa h c đ

c th c hi n theo qui trình sau:

ng là 35 – 74 và 21 –

46 m u / gi đ i v i h th ng 1 và 2 kênh. 50 m u d u c đã đ
c so sánh v i ph

c kh o sát

t là phenolphtalein và bromthymol xanh. Ph

pháp trên cho th i gian phân tích khá nhanh v i s l
đ

ng

c kh o sát và
ng pháp có

ng pháp trên không b

nh


h

ng c a màu n n c a m u khi ph h p th UV-VIS ch ra r ng đ h p th

c a m u là c c ti u t i b

c sóng phát hi n c a phenolphthalein (562 nm) và



phân tích nhanh khi đ

c t đ ng hóa. Th i gian phân tích th

ng ch m t t

1 – 3 phút v i đ chính xác cao. Ngoài ra đ u dò nhi t không c n ph i chu n
hóa tr

c khi đo, thí nghi m ti n hành

l i c a ph

đi u ki n th

ng c ng là m t thu n

ng pháp.

1.3.1.3. Ph

ng pháp đo d a vào s t o ph c c a axít béo và kim lo i

D a vào s t o ph c c a các axít béo và m t s ion kim lo i (Cu2+,
Co2+) ng

i ta đã phát tri n ph

nhiên, các ph

c so

sánh v i dung d ch chu n g c c a các axít béo.
Vào n m 2005, Marta Bernárdez [26] và các c ng s đã bi n đi u
ng pháp Lowry khi phân tích các axít béo t do trong th t cá. Ông đã

ph

thay th dung môi benzen b ng dung môi ít đ c h n là xiclohexan. M u ch t
béo làm khô đ

c hòa tan trong 3 ml xiclohenxan và tr n l n v i 1 ml thu c

th đ ng axetat – pyridin. Sau khi l c đ u và li tâm, l p trên c a h n h p
đ

c chi t ra và đem đo quang

quan cao khi so sánh v i ph
1.3.1.4. Ph
Ph

b

c sóng 715 nm. K t qu cho s t

ng

ng pháp chu n đ truy n th ng.


b ng ph

c xác đ nh

ng pháp hu nh quang.

Vào n m 1992, Jebens E. [23] và các c ng s đã dùng ph
trên đ xác đ nh m t l

ng nh các axít béo b ng cách chi t chúng v i thu c

th Triton X-100. Các phép đo đ
huy t thanh và huy t t
thu đ

ng pháp

c ti n hành l p l i trong 5 m u c a m u

ng v i kho ng n ng đ t 0 đ n 2 mmol.l-1. K t qu

c khá t t v i h s bi n thiên gi a các m u và trong m i m u l n l

là 1,7 và 4%.

10

t



nh t t c các thành ph n axít béo có trong niêm m c mi ng khá g n nhau khi
ng pháp GC-MS) và giá tr tiên đoán

so sánh gi a giá tr chu n (đo b ng ph
d a trên ph

ng trình h i qui. Ph

ng pháp này c ng có th áp d ng phân

tích axít béo trong các l nh v c nh th c ph m, y t d phòng hay d ch t h c.
Vào n m 2008, Di Wu [15] và các c ng s đã s d ng ph

ng pháp

quang ph c n h ng ngo i đ xác đ nh axít -linolenic và axít linolenic trong
8 lo i d u n và h n h p c a chúng. Các tác gi đã s d ng phép bi n đ i
wavelet đ gi m kích th
qui bình ph
ph

ng t i thi u riêng ph n. Ph

ng pháp bình ph

K t qu thu đ
khác nh .

c t p s li u đ u vào tr



T khi ra đ i đ n nay, s c ký v n luôn là ph

ng pháp h u hi u nh t

khi c n xác đ nh riêng r các ch t trong cùng m t h n h p. Trong khi đó các
axít béo hay đi cùng v i nhau và vi c xác đ nh riêng bi t chúng là m t vi c
làm c n thi t. Vi c áp d ng các ph
hi n nay là ph

ng pháp s c ký xác đ nh các axít béo

ng pháp ph bi n và có r t nhi u công trình nghiên c u v

v n đ nay. Trong khuôn kh c a lu n v n ch đ c p đ n các qui trình nghiên
c u chính khi s d ng ph
1.3.2.1

Ph

ng pháp s c ký trong phân tích axít béo.

ng pháp s c ký khí (GC)

S c ký khí đ

c xem là ph

ng pháp h u hi u nh t hi n nay dùng đ


Quá trình metyl este hóa không nh ng có th th c hi n trong môi
tr

ng axít, môi tr

ng ki m đ i v i các axít béo t do, hay lipid đã đ

c

tách ra kh i n n m u mà nó còn có th th c hi n tr c ti p trong qui trình m t

12


b

c b ng cách k t h p vi c chi t và chéo hóa este trong m t l

ng nh m u

khô.
qui mô l n, các metyl este c a axít béo (FAMEs), đ
là nhiên li u diesel sinh h c, đ

c s d ng nh

c đi u ch b ng ph n ng chéo hóa este c a

d u th c v t v i natri metylat, NaOH hay KOH trong môi tr



hòa tan trong 0,75 ml chloroform/metanol (1/1,v/v) và 0,25 ml BF3/metanol
đ

c cho vào. Sau đó, đóng ch t nút xo n, đun nóng trong n

cách cát

c sôi (ho c b p

1000C). Th i gian đun tùy thu c d ng m u, thông th

phút.

13

ng t 5 – 45


ng nghi m sau đó đ

c làm l nh, thêm vào đó 1 ml n

c và 2 ml

pentan. L c ng nghi m trong vòng 1 phút, ly tâm t i t c đ th p và chi t l y
trên. Pentan đ

pha h u c


ng pháp s d ng h n h p axít sulfuric

– metanol cho k t qu t t nh t.
* Ph

ng pháp metyl hóa b ng axít clohidric th

khác nhau c ng đ

ng m i t các ngu n

c Ichihara K. và c ng s [20] nghiên c u khi xác đ nh

axít béo trong các m u sterol este, trianxylglyxerol, photpholipit. Hi u su t
quá trình este hóa đ

c so sánh v i BF3 – metanol. Ph

ng pháp cho hi u

su t este hóa cao, đ n 96% trong khi v n s d ng hóa ch t r ti n, an toàn và
thu n l i, d ki m. Qui trình phân tích tóm t t nh sau:
14


H n h p t o d n xu t đ

c t o thành t 9,7 ml dung d ch HCl đ c

(35%, v/v) pha loãng v i 41,5 ml metanol và đ

H n h p t o d n xu t th

ng g p nh t là dung d ch Na hay K metoxi

1M hay 2 M trong metanol khan. Dung d ch trên b n v ng trong nhi u tháng
khi l u tr t i 40C. Các glyxerollipit có th chéo hóa este trong vòng 2 – 5
phút khi s d ng ph

ng pháp này t i nhi t đ phòng.

Vào n m 1996, Ichihara K. và c ng s [21] đã có c i ti n qui trình trên
đ phân tích nhanh các axít béo trong trianxylglyxerol và photpholipit nh
sau:
+ Hóa ch t: n-hexan, dung d ch KOH/metanol 2M.
+ Qui trình:
ng nghi m ch a 20 - 40 mg ch t béo đ

c hòa tan trong 2 ml n-

hexan, sau đó thêm vào h n h p 0,2 ml KOH/metanol 2 M. ng nghi m đ

c

l c m nh trong 2 phút t i nhi t đ phòng. Sau đó ly tâm nh , chi t l y l p n-

15


trên đ b m vào c t GC. Ph


ng pháp truy n th ng thông qua s chi t lipit b i cloroform/metanol,

ng pháp trên không có s sai khác đáng k và cho th i gian c ng nh

hi u qu phân tích nhanh, chính xác.
•

Quá trình metyl hóa tr c ti p:
iv im tl

ng m u nh nh m u mô t 1 – 10 mg, m u ch t l ng

sinh h c có th tích nh (50 µL) ta có th th c hi n ph n ng chéo hóa tr c
ti p ngay trong m u mà không c n qua khâu tách chi t.
+ Qui trình:
M u (ch a hàm l

ng lipid không quá 10 µg) đ

c cho vào đáy c a

ng nghi m có nút xo n làm b ng Teflon. Sau đó thêm vào 1 ml HCl trong
metanol, 1 ml metanol và 0,5 ml n-hexan.

óng ch t nút ng nghi m và đun

nóng t i 1000C trong 1 gi (l c nhi u l n).
Sau khi làm l nh, thêm vào 2 ml n-hexan và 2 ml n
l c nh , l y l p n-hexan sau khi ly tâm. Tr
th đ


đáng tin c y, đ ng th i ti t ki m đ

c hóa ch t và th i gian phân tích.

Khi phân tích các axít béo trong m u d u trong h t cây, m u th t b ng
ph

ng pháp chéo hóa este tr c ti p, Jordi Eras và các c ng s [25] đã thay

đ i qui trình trên b ng vi c t o este pentyl. Ph n ng s d ng clotrimetylsilan
và 1-pentanol là các ch t t o d n xu t. Ph n ng đ

c th c hi n t i 900C

trong 40 phút. Th i gian và nhi t đ trên đ đ chuy n hóa hoàn toàn các lipit
thành các pentyl este c a axít béo. T

ng t nh qui trình trên, khi phân tích

các m u th t, Albert Tomas và các c ng s [10] đã s d ng lò vi sóng đ t ng
nhanh th i gian phân tích. Quá trình chéo hóa este tr c ti p đ
trong lò vi sóng

c th c hi n

900C trong kho ng th i gian 30 giây, trong khi các quá

trình khác c n t 1 – 2 gi . H n n a ph


SP – 2340, OV –
275

100% Cyanoetylsilicon

Metylsilicon polyme, 25%
cyanopropyl – 25% phenyl –
50% metyl
Metylsilicon polyme, 1%
vinyl – 5% phenyl
Metyl silicon
68% Biscyanopropyl – 32%
dimetylsiloxan

Polyetylenglycol

95% Dimetyl –
diphenylpoysiloxan

5

ng m i

%

100% Dimetylpolysiloxan

86%
Dimetyl
–

Carbowax 20M

P

DB-5, SPB-5, CPSIL 8CB

NP

DB-1, Rt-1, SPB-1,
SP-2100, OV-1,
OV-101, CP-SIL
5CB

NP

DB - 1701

P

VP

ng d ng
D uđ u
nành
S a, d u
th c v t đã
hydro hóa
Th t

D u các h t

- Ch

ng trình nhi t đ c t: Nhi t đ đ u 40 0C; t ng 5 0C/phút lên 120

C gi 0,5 phút; t ng 1 0C/phút lên 180 0C gi trong 1 phút, sau đó t ng

0

5 0C/phút lên 250 0C, gi

nhi t đ này trong 5 phút. T ng th i gian

phân tích 100 phút.
- Bu ng b m: Nhi t đ

injector là 250 0C; b m không chia dòng

splitless; th i gian không chia dòng là 1 phút.
- Khí mang: Heli, t c đ 0,8 ml/phút.
+ Pha t nh phân c c:
- C t DB – WAX (20m x 0,12 mm x 0,18 µm).
- Ch

ng trình nhi t đ c t: Nhi t đ đ u 100 0C, t ng 5 0C/phút đ n 250

0

250 0C 1 phút.

C, gi

HPLC c ng cho k t qu kh quan h n GC. Khi tách b ng HPLC có th s
d ng nhi u lo i detector khác nhau, nh ng đ i v i các ph
d n xu t thì detector UV và detector hu nh quang đ
c . Ngày nay ng

ng pháp có t o

c dùng ph bi n h n

i ta c ng k t h p detector kh i ph v i HPLC đ cho k t

qu phân tích chính xác h n [17]. Sau đây là các ph

ng pháp t o d n xu t

chính khi xác đ nh axít béo b ng HPLC v i detector UV và hu nh quang.
a) T o d n xu t đo UV
D n xu t hay dùng nh t đ đo UV là este c a phenacyl. Qui trình s
d ng 4-bromphenacyl bromua nh là thu c th t o d n xu t.

Dung d ch 0,2 mM trimetyl amin trong axeton khan đ
t o môi tr

c s d ng đ

ng ki m; ngoài ra có th dùng natri cacbonat hay kali hidroxit.

- Thu c th : 4-bromphenacyl bromua, ete 18-crown-6, KOH/metanol 50
mM. Axetonitrin.
- Qui trình:


thi t l p t i 242 nm.
Tùy thu c các axít béo c n tách và lo i c t mà ta có các cách gradient
khác nhau nh ng thông th

ng ng

i ta hay s d ng gradient sau: ch y

tuy n tính trong 60 phút đ u, và sau đó đ ng dòng (80% axetonitrin) trong
30 – 40 phút.
Ph

ng pháp trên đã áp d ng thành công trong nhi u đ i t

nh ng đ i t

ng khó nh huy t thanh ng

ng và có

i [9].

b) T o d n xu t đo hu nh quang
t ng đ nh y và đ ch n l c khi xác đ nh axít béo b ng HPLC,
ng

i ta đã t o ra các d n xu t đ đo hu nh quang.
Jinmao You và các c ng s đã đ ngh m t ph


axít béo t do c ng nh là các axít béo đã đ
v i gi i h n phát hi n

c axyl hóa cho k t qu r t t t,

m c ng [31].

- Hóa ch t:
Dung d ch 1: 5 mg Br-MMC hòa tan trong 5 ml axetonitrin khan.
Dung d ch 2: 13 mg ete 18-crown-6 trong 5 ml axetonitrinkhan.
L u tr các dung d ch này

- 20 0C.

Dung d ch làm vi c: 40 µL dung d ch 1 và 2 µL dung d ch 2 đ
cho vào 2 ml axetonitrin khan tr

c

c khi t o d n xu t.

Kali cacbonat (khan).
- Qui trình:
D n xu t hóa: 1- 2 µg axít béo và vài ng c a ch t n i chu n (C17:0)
đ

c hòa tan trong m t th tích nh c a diclometan. H n h p sau đó đ

c hút