BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN PHI HẢI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG 3 HOẠT
CHẤT VITAMIN B1, B6, B12 TRONG SẢN PHẨM THUỐC TIÊM
ĐÔNG KHÔ NEUTRIVIT 5000 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Hà nội -Năm 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN PHI HẢI

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG 3 HOẠT
CHẤT VITAMIN B1, B6, B12 TRONG SẢN PHẨM THUỐC TIÊM
ĐÔNG KHÔ NEUTRIVIT 5000 BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC).

Chuyên ngành :

Kỹ thuật Hóa học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC


Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN ............................................................................... 8
1.1. Giới thiệu về kỹ thuật đông khô ............................................................. 8
1.1.1. Khái niệm, ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật đông khô ................... 8
1.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới độ ổn định của sản phẩm (hay chế phẩm)
thuốc đông khô [23] ................................................................................. 10
1.2. Giới thiệu về thuốc tiêm đông khô .................................................... 14
1.3. Giới thiệu về thuốc tiêm đông khô NEUTRIVIT 5000 ...................... 17
1.4. Giới thiệu về hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 ...... 19
1.4.1. Vitamin B1 ( Thiamine Hydrochloride) [1], [5], [6], [8] .............. 19
1.4.2. Vitamin B6 ( Pyridoxine Hydrochloride) [5],[6], [8] ................... 20
1.4.2. Vitamin B12 ( Cyanocobalamin)[5],[6], [8] ................................. 20
1.5. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................... 22
1.5.1. Nguyên lý [7], [9], [10], [11] ........................................................ 22
1.5.2. Phân loại các phương pháp sắc ký lỏng [10], [11], [12], [19], [20]
.................................................................................................................. 23
1.5.3. Các đại lượng đặc trưng trong phương pháp phân tích sắc ký lỏng
[9], [10], [11], [24], [25], [26] ............................................................... 24
1.5.4. Phương pháp định lượng trong HPLC [9], [10], [11], [27], [28] 27


Chƣơng 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 30
2.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 30
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu...................................................................... 30

Diode - Array Detector

High Performance Liquid
Chromatography
IE-HPLC Ion Exchange - HPLC
LC
Liquid Chromatography
LOD
Limit of Detection
LOQ
Limit of Quantitation
MeOH
Methanol
NP-HPLC Normal Phase - HPLC
RP-HPLC Reverse Phase - HPLC
ppb
Part per billion
ppm
Part per million
RSD
Relative Standard Deviation
S
Standard Deviation

Tên tiếng Việt
Hiệp hội các nhà hoá học
phân tích chính thức
Detector mảng điot
Điều kiện thí nghiệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao


Bảng 3.1

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của thành phần pha
động

36

3

Bảng 3.2

Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ dòng
pha động

40

4

Bảng 3.3

Kết quả đánh giá độ ổn định của hệ thống
HPLC khi xác định hỗn hợp 3 hoạt chất chính
là Vitamin B1, Vitamin B6, Vitamin B12.

41

Kết quả xách định S ( độ lệch chuẩn của diện
tích pic của Vitamin B1, Vitamin B6, Vitamin
B12. đối với mẫu giả dƣợc)


50

9

Bảng 3.8

Kết quả phân tích hàm lƣợng Vitamin B1 một số
mẫu thực tế bằng phƣơng pháp HPLC

52

10

Bảng 3.9

Kết quả phân tích hàm lƣợng Vitamin B6 một số
mẫu thực tế bằng phƣơng pháp HPLC

53

11

Bảng 3.10

Kết quả phân tích hàm lƣợng Vitamin B12 một
số mẫu thực tế bằng phƣơng pháp HPLC

53


các giai đoạn của chu trình đông khô.
Công thức cấu tạo của Vitamin B1
Công thức cấu tạo của Vitamin B6
Công thức cấu tạo của Vitamin B12
Hệ thống phân tích HPLC
Sắc đồ và các đại lƣợng đặc trƣng
Sắc đồ của 2 chất đƣợc tách ra khỏi nhau

9
10

Hình 3.1
Hình 3.2

Phổ UV-Vis
Phổ UV - Vis 3D của dung dịch chuẩn

34

Vitamin B1

35

11

Hình 3.3

12

Hình 3.4


37

Sắc đồ khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ dòng
pha động (u) đến sự tách hỗn hợp 3 chất

39

15

Hình 3.7

Sắc đồ ký đồ mẫu giả dƣợc

44

16

Hình 3.8

Đƣờng hồi quy tuyến tính giữa diện tích đỉnh
và nồng độ chất phân tích

45


17

18


chính là Vitamin B1, Vitamin B6 và vitamin B12 (trên cơ sở phối trộn ba
nguyên liệu chứa 3 hoạt chất riêng lẻ), phục vụ điều trị một số bệnh thiếu hụt
vitamin nhóm B do dinh dƣỡng, Viêm đa dây thần kinh do rƣợu, Thiếu máu
ác tính tự phát, hoặc sau khi cắt dạ dày).
Tuy các loại thuốc chứa hoạt chất trên đã và đang đƣợc lƣu hành trên
thị trƣờng thế giới và ở nƣớc ta, nhƣng cho đến nay, quy trình phân tích các
loại thuốc đó chƣa đƣợc đƣa ra trong các Dƣợc điển Việt Nam, Dƣợc điển
Anh (British Pharmacopoeia), Dƣợc điển Mỹ (U.S. Pharmacopoeia), Dƣợc


2

điển Châu Âu (European Pharmacopoeia). Mặt khác, quy trình phân tích riêng
Vitamin B12 và phân tích đồng thời 2 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6
cũng chƣa đƣợc công bố trong các dƣợc điển nói trên. Rõ ràng, để phục vụ
công tác kiểm soát an toàn dƣợc phẩm và đồng thời, đóng góp vào việc phát
triển các quy trình phân tích dƣợc phẩm cho ngành kiểm nghiệm thuốc ở nƣớc
ta, những nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích 3 hoạt chất trên trong các
loại thuốc là rất cấp thiết.
Xuất phát từ các vấn đề trên, đề tài “ Nghiên cứu xây dựng qui trình
định lượng 3. hoạt chất vitamin B1, B6, B12 trong sản phẩm thuốc tiêm
đông khô Neutrivit 5000 bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) ” đƣợc thực hiện nhằm mục đích xây dựng đƣợc quy trình phân tích
3 hoạt chất bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), đóng góp
tích cực vào ngành kiểm nghiệm thuốc ở nƣớc ta.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng đƣợc quy trình phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, vitamin
B6, Vitamin B12 trong thuốc tiêm đông khô bằng phƣơng pháp HPLC nhằm
đóng góp thêm vào lĩnh vực kiểm nghiệm dƣợc phẩm.
- Áp dụng quy trình phân tích vào thực tế để kiểm tra một số mẫu dƣợc

lại (đối với mẫu thực tế), phân tích mẫu trắng (mẫu placebo).
- Áp dụng thực tế: phân tích một số mẫu thuốc chứa 3 hoạt chất Vitamin
B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 đang lƣu hành trên thị trƣờng Bình Định:
thuốc tiêm đông khô do Công ty BIDIPHAR sản xuất, thuốc viên nén, thuốc
viên nang do các công ty khác sản xuất.


4

4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
- Phƣơng pháp phân tích: sử dụng phƣơng pháp HPLC với detector DAD
để phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12. Định
lƣợng bằng phƣơng pháp phƣơng pháp so sánh với chuẩn.
- Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện sắc ký lỏng hiệu
năng cao và kỹ thuật xử lý mẫu: sử dụng phƣơng pháp đơn biến;
- Phƣơng pháp đánh giá tính ổn định và đặc hiệu của hệ thống HPLC với
detector DAD: xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) đối với thời gian lƣu,
diện tích đỉnh, độ đối xứng đỉnh, độ phân giải đỉnh… (yêu cầu RSD  2% đối
với tất cả các thông số đó);
- Phƣơng pháp kiểm soát chất lƣợng của quy trình phân tích: đánh giá độ
lặp lại (đối với mẫu chuẩn phòng thí nghiệm và mẫu thực tế) qua RSD; đánh
giá độ chính xác qua độ thu hồi (Recovery,%) khi phân tích mẫu thêm chuẩn
(spiked sample); xác định giới hạn phát hiện theo quy tắc 3; xác định
khoảng tuyến tính (dựa vào hệ số tƣơng quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ
chất phân tích);
5. Cấu trúc luận văn
Luận văn bao gồm 3 chƣơng:
Chƣơng 1. Tổng quan về lý thuyết
Trình bày cơ sở lý thuyết về kỹ thuật đông khô, khái niệm, ƣu điểm
và hạn chế của kỹ thuật đông khô. Giới thiệu về nguyên lý, phân loại sắc

- Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện sắc ký lỏng hiệu
năng cao và kỹ thuật xử lý mẫu: sử dụng phƣơng pháp đơn biến;
- Phƣơng pháp đánh giá tính ổn định và đặc hiệu của hệ thống HPLC với
detector DAD: xác định độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD) đối với thời gian lƣu,
diện tích đỉnh, độ đối xứng đỉnh, độ phân giải đỉnh… (yêu cầu RSD  2% đối
với tất cả các thông số đó);


6

- Xử lý số liệu bằng phƣơng pháp thống kê; sử dụng phần mềm Excel và
Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận
Các kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Ảnh hƣởng của các yếu tố đến phép xác định 3 hoạt chất Vitamin B1,
Vitamin B6 và Vitamin B12 bằng phƣơng pháp HPLC với detector DAD,
gồm:
- Xác định đƣợc bƣớc sóng phát hiện, thành phần pha động, tốc độ dòng
pha động phù hợp;
- Đã đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp HPLC xác định 3 hoạt chất
Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12
- Đã khẳng định về độ ổn định của hệ thống HPLC với detector DAD,
khoảng tuyến tính, độ lặp lại, giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng và độ
đúng của phƣơng pháp.
- Đã xây dựng đƣợc quy trình phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1,
Vitamin B6 và Vitamin B12 bằng phƣơng pháp HPLC và áp dụng vào thực
tế; Chất lƣợng của phƣơng pháp phân tích đƣợc đánh giá qua độ lặp lại và
độ đúng.
6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Ý nghĩa khoa học của đề tài: Đã xây dựng đƣợc quy trình mới cho phép
phân tích 3 hoạt chất Vitamin B1, Vitamin B6 và Vitamin B12 trong các chế

Có thể chia quá trình đông khô thành ba giai đoạn: đông lạnh, làm khô
sơ cấp, làm khô thứ cấp [22].
i) Giai đoạn đông lạnh: Đây là giai đoạn đầu tiên của quá trình
đông khô; Ở giai đoạn này, phần lớn nƣớc đƣợc tách ra khỏi dƣợc chất và
tá dƣợc, hệ tách thành nhiều pha. Kết thúc giai đoạn này sẽ tạo ra trạng
thái kết tinh hoặc vô định hình, hoặc hỗn hợp kết tinh và vô định hình của
vật chất trong hệ [21].
ii) Giai đoạn làm khô sơ cấp: Trong giai đoạn này, độ dày của lớp
băng (nƣớc đóng băng) giảm xuống, còn độ dày của sản phẩm khô tăng lên.


9

Tới bộ ngƣng tụ

Chất rắn khô
Hƣớng của nhiệt và độ chuyền
khối
Mặt phân cách thăng hoa

Dung dịch đông lạnh
Tấm đỡ gia nhiệt

Hình 1.1. Sơ đồ thể hiện giai đoạn làm khô sơ cấp vật chất trong lọ thuốc
Nƣớc đá tạo thành trong giai đoạn đông lạnh sẽ thăng hoa trực tiếp khi
hạ áp suất của buồng đông khô dƣới áp suất hơi của nƣớc đá.
Trong giai đoạn làm khô sơ cấp, cần duy trì nhiệt độ của sản phẩm
không vƣợt quá - 150C, áp suất buồng thông thƣờng duy trì từ 0,05 mm Hg
(0,0665 mbar) đến 0,2 mm Hg (0,2660 mbar).
iii) Giai đoạn làm khô thứ cấp: Trong giai đoạn này, nƣớc không

1,5
LÀM KHÔ THỨ CẤP

1,2

5
LÀM KHÔ SƠ CẤP

-10

0,9
0,6

Nhiệt shelf
Nhiệt sản phẩm

-25
0,3

ĐÔNG LẠNH

-40

Thời gian(h)
0

2

4 6


đƣợc truyền do tiếp xúc bị cản trở bởi khay kim loại sử dụng, bề dày của đáy
lọ, bề dày lớp sản phẩm đông lạnh. Sự truyền nhiệt do tiếp xúc phụ thuộc vào
áp suất buồng đông khô, nên việc kiểm soát áp suất rất quan trọng để duy trì
sự đồng nhất giữa các lô sản xuất. Sự truyền nhiệt do đối lƣu không đáng kể.
Bức xạ nhiệt nhỏ nhƣng cũng có ý nghĩa, đóng góp vào tổng lƣợng nhiệt
truyền cho sản phẩm. Độ chuyển khối trong quá trình đông khô chính là
lƣợng nƣớc từ quá trình thăng hoa đầu tiên qua những kẽ hở của lớp chất rắn
khô, khoảng trống của lọ, khe hở của nút và buồng đông khô tới bộ phận
ngƣng tụ;
+ Thiết bị đông khô: Loại thiết bị đông khô đi kèm với khả năng điều
khiển nhiệt độ và áp suất gắn với các thiết bị kiểm tra, khả năng của bộ phận
ngƣng tụ ... có tác động lớn đến không chỉ công suất mà cả chất lƣợng của sản
phẩm thu đƣợc;
+ Điều kiện bảo quản: Hàm lƣợng nƣớc còn lại trong chế phẩm đông
khô là một đặc tính có liên quan nhiều đến độ ổn định vật lý và hoá học của
chế phẩm, đặc biệt với các chất rắn vô định hình. Các chế phẩm đông khô
thƣờng đƣợc bảo quản ở nhiệt độ dƣới nhiệt độ chuyển hoá thuỷ tinh của nó
và nhiệt độ chuyển hoá thuỷ tinh có liên quan trực tiếp với hàm ẩm của chế


12

phẩm. Khi nhiệt độ chuyển hoá thuỷ tinh giảm, do tác động của nhiệt độ bảo
quản, có thể dẫn tới không ổn định về trạng thái vật lý nhƣ bánh thuốc co lại
hay bị nát và thúc đẩy tốc độ của các phản ứng hoá học làm cho chế phẩm
không ổn định.
- Ưu, nhược điểm và ứng dụng của kỹ thuật đông khô
Kỹ thuật đông khô có nhiều ưu điểm [1], [2], [22], [23].:
+ Quá trình làm khô đƣợc tiến hành ở nhiệt độ thấp, nên hạn chế đƣợc
các phản ứng hoá học xảy ra làm phân huỷ dƣợc chất;

40mg, 125mg
Pantoprazol
40mg
Cefuroxime
natri
Ceftazidime
Chloramphenic
ol
Dexamethazon
Vaccin sởi,
quai bị
Vitamin B
Tenoxicam
Omeprazol
Vitamin B
Alpha
chymotrypsin
Dibencozide
Vancomycin
Meclofenoxat

Biệt dƣợc
Losec
Ulcozol
Solu- Medrol 40mg,
125mg

Hãng sản xuất Quốc gia
Astrazeneca
Thụy Điển


Bidiphar

Bình ĐịnhViệt Nam

Cebedexacol

Varilrix
Tricobion
Pycityl
Pyme OM 40
Neutrifort
 chymotrypsin 5.000 IU
Bidicozan
Vancomycin 500mg
Bidilucil

Pháp

Việt Nam


14

1.2. Giới thiệu về thuốc tiêm đông khô
Thuốc tiêm đông khô là thuốc tiêm ở dạng bột vô khuẩn, đƣợc bào chế
bằng phƣơng pháp đông khô và đƣợc pha thành dung dịch hay hỗn dịch ngay
trƣớc khi tiêm.
Kỹ thuật bào chế thuốc tiêm đông khô thƣờng đƣợc áp dụng cho các
chế phẩm sinh học hoặc các chế phẩm thuốc có dƣợc chất không bền ở dạng

khô trở lại là tƣơng tự nhau. Tuy nhiên, nếu sử dụng axit hoặc bazơ dễ bay
hơi để điều chỉnh pH của dung dịch trƣớc khi đông khô thì pH có thể thay đổi
đáng kể trong quá trình quá trình đông khô.
Để lựa chọn giá trị pH thích hợp cho một dung dịch thuốc tiêm, ngƣời
ta thƣờng nghiên cứu thiết lập đƣờng cong biểu diễn sự phụ thuộc của tuổi thọ
thuốc theo giá trị pH. Khoảng giá trị pH đƣợc lựa chọn sẽ là pH để thuốc có
độ ổn định cao nhất. Khi thuốc đạt tuổi thọ trên 2 năm trong khoảng pH rộng,
thì có thể lựa chọn pH của thuốc tiêm cho những mục tiêu khác nhƣ khả năng
dung nạp tại vị trí tiêm, sinh khả dụng, ....
Trong quá trình bảo quản, pH của thuốc tiêm có thể thay đổi do sự
biến đổi của dƣợc chất, gây ra do các chất có trong thành phần bao bì thuỷ
tinh hoà tan dần dần vào dung dịch thuốc... Khi pH của thuốc tiêm thay đổi sẽ
làm giảm độ ổn định của dƣợc chất trong dung dịch. Do vậy, để duy trì pH
của dung dịch thuốc tiêm ổn định ở giá trị thích hợp nào đó, ngƣời ta thƣờng
dùng hệ đệm. Việc lựa chọn hệ đệm trong công thức đông khô cần phải chú ý
đến khả năng hệ đệm bị kết tinh trong giai đoạn đông lạnh, làm thay đổi đáng
kể pH, làm giảm độ ổn định của chế phẩm ngay trong quá trình đông khô.
iii) Tá dược [26]:
- Tá dược độn: Trong trƣờng hợp dƣợc chất đƣợc dùng với liều rất nhỏ
và tự nó không thể hình thành đƣợc bánh đông khô có hình dạng xác định,
ngƣời ta phải thêm tá dƣợc độn để phân tán dƣợc chất và tạo khuôn. Các tá