TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ
THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC

2015

1


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------

NGUYỄN THỊ NGỌC CHÂM

XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ
THREONINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO
(HPLC)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

..............................................................................................................................
 Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp
Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2015
Cán bộ hướng dẫn

Ts. Nguyễn Thị Thu Thủy
3


Trƣờng Đại Học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ Môn Hóa Học

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
----------

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ CHẤM PHẢN BIỆN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
____________

___________________________
Năm học 2015 – 2016

Đề tài: “XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG LYSINE, METHIONINE VÀ
THREONINETRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNGHIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LỜI CAM ĐOAN
Em tên: Nguyễn Thị Ngọc Châm tác giả của luận văn này, em xin cam
đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của riêng
em, các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp
nào khác và đã được chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng chấm bảo vệ luận
văn.
Cần Thơ, ngày... tháng... năm 2015

Nguyễn Thị Ngọc Châm

Luận văn tốt nghiệp đại học
Chuyên nghành: Hóa Dược
Đã bảo vệ và được duyệt
Hiệu trưởng:.................................................
Trưởng khoa: ...............................................
Trưởng chuyên ngành

Cán bộ hướng dẫn

kiểm nghiệm viên phòng phân tích sắc ký và các anh chị tại công ty, đã nhiệt
tình hướng dẫn, chia sẽ kinh nghiệm và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện đề tài tại đây.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân đã yêu
thương, chăm sóc và hỗ trợ con trong suốt quãng thời gian học tập, là chỗ dựa
tinh thần cho con vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống, tạo mọi điều kiện
để con hoàn thành chương trình học của mình. Cám ơn bạn bè và mọi người
xung quanh đã luôn đồng hành, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập.

i


TÓM TẮT
Để đảm bảo sự cân bằng giữa các amino acid trong sản phẩm thức ăn
chăn nuôi cần tiến hành phân tích xác định hàm lượng các amino acid bằng
các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao , đề tài tiến hành phân tích
định lượng lysine, methionine và threonine là các amino acid thiết yếu
thường được phối trộn trong thức ăn chăn nuôi nhằm tăng tốc độ sinh trưởng
và năng suất sản xuất của vật nuôi, phương pháp ứng dụng phân tích bằng
máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mẫu thức ăn chăn nuôi được thủy
phân với dung dịch HCl 6M (103◦C trong 24 giờ) và tạo dẫn xuất tiền cột với
ortho-phthaladehyde với sự có mặt của tác chất 3-mercaptopropanoic acid
tạo thành hợp chất có khả năng phát huỳnh quang mạnh, quá trình tạo dẫn
xuất tiền cột được tự động hóa với thiết bị bơm và lấy mẫu tự động
(autosampler), sự phân tách được thực hiện trên cột Agilent Zorbax EclipseAAA (4,6 150 mm, 5 m) và được phát hiện bằng detector DAD ở bước sóng
( 338nm.
Phương pháp phân tích có độ chọn lọc cao (sự sai khác về thời gian lưu
trên mẫu thử và mẫu chuẩn nhỏ hơn 4 %), khoảng tuyến tính rộng (3 - 150
ppm, R2 > 0,995), phương pháp có độ chụm đạt (RSD = 2,6 % với lysine, 2,5

2.1.4 Tính chất hóa học .............................................................................. 9
2.2 Lysine ..................................................................................................... 11
2.2.1 Giới thiệu về lysine ......................................................................... 11
2.2.2 Tác dụng của Lysine........................................................................ 12
2.3 Methionine ............................................................................................ 13
2.3.1 Giới thiệu về Methionine................................................................. 13
2.3.2 Tác dụng của methionine ................................................................ 13
2.4 Threonine ............................................................................................... 14
2.4.1 Giới thiệu về threonine .................................................................... 14
2.4.2 Tác dụng của threonine ................................................................... 15
2.5 Một số phương pháp định lượng amino acid ......................................... 15
2.5.1 Phương pháp sắc ký giấy................................................................. 15
2.5.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng ........................................................ 17
2.5.3 Phương pháp sắc ký khí .................................................................. 17
iii


2.5.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ........................... 17
2.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................. 18
2.6.1 Khái niệm ........................................................................................ 18
2.6.2 Nguyên lí hoạt động và tách sắc ký................................................. 18
2.6.3 Phân loại .......................................................................................... 19
2.6.4 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................. 20
2.7 Tạo dẫn xuất amino acid ổn định ........................................................... 22
2.8 Thủy phân protein .................................................................................. 23
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM .... 25
3.1 Địa điểm phòng thí nghiệm .................................................................... 25
3.1.1 Địa điểm thí nghiệm ........................................................................ 25
3.1.2 Thời gian tiến hành thí nghiệm ....................................................... 25
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ .......................................................................... 25

4.5.1 Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp................................... 44
4.5.2 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ................................... 45
4.6 Kết quả tiến hành trên mẫu thử .............................................................. 46
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................. 48
4.1 Kết luận .................................................................................................. 48
4.2 Kiến nghị ................................................................................................ 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 50
PHỤ LỤC........................................................................................................ 51

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Các amino acid thường gặp ............................................................... 7
Bảng 3.1 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
.......................................................................................................................... 33
Bảng 3.2 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) ....... 35
Bảng 3.3 Quy định về độ thu hồi của Hội đồng châu Âu ............................... 35
Bảng 3.4 Điều kiện điều chỉnh máy HPLC trong quá trình phân tích ............ 39
Bảng 3.5 Xây dựng dãy chuẩn lysine, methionine và threonine ..................... 40
Bảng 4.1 Thời gian lưu của mẫu chuẩn của 3 loại amino acid ....................... 42
Bảng 4.2 Phương trình đường chuẩn và hệ số tương quan tuyến tính ............ 42
Bảng 4.3 RSD (%) của hàm lượng methionine trong thức ăn chăn nuôi ........ 44
Bảng 4.4 RSD (%) của hàm lượng lysine trong thức ăn chăn nuôi ................ 45
Bảng 4.5 RSD (%) của hàm lượng threonine trong thức ăn chăn nuôi ........... 45
Bảng 4.6 Hàm lượng lysine trong mẫu nguyên liệu........................................ 45
Bảng 4.7 Độ chệch của phương pháp dựa trên độ chệch của hàm lượng mẫu
nguyên liệu ....................................................................................................... 46
Bảng 4.8 Kết quả phân tích hàm lượng lysine, methionine, threonine trong
thức ăn chăn nuôi ............................................................................................. 46

Hình 3.4 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu và phân tích amino acid trên HPLC ...... 36
Hình 4.1 Đồ thị phương trình đường chuẩn của lysine ................................... 42
Hình 4.2 Đồ thị phương trình đường chuẩn của methionine .......................... 43
Hình 4.3 Đồ thị phương trình đường chuẩn của threonine ............................. 43

vii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
2-ME

2 – Mercaptoethanol

3-MPA

3 – Mercaptopropanoic acid

ACN

Acetonitrile

AOAC

Association of analytical comunities

AQC

6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate

HPLC


NRC

National Reasearch Council

OPA

ortho-Phthaladehyde

pI

Isoelectric point

RSD

Relative standard deviation

S/N

Signal to Noise

SKPB

Sắc ký phân bố

SKPĐ

Sắc ký pha đảo

SKPT


Kilogram

L

Liter

mg

Milligram

mL

Milliliter

ppb

parts per billion

ppm

parts per million
Microgram
Microliter

ix


CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề

triển và chất lượng thịt của gia súc và gia cầm.
Để xác định hàm lượng và đảm bảo cân bằng tỉ lệ các thành phần dinh
dưỡng nói chung và amino acid nói riêng, bằng các phương pháp phân tích
hóa học hiện đại, ta có thể định lượng và đánh giá thành phần các amino acid
trong thức ăn chăn nuôi một cách dễ dàng mà vô cùng chính xác.

2


Do vậy, đề tài “Xác định hàm lƣợng lysine, methionine và threonine
trong thức ăn chăn nuôi bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC)” nhằm khảo sát quy trình định lượng các loại amino acid nói chung
và lysine, methionine, threonine nói riêng, góp phần xác định thành phần dinh
dưỡng và đánh giá chất lượng các sản phẩm thức ăn chăn nuôi bằng một
phương pháp phổ biến, có độ chính xác cao và giới hạn phát hiện thấp. Từ đó,
có thể ứng dụng vào thực tiễn để làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về
nhu cầu protein, amino acid của người và động vật, cũng như góp phần làm
hoàn thiện các phương pháp phân tích protein.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
- Tìm điều kiện tối ưu về quy trình xử lý mẫu, quy trình định lượng
lysine, methionine, threonine trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Áp dụng và ổn định phương pháp phân tích amino acid trong thức ăn
chăn nuôi từ đó đánh giá được chất lượng một số loại thức ăn chăn nuôi được
bán trên thị trường ở thành phố Cần Thơ.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Phân tích định tính: lysine, methionine, threonine dựa vào thời gian lưu
của mẫu chuẩn và mẫu thử từ kết quả phân tích trên HPLC.
Phân tích định lượng: Xây dựng đường chuẩn, xác định giới hạn phát hiện
(LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ lệch chuẩn (RSD), độ chính xác của

 Acid monoamine – monocarboxylic (amino acid chứa 1 nhóm –
NH2 và 1 nhóm –COOH).
 Acid monoamine – dicarboxylic (amino acid chứa 1 nhóm –NH2
và 2 nhóm –COOH).
 Diamine – monocarboxylic (amino acid chứa 2 nhóm –COOH
và 1 nhóm –NH2).

Amino acid mạch vòng: gồm 2 loại đồng vòng và dị vòng.

4


Ngoài ra, dựa vào tính chất của gốc R người ta còn phân loại amino acid
thành 5 nhóm: nhóm không phân cực (nhóm kỵ nước), nhóm phân cực nhưng
không tích điện, nhóm tích điện dương, nhóm tích điện âm và nhóm R là nhân
thơm.
 Nhóm I. Gồm 7 amino acid có gốc R không phân cực kỵ nước:
glycine, alanine, proline, leucine, isoleucine, valine, methionine.

Hình 2.2 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm I
 Nhóm II. Gồm 3 amino acid có R là nhân thơm: phenylalanine,
tyrosine, tryptophan.

Hình 2.3 Công thức cấu tạo các amino acid nhóm II
 Nhóm III. Gồm 5 amino acid có gốc R phân cực, không tích điện:
serine, threonine, aspargine, cystein, glutamine.

5



liệu sẵn có. Nhóm này gồm các amino acid còn lại.

Theo nhiều nghiên cứu, tuy tyrosine và cystein là các amino acid không
thiết yếu cơ thể có thể tổng hợp được nhưng với điều kiện phải có
phenylalanine cơ thể mới có thể tổng hợp được tyrosine và phải có methionine
mới tổng hợp được cystein. Do vậy, nếu trong khẩu phần ăn của người và
động vật nếu không bổ sung đầy đủ phenylalanine và methionine sẽ dẫn đến
thiếu hụt tyrosine và cystein.
Ngoài các amino acid thường gặp ở trên, trong phân tử protein còn có một
số amino acid khác, đó là những loại ít gặp. Các amino acid này là dẫn xuất
của những amino acid thường gặp như: trong phân tử colagen có chứa 4 –
hydrogenxyproline là dẫn xuất của proline, 5 – hydrogenxylysine là dẫn xuất
của lysine... Mặt khác, mặc dù không có trong cấu trúc protein, nhưng có rất
nhiều loại amino acid khác thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết với hợp chất
khác trong các mô và tế bào, chúng có thể là chất tiền thân hay là các sản
phẩm trung gian của quá trình chuyển hoá trong cơ thể sinh vật.
Bảng 2.1 Các amino acid thường gặp
Tên amino
acid
Glycine
Alanine
Proline
Valine
Leucine
Isoleucine
Methionine

Tên amino acid gọi theo danh
pháp hoá học


I
M

75
89
115
117
131
131
149


Phenylalanine -amino--phenylpropionic
Phe
Tyrosine
Tyr
-amino-hydrogengenxyphenylpropionic
-amino--idolylpropionic
Tryptophan
Trp
-amino--hydoxypropionic
Serine
Ser
-amino-Threonine
Thr
hydrogengenxybutiric
Cysteine
Aspargine
Glutamine
Lysine

S
T

204
105
119

C
B
Q
K
H
R
D
E

121
132
146
146
155
174
133
147

2.1.3 Tính chất vật lý [1]
Màu sắc và mùi vị:
Các amino acid thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như
glycine, alanine, valine, serine, histidine, tryptophan; một số loại có vị đắng
như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine. Bột ngọt hay còn gọi là

Do trong phân tử có cả nhóm amino (–NH2) và nhóm carboxylic (–COOH)
vừa có khả năng nhận proton (H+) thể hiện tính base, vừa có khả năng nhường
proton thể hiện tính acid.

Dạng ion lƣỡng cực

Dạng phân tử

Hình 2.8 Công thức dạng chuyển hóa lưỡng cực của phân tử amino acid

9


Phản ứng với ninhydrin
Khi đun nóng amino acid với ninhydrin tạo phức màu xanh tím (trừ proline
cho màu vàng).Các nhà phân tích cũng lợi dụng tính chất này để định lượng
amino acid bằng cách định lượng khí NH3, CO2 hoặc aldehyde vừa tạo thành
từ phản ứng.
Amino acids

Phức xanh tím

2 x ninhydrin

Hình 2.9 Phản ứng tạo phức với ninhydrin của amino acid
Phản ứng Sanger
Đây là một phương pháp phổ biến nhất được ứng dụng để xác định amino
acid trong mạch polypeptide từ đầu N.
Khi nghiên cứu tính chất hóa học của amino acid ta phát hiện ra rằng nhóm
α– amine có khả năng trùng hợp với dinitrobenzene. Trong mạch chỉ có một

ví dụ phản ứng oxy hoá khử do nhóm –SH của cysteine, phản ứng tạo muối do
các nhóm –COOH hay –NH2 của glutamte hay lysine, phản ứng tạo ester do
nhóm OH của tyrosine...

Oxy hóa
Khử

Hình 2.12 Phản ứng oxi hóa của cystein
2.2 Lysine [3]

-

2.2.1 Giới thiệu về lysine
Lysine (viết tắt là Lys hoặc K). Tên khoa học: 2,6-diaminohexanoic acid.
Lysine là một α-amino acid chứa hai nhóm –NH2 và một nhóm –COOH
với công thức phân tử: C6H14N2O2.
Công thức hóa học: HOOCCH(NH2)(CH2)4NH2.
Nó là một amino acid thiết yếu, cơ thể không thể tự tổng hợp được.
Trong cấu tạo phân tử có chứa một carbon bất đối xứng nên chúng có hai
dạng đồng phân quang học: D-Lysine và L-Lysine. Hai đồng phân này có
11


tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng
phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái làm tính chất sinh học
của chúng hoàn toàn khác nhau và cơ thể sinh vật chỉ hấp thu được dạng
L-Lysine.

L-Lysine



-

-

2.2.2 Tác dụng của Lysine
Lysine là một amino acid rất cần cho hoạt động sống của người và động
vật. Nghĩa là cơ thể không tự tổng hợp được nó, phải lấy từ nguồn thức
ăn bên ngoài (chúng thuộc loại amino acid thiết yếu). Lysine giữ vai trò
sống còn trong sự tổng hợp protein. Nó là chìa khoá trong việc sản xuất
các enzyme, hormone và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề
kháng và chống trả với bệnh tật, đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi
khuẩn gây bệnh.
Lysine cần thiết cho sự phát triển xương của trẻ, hỗ trợ sự hấp thụ calci,
duy trì sự cân bằng nitơ trong cơ thể.
Lysine giúp ăn ngon miệng, gia tăng chuyển hoá và hấp thu tối đa chất
dinh dưỡng và phát triển chiều cao.
Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ khó hoạt động bình
thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm
lớn, trí tuệ phát triển kém, dễ thiếu men tiêu hoá và nội tiết tố. Chính vì

12