Nghiên cứu Y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG
MỘT SỐ CHẤT BẢO QUẢN NHÓM PARABEN
TRONG CHẾ PHẨM KEM BÔI DA BẰNG HPLC-PDA
Huỳnh Xuân Vinh*, Nguyễn Đức Tuấn*

TÓM TẮT
Mở đầu – Mục tiêu: Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, nhu cầu làm đẹp của con người ngày càng
tăng, kéo theo đó là sự ra đời của nhiều loại mỹ phẩm. Trong một thị trường mang tính cạnh tranh cao, có không
ít nhà sản xuất sẳn sàng vì lợi nhuận đã đưa ra thị trường những sản phẩm kém chất lượng bằng việc đưa vào
những chất hóa học bị cấm hoặc vượt quá giới hạn cho phép, trong đó có chất bảo quản nhóm paraben. Vì vậy,
nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng một quy trình nhanh chóng, đơn giản, ít tiêu tốn dung
môi khi tiến hành định lượng đồng thời một số paraben trong chế phẩm kem bôi da đang có trên thị trường.
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu:
Đối tượng nghiên cứu: Methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben và isobutylparaben.
Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện sắc ký ảnh hưởng đến quá trình phân tích các paraben
như hệ dung môi, tỷ lệ pha động, pH, nhiệt độ cột, v.v. Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành
thẩm định quy trình phân tích bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, giới hạn định lượng, giới
hạn phát hiện, hiệu suất chiết, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính xác và độ đúng. Quy trình sau khi được
thẩm định sẽ được ứng dụng để kiểm tra các paraben trong một số chế phẩm kem bôi da có mặt trên thị trường.
Kết quả: Đã xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời methylparaben, ethylparaben,
propylparaben, butylparaben và isobutylparaben như sau: cột sắc ký Phenomenex Gemini-NX C18 (150 x 4,6
mm; 3 µm), đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 254 nm, pha động acetonitril và nước acid acetic pH 3 (35:65), thể
tích tiêm mẫu 10 µl, tốc độ dòng 1 ml/phút. Quy trình phân tích đã được thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống, có
tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, đạt yêu cầu về độ đúng (tỷ lệ phục hồi trong khoảng 94% – 109%) và độ
lặp lại (RSD < 2%), hiệu suất chiết cao và ổn định, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp. Kết quả kiểm
tra các paraben trong một số chế phẩm kem bôi da đang lưu hành tại Việt Nam cho thấy hàm lượng các paraben
nằm ở mức giới hạn cho phép.

profits, many manufacturers have launched poor quality cosmetics by using banned or over accepted limit
chemicals, such as paraben preservatives. Therefore, this study was carried out with the aim of development of a
fast, simple and less-solvent-consumption HPLC method for simultaneous quantitative determination of several
paraben preservatives in skin creams.
Method: The subject of this study was methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, butyl paraben and
isobutyl paraben. Method: Several chromatographic conditions such as mobile phase, pH, column temperature,
etc. that affects selectivity and separation efficiency, were investigated. Once the appropriate chromatographic
conditions were achieved, the analytical procedure was validated, including system suitability, selectivity, limit of
quantitation, limit of detection, extraction recovery, linearity and range, precision and accuracy. Then the
validated procedure was applied for simultaneous determination of parabens in some available skin creams.
Results: The appropriate chromatographic conditions for complete separation of methyl paraben, ethyl
paraben, propyl paraben, butyl paraben, isobutyl paraben were obtained on Gemini-NX C18 column (150 x 4.6
mm; 3 µm), PDA detector with detection wavelength at 254 nm, mixture of acetonitrile and acetic acid pH 3.0
(35:65) as mobile phase, injection volume of 10 µL, flow rate of 1.0 ml/min. Validation results showed that the
method was suitable for the HPLC system, selective, linear, accurate (the recoveries in the range of 94.0%-109.0%
of the expected values), precise (RSD ≤ 2%), high and stable extraction recovery, and high sensitivity. All the
calculations concerning the quantitative analysis showed that several available skin creams in Vietnam market
contained an amount of paraben preservatives that was below accepted limits.
Conclusion: The RP-HPLC method for simultaneous determination of methyl paraben, ethyl paraben,
propyl paraben, butyl paraben, and isobutyl paraben was successfully developed and validated, using isocratic
mode and mobile phase without buffer. The proposed method was applied for quantitation of paraben preservatives
in some skin creams available in the market.
Keyword: methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, butyl paraben, isobutyl paraben, paraben
preservatives, skin cream, HPLC-PDA
isopropylparaben
(isoPP),
isobutylparaben
ĐẶT VẤN ĐỀ
(isoBP), pentylparaben (PenP), phenylparaben
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, nhu

dụng vượt quá giới hạn cho phép. Một khảo sát

Chuyên Đề Dƣợc

437


Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018

Nghiên cứu Y học

năm 2016 cuả Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc,
Mỹ phẩm, Thực phẩm TPHCM đã ph{t hiện có
2/10 mẫu kem khảo s{t không đạt giới hạn hàm
lượng paraben. Việc định lượng đồng thời 4
paraben MP, EP, PP v| BP đã được hướng dẫn
cụ thể trong tài liệu ACM INO 04 của ASEAN(4),
sử dụng kỹ thuật HPLC. Tuy nhiên, quy trình
này có một số hạn chế như tiêu hao lượng dung
môi và hóa chất lớn khi sử dụng pha động gồm 4
loại dung môi, thời gian ph}n tích d|i, chưa khảo
sát khả năng t{ch đối với c{c paraben l| đồng
phân
vị
trí
như
propylparaben
v|
isopropylparaben,
butylparaben

Số lô
QT128 060815 NLQT004 011214 QT130 060816 NLQT002 020716 NLQT003 011214
Độ tinh khiết theo nguyên trạng
100,08%
96,62%
100,01%
99,2%
99,16%

Trang thiết bị
Hệ thống HPLC Alliance 2695XE ghép nối
với đầu dò PDA 2996, hệ thống HPLC Alliance
e2695 ghép nối với đầu dò PDA 2998, cột sắc ký
Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm; 3 µm), cân phân
tích Satorius CP 225D (max = 220 g, d = 0,01 mg),
bể siêu âm T840 DH – Elma, m{y đo pH S220
Metler Toledo, bể cách thủy Memmert.

Hóa chất và dung môi
Acetonitril v| methanol đạt tiêu chuẩn dùng
trong sắc ký lỏng (Merck). Acid acetic băng v|
ethanol đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck).
Mẫu kem bôi da không paraben
Mẫu kem bôi da không paraben được sử
dụng để tạo mẫu giả lập là INNISFREE OLIVE
REAL MOISTURE HAND CREAM với thành
phần nước, glycerin, butylen glycol, ceatearyl
alcol,< được sản xuất bởi công ty Innisfree Hàn
Quốc, số lô T13805, hạn dùng 28/12/2019.



Nghiên cứu Y học

nồng độ MP và EP là 400 ppm; PP, BP và
isoBP là 200 ppm.

Dung dịch mẫu giả lập

Dung dịch đối chiếu gốc hỗn hợp paraben
Cân chính xác khoảng 32 mg MP và EP, 11,2
mg PP và BP, cho v|o bình định mức 50 ml (bình
A). Cân chính xác khoảng 5 mg isoBP, cho vào
bình định mức 200 ml, thêm khoảng 40 ml dung
môi pha mẫu, lắc cho tan, thêm dung môi pha
mẫu đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch
isoBP có nồng độ 25 ppm (dung dịch B). Hút
chính xác 8,65 ml dung dịch B, cho vào bình A,
thêm khoảng 25 ml dung môi pha mẫu, lắc cho
tan, thêm tiếp dung môi pha mẫu đến vạch, lắc
đều, thu được dung dịch đối chiếu gốc hỗn hợp
paraben có nồng độ MP, EP là 640 ppm, PP và
BP là 224 ppm, isoBP là 4,32 ppm.

không paraben, cho v|o bình định mức 100

Dung dịch đối chiếu 1
Hút chính xác 1 ml dung dịch đối chiếu gốc
MP, 1 ml dung dịch đối chiếu gốc EP; 0,7 ml
dung dịch đối chiếu gốc PP; 0,7 ml dung dịch đối
chiếu gốc BP và 0,45 ml dung dịch đối chiếu gốc

chất ít phân cực, đồng thời tham khảo một số
quy trình định lượng đồng thời paraben bằng
kỹ thuật HPLC(3-5), kỹ thuật sắc ký pha đảo với
hệ dung môi phân cực đã được áp dụng với
điều kiện sắc ký ban đầu như sau: cột sắc ký
Phenomenex Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 3
m), đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 254
nm, thể tích tiêm mẫu 10 µl. Tiến hành khảo
sát một số điều kiện sắc ký ảnh hưởng đến
qu{ trình ph}n tích c{c paraben như hệ dung
môi, tỷ lệ pha động, pH, nhiệt độ cột, v.v. Sau
khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, tiến
hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm
khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu,

Cân chính xác khoảng 1000 mg kem không

giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện, hiệu

paraben, cho v|o bình định mức 100 ml, thêm 5

suất chiết, tính tuyến tính và miền giá trị, độ

ml dung dịch H2SO4 2 M, thêm dung môi pha

chính x{c v| độ đ ng. Quy trình sau khi được

mẫu đến vạch, lắc đều, siêu }m 10 ph t, đun

thẩm định sẽ được ứng dụng để kiểm tra các

10:60:25:5
1,0
28
1,91
1,1-1,2
MeOH – Nƣớc – ACN – THF
15:60:20:5
1,0
23,5
1,94
1,1-1,2
ACN – Nước acid acetic pH 3
35:65
0,8
24
1,73
1,1-1,2
Pha động

Hình 1: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha
động MeOH - nước - ACN - THF (10:60:25:5)

Độ tinh
khiết pic
h ng đạt
Đạt
Đạt

Hình 2: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha động
MeOH - nước - ACN - THF (15:60:20:5)

3,00

35:65
35:65
40:60
40:60
45:55

440

Tốc độ dòng
(ml/phút)
1
1
0,8
1
1

Nhiệt độ cột Thời gian sắc Độ phân giải giữa Hệ số bất đối
o
( C)
ký (phút)
BP và IsoBP
của các pic
18,0
1,69
1,1-1,3
40
16,8
1,59

động ACN - nước acid acetic pH 3 (35:65), 1 ml/phút,
nhiệt độ cột 40oC

Hình 6: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha
Hình 7: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha
động ACN - nước acid acetic pH 3 (40:60); 0,8 ml/phút động ACN - nước acid acetic pH 3,75 (40:60), 1ml/phút

Hình 8: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha động ACN - nước acid acetic pH 3 (45:55), 1 ml/phút
Nhận xét: MP, EP v| PP đều tách hoàn toàn

Như vậy điều kiện sắc ký thích hợp để định

trong c{c điều kiện sắc ký trên. Tuy nhiên, hệ

lượng đồng thời 5 paraben bằng phương ph{p

pha động ACN – nước acid acetic pH 3 (35:65)

HPLC với đầu dò PDA là: cột sắc ký

và tốc độ dòng 1 ml/ph t được lựa chọn vì độ

Phenomenex Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 3

phân giải giữa BP và isoBP cao nhất, thời gian

m), đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 254 nm,

sắc ký dưới 20 phút, các pic paraben đều đạt


RSD
TB
isoBP
RSD
TB
BP
RSD
MP

tR (phút)
3,837
0,08%
5,790
0,10%
9,772
0,07%
16,703
0,08%
17,595
0,07%

S (µVxgiây)
2495607
0,16%
2426904
0,17%
820287
0,18%
12022
1.05%


bất đối đều nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Vậy quy
trình định lượng đồng thời 5 paraben có tính
phù hợp hệ thống.

Tính đặc hiệu
Kết quả khảo s{t tính đặc hiệu cho thấy: sắc
ký đồ mẫu trắng và mẫu kem không paraben
không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu
tương ứng với thời gian lưu của các paraben
trong mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ mẫu giả lập xuất
hiện pic có thời gian lưu tương đương thời gian
lưu của mỗi paraben trong sắc ký đồ mẫu đối
chiếu. Trên sắc ký đồ mẫu giả lập các pic
paraben tách hoàn toàn. Phổ UV-Vis tại thời gian
lưu của các pic paraben trong sắc ký đồ mẫu giả
lập giống với phổ UV-Vis tại thời gian lưu của
pic tương ứng trong sắc ký đồ mẫu đối chiếu.

Hình 9: Sắc ký đồ pha động

Hình 10: Sắc ký đồ dung môi pha mẫu

Hình 11: Sắc ký đồ mẫu kem không paraben

Hình 12: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1

Hình 13: Sắc ký đồ mẫu giả lập

Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), hiệu suất chiết, độ chính

24 - 64; 0,9995

24 - 64; 0,9992

0,017
0,050
92,45%-100,00%
(0,16%-0,92%)
101,02% – 108,47%
(0,72% - 1,19%)

PP
isoBP
BP
ŷ = 50186x
ŷ = 42468x
ŷ = 45870x
8,4 - 22,4; 0,9994 0,16 - 0,43; 0,9995 8,4 - 22,4; 0,9995

0,044
0,047
0,090
0,130
0,140
0,270
94,26%-100,83% 93,67%-100,83% 91,21%-96,18%
(0,15%-0,35%)
(0,18%-0,43%)
(1,05%-1,65%)
97,94%-105,58% 99,28%-107,90% 95,76%-105,55%

không có ý nghĩa. Hệ số tương quan r có gi{
trị lớn hơn 0,999. Hiệu suất chiết của các
paraben trong mẫu giả lập khá cao (> 90%) và

Như vậy quy trình định lượng đồng thời 5
paraben bằng phương ph{p sắc ký lỏng hiệu
năng cao với đầu dò PDA có tính đặc hiệu,
khoảng tuyến tính rộng, giới hạn phát hiện và
giới hạn định lượng thấp, hiệu suất chiết cao và
ổn định, đạt độ chính x{c v| độ đ ng nên có thể
được ứng dụng để định lượng paraben trong
chế phẩm kem bôi da.

Ứng dụng quy trình định lƣợng paraben trong một số chế phẩm kem bôi da có trên thị trƣờng
ảng

Kết quả định lượng các paraben trong chế phẩm kem bôi da (n=4)

Mẫu kem
KN1

Xuất xứ
Việt Nam

Số lô
5

Hạn dùng
20/5/2018


Việt Nam

67056103

06/06/2018

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy các mẫu
kem đều sử dụng đ ng c{c paraben như công bố
trên nhãn ngoại trừ sản phẩm kem bôi da KN3
(sử dụng MP và PP làm chất bảo quản nhưng chỉ
công bố trên nhãn chất bảo quản MP). Tất cả các
sản phẩm đều có h|m lượng paraben nhỏ hơn
mức giới hạn cho phép. Không có mẫu kem nào
chứa paraben cấm isobutylparaben.

Chuyên Đề Dƣợc

Chất bảo quản công bố trên nhãn
Không công bố
Methylparaben
Propylparaben
Methylparaben
Propylparaben
Methylparaben
Propylparaben
Methylparaben
Propylparaben

Hàm lượng paraben
MP: < LOD

butylparaben) với các ưu điểm sau:
- Thời gian phân tích được rút ngắn xuống
còn 18 phút khi phân tích đồng thời 5 paraben.
So với các đề tài định lượng đồng thời 4
paraben (MP, EP, PP, BP) với thời gian phân
tích thường từ 25 đến 30 phút(1).
- Chế độ rửa giải đẳng dòng, sử dụng hệ
dung môi đơn giản bao gồm acetonitril và
nước acid acetic pH 3. Trong số các công trình
định lượng đồng thời các chất bảo quản nhóm
paraben đã công bố, có tác giả đã sử dụng pha
động có đệm phosphat(1) nên cần tăng thời
gian rửa hệ thống sắc ký, cần chuyển đổi cẩn
thận giữa các kênh dung môi để tránh gây kết
tủa muối trong hệ thống, gây ăn mòn hệ thống
sắc ký; thời gian rửa cột phải kéo dài.
Mặt khác, do các loại mỹ phẩm có thành
phần rất đa dạng, chất nền phức tạp nên việc
thẩm định quy trình trên mẫu kem không
paraben cụ thể chưa mang tính đại diện cho tất
cả các mẫu kem. Các paraben được phép sử
dụng như MP, EP, PP, BP có giá thành rẻ, hiệu
lực diệt khuẩn cao ở hàm lượng nhỏ nên các
nhà sản xuất không d{m “mạo hiểm” sử dụng
paraben cấm trong các sản phẩm của họ.

KẾT LUẬN

butylparaben, isobutylparaben bằng phương
pháp HPLC với đầu dò PDA đã được xây dựng

Bộ Y Tế, Cục Quản lý Dược Việt Nam (2015), Công văn số
6577/QLD-MP về việc cập nhật quy định về các chất sử dụng trong
mỹ phẩm, ngày 13/04/2015.
Ludwig H (2007), “Validation and qualification in analytical
laboratories, second edition”, pp. 144, 146.
Trần Công Dũng, Đặng Văn Kh{nh (2014), “Nghiên cứu xây
dựng quy trình định tính và định lượng đồng thời một số chất bảo
quản nhóm 4-hydroxybenzoat (paraben) trong mỹ phẩm”, Đề tài
nghiên cứu khoa học của Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ
phẩm, Thực phẩm Thừa Thiên Huế.

Ngày nhận bài báo:

18/10/2017

Ngày phản biện nhận xét bài báo:

01/11/2017

Ngày bài báo được đăng:

15/03/2018

Quy trình định lượng đồng thời
methylparaben, ethylparaben, propylparaben,

444

Chuyên Đề Dƣợc