BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐỖ THỊ HÒAXÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI
QUANG CỦA ATENOLOL TRONG
CHẾ PHẨM BẰNG ĐIỆN DI MAO
QUẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI -2014BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ HÒA

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH
LƯỢNG CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI
QUANG CỦA ATENOLOL TRONG
CHẾ PHẨM BẰNG ĐIỆN DI MAO

chăm lo, động viên, kích lệ em trong học tập và cuộc sống. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014
Sinh viên Đỗ Thị Hòa MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ATENOLOL 3
1.1.1. Tính chất lý, hóa 3
1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng 4
1.2. TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT ĐIỆN DI MAO QUẢN 6
1.2.1. Khái niệm 6
1.2.2. Nguyên lý của quá trình điện di mao quản 7
1.2.3. Điện di mao quản vùng 9
1.3. VÀI NÉT VỀ PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC 10
1.3.1. Đồng phân quang học 10
1.3.2. Phương pháp phân tách đồng phân đối quang 10
1.3.3. Ứng dụng điện di mao quản trong phân tích đồng phân quang học 12

3.1.1. Lựa chọn cột mao quản 25
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của điện thế áp vào hai đầu mao quản. 26
3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 28
3.2.1. Độ phù hợp hệ thống 28
3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính 29
3.2.3. Độ đặc hiệu 31
3.2.4. Độ lặp lại 33
3.2.5. Độ đúng 34
3.3. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG ATENOLOL TRONG CHẾ PHẨM. 36
BÀN LUẬN 38
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BGE (Background Electrolyte) Dung dịch điện ly nền
CE (Capillary Electrophoresis) Điện di mao quản
CGE (Capillary Gel Electrophoresis) Điện di mao quản gel
CIEF (capillary isoelectric focusing)
Điện di mao quản hội tụ
đẳng điện
CITP (capillary isotachophoresis) Điện di mao quản đẳng tốc
CM-β-CD
Carboxymethyl beta
cyclodextrin
CZE (Capillary Zone Electrophoresis) Điện di mao quản vùng
DM- β-CD Dimethyl beta cyclodextrin

Bảng 6: Kết quả xác định phần trăm tìm lại trên mẫu M1(thêm 10%) 35

Bảng 7: Kết quả xác định phần trăm tìm lại trên mẫu M1(thêm 20%) 36

Bảng 8: Kết quả định lượng mẫu M2 37 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1: Công thức cấu tạo của Atenolol 3

Hình 2: Sơ đồ hệ thống điện di mao quản. 7


có chứa hoạt chất là các dạng đồng phân quang học tinh khiết, giúp nâng cao hiệu
quả điều trị, giảm liều dùng và hạn chế được nhiều tác dụng không mong muốn so
với khi dùng thuốc có chứa hoạt chất ở dạng hỗn hợp racemic. Ví dụ như
levofloxacin (đồng phân tả tuyền của ofloxacin) có tác dụng kháng khuẩn mạnh gấp
hàng chục đến hàng trăm lần dextrofloxacin (đồng phân hữu tuyền của ofloxacin)
[4], hoặc dexchlorpheniramin maleat (đồng phân hữu tuyền của chlorpheniramin
maleat) là một thuốc kháng Histamin H
1
dùng điều trị dị ứng có tác dụng mạnh gấp
hai lần chlorpheniramin maleat (dạng racemic) với cùng liều lượng do dạng đồng
phân tả tuyền không có tác dụng, do đó cho phép giảm liều dùng chỉ còn một nửa
[3].
Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, xu hướng các bệnh về tim mạch ngày
càng tăng nhanh. Đối với nhóm thuốc tim mạch thì thời gian điều trị thường kéo
dài, do đó việc sử dụng dạng đồng phân quang học tinh khiết lại càng có ý nghĩa
quan trọng. Atenolol là dẫn chất của benzenacetamid, có tác dụng chẹn chọn lọc
trên thụ thể β
1
- adrenergic, dùng điều trị tăng huyết áp, đau thắt ngực mạn tính ổn
định, nhồi máu cơ tim sớm (trong vòng 12 giờ đầu) và dự phòng sau nhồi máu cơ
tim, loạn nhịp nhanh trên thất [2]. Với một carbon bất đối trong phân tử, Atenolol là
hỗn hợp racemic của hai đồng phân đối quang: S-(-)-Atenolol và R-(+)-Atenolol.
Một số nghiên cứu đã chứng minh và chỉ ra rằng S-(-)-Atenolol đóng vai trò chính
trong chẹn β giao cảm khi dùng Atenolol dạng hỗn hợp racemic, đồng thời độc tính
cũng thấp hơn so với dạng R-(+)-Atenolol [20],[21]. Do đó việc sản xuất và sử dụng
đồng phân S-(-)-Atenolol ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Điều này đòi hỏi
phải xây dựng phương pháp phân tách và định lượng được từng dạng đơn đồng
phân trong hỗn hợp racemic của Atenolol.
Trong những năm gần đây, kỹ thuật điện di mao quản (Capillary
Electrophoresis - CE) là phương pháp hóa lý được các nhà phân tích lựa chọn trong

3
H
OH

R-(+)- Atenolol
NH
2
O
O
NH
CH
3
CH
3
OH
H

S-(-)-Atenolol
Hình 1: Công thức cấu tạo của Atenolol
Công thức phân tử: C
14
H
22
N
2
O
3
.
Khối lượng phân tử: 266,3.
Tên khoa học:

áp. Ðiều trị bằng Atenolol không làm tăng hoặc làm tăng rất ít sức cản của mạch
ngoại biên. Trong điều kiện có stress với tăng giải phóng adrenalin từ tuyến thượng
thận, Atenolol không làm mất sự co mạch sinh lý bình thường. Ở liều điều trị, tác
dụng co cơ trơn phế quản của Atenolol kém hơn so với những thuốc chẹn thụ thể
beta không chọn lọc. Tính chất này cho phép điều trị cả những người có bệnh hen
phế quản nhẹ hoặc bệnh phổi tắc nghẽn khác. Điều trị như vậy phải được kết hợp
với thuốc chủ vận thụ thể β
2
dùng theo đường hít, dưới sự giám sát chặt chẽ của
thầy thuốc chuyên khoa về hen.
Atenolol ít ảnh hưởng đến giải phóng insulin và chuyển hóa carbohydrat.
Phản ứng tim mạch đối với hạ đường huyết (như tim đập nhanh) không bị ảnh
hưởng một cách có ý nghĩa bởi Atenolol. Bởi vậy, Atenolol có thể dùng được cho
người đái tháo đường. Ở người tăng huyết áp, Atenolol làm giảm một cách có ý
nghĩa huyết áp cả ở tư thế đứng lẫn tư thế nằm. Ðể điều trị tăng huyết áp, nếu cần,
có thể kết hợp Atenolol với thuốc chống tăng huyết áp khác, chủ yếu là thuốc lợi
niệu và/hoặc thuốc giãn mạch ngoại biên [2].
Một nghiên cứu cho thấy liều 50 mg đơn đồng phân S-(-)-Atenolol làm giảm
huyết áp tâm thu, huyết áp tâm trương, nhịp tim cùng mức độ với sử dụng liều 100
mg Atenolol racemic. Trong khi đó liều 50 mg đơn đồng phân R-(+)-Atenolol
không làm thay đổi bất kì thông số nào. Như vậy đồng phân S-(-)-Atenolol là đồng
phân có hoạt tính chẹn β giao cảm và đồng phân R-(+)-Atenolol là đồng phân
không có hoạt tính [20].
5

Đồng phân R-(+)-Atenolol có thể làm tăng hoặc thậm chí gây ra những tác
dụng phụ nghiêm trọng. Đó là lý do nên thay thế Atenolol racemic bằng đơn đồng
phân S-(-)-Atenolol với liều chỉ bằng một nửa liều Atenolol racemic đang được sử
dụng để giảm tác dụng phụ [21].
1.1.2.2. Dược động học

Tiselius cố gắng tách protein huyết thanh gồm α, β – albumin và γ – globulin. Đó là
lần đầu tiên điện di được sử dụng cho việc tách các hợp chất có hoạt tính sinh học.
Tuy nhiên, sự phân tách không hoàn chỉnh do lượng mẫu lớn và sử dụng hiệu điện
thế thấp. Năm 1967, Hjerten thực hiện điện di protein, acid nucleic và các ion vô cơ
bằng mao quản có đường kính trong 300 µm, phát hiện bằng UV. Vào đầu những
năm 1980, Jorgenson và Lukacs công bố phát minh về một hệ thống CE đơn giản và
đã thu hút sự chú ý của rất nhiều các nhà nghiên cứu. Năm 1989, Karger tổ chức
Hội nghị quốc tế đầu tiên về điện di mao quản hiệu năng cao và trong cùng năm đó,
hệ thống CE thương mại đầu tiên đã có sẵn. Kể từ đó, số công bố về CE đã tăng lên
nhanh chóng do tính linh hoạt, đơn giản và hiệu quả cao của nó [17].
Điện di là hiện tượng di chuyển của tiểu phân tích điện hòa tan hay phân tán
trong chất điện giải khi có dòng điện đi qua. Cation di chuyển về phía cực âm
(catod), anion di chuyển về phía cực dương (anod). Các phần tử không tích điện
không bị hút về phía hai điện cực. Điện di mao quản (CE) là một kỹ thuật tách các
chất trong mao quản silica dài 25 - 100 cm, đường kính trong 25 - 100 μm, đường
kính ngoài 300 - 400 μm. Điện thế một chiều áp vào hai đầu mao quản 10 - 30 kV
(cường độ điện trường có thể đến 500 V/cm) tạo ra quá trình chia tách, các chất
phân tích được phát hiện khi di chuyển về một đầu mao quản nhờ một detector thích
hợp [1], [6].
7 Hình 2: Sơ đồ hệ thống điện di mao quản.
1.2.2. Nguyên lý của quá trình điện di mao quản
Quá trình vận hành của CE điển hình với mao quản silica chứa dung dịch
đệm làm việc, thì nhóm silanol (SiOH) ở trên thành trong của mao quản sẽ giải
phóng ion hydrogen (H
+
) vào dung dịch đệm và bề mặt thành mao quản sẽ tích điện
âm ngay cả ở pH rất thấp. Cation hay các chất hòa tan tích điện dương một phần

 Sắc ký mixen điện động, còn gọi là sắc ký điện động mixen (micellar
electrokinetic chromatography - MEKC).
 Điện di mao quản gel (capillary gel electrophoresis - CGE).
9

 Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (capillary isoelectric focusing - CIEF)
 Điện di mao quản đẳng tốc (capillary isotachophoresis - CITP) [1], [6].
1.2.3. Điện di mao quản vùng
Trong điện di mao quản vùng, quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác
nhau về linh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử hoặc dung dịch thử.
Linh độ là hàm số của điện tích chất phân tích và kích thước trong điều kiện nhất
định của phương pháp. Chúng được tối ưu hóa bằng cách kiểm soát các thành phần
của đệm, pH và lực ion.
Điện di mao quản vùng sử dụng nguyên lý của điện di và điện thẩm để tách
các tiểu phân tích điện.
Linh độ điện di của ion (
EP
), được biễu diễn bằng phương trình:

EP
= q/(6πηr) (1)
Trong đó q là điện tích của ion,  là độ nhớt dung dịch và r là bán kính của
ion hydrat hóa.
Từ mối liên hệ này suy ra, chất phân tích kích thước nhỏ, điện tích lớn có
linh độ lớn. Chất phân tích kích thước lớn, điện tích nhỏ có linh độ thấp.
Tốc độ di chuyển (
EP
), tính bằng cm/s, được biểu thị bằng phương trình:
v
EP

EO
)= l L / V(μ
EP
+ μ
EO
) (4)
Trong đó E là cường độ điện trường (E = V/L)
10

Hiệu lực của hệ thống điện di có thể liên quan đến linh độ, dòng EOF và
được biểu thị bằng số đĩa lý thuyết (N), được tính bằng phương trình:
N = (μ
EP
+ μ
EO
) E l /2D (5)
Trong đó D là hệ số khuếch tán của chất hòa tan và các ký hiệu khác được
định nghĩa như trên.
Độ phân giải (R
s
) của hai chất hòa tan được rửa giải kế tiếp nhau, có thể xác
định bằng phương trình:


=0,18
(


−


sáng sang bên trái thì nó được gọi là đồng phân quay trái S (tiếng Latinh: siniter
(trái)).
Hỗn hợp racemic có chứa số phân tử bằng nhau của mỗi dạng đối quang, do
đó độ quay cực tổng cộng bằng không [5], [9], [15].
1.3.2. Phương pháp phân tách đồng phân đối quang
1.3.2.1. Phương pháp phân tách đồng phân đối quang gián tiếp
11

Phương pháp này dựa trên một phản ứng hóa học giữa hai đồng phân đối
quang với một hợp chất bất đối tạo thành hỗn hợp hai đồng phân lập thể nhưng
không đối quang trước khi được phân tách bằng điện di. Được thể hiện như sơ đồ:
(R,S)-C + (S)-D [(R)-C-(S)-D] + [(S)-C-(S)-D]
Trong đó:
C: Hỗn hợp racemic cần phân tích
D: Thuốc thử bất đối
R-, S- tương ứng là đồng phân quay phải và đồng phân quay trái.
Hỗn hợp thu được có thể được tách bằng GC và HPLC. Về nguyên tắc,có thể
dùng CE để phân tích hỗn hợp trên, sử dụng dung dịch điện ly nền không chọn lọc
đối quang, bởi các thành phần trong hỗn hợp có tính chất lý hóa khác nhau.Tuy
nhiên phương pháp này rất khó áp dụng trong CE. So với phương pháp phân tách
trực tiếp thì phương pháp gián tiếp này có một số nhược điểm sau đây:
 Tốn thời gian xử lí mẫu.
 Cần có các nhóm hoạt động hóa học trong cấu trúc như nitơ, hydroxyl,
carboxylic.
 Phải sử dụng thuốc thử bất đối rất tinh khiết vì sự có thêm một chất đối
quang sẽ tạo ra thêm hai đồng phân lập thể không đối quang nữa và gây
khó khăn cho quá trình phân tích.
 Hai đồng phân trong hỗn hợp racemic cần phân tích phải phản ứng với
cùng mức độ và tốc độ.
 Đáp ứng của detector với hai dẫn xuất tạo thành phải tương đương nhau.

được sử dụng trong CE gồm các cyclodextrins (CDs), ether vòng được
tetracarboxylat hóa và kháng sinh [9], [12].
1.3.3. Ứng dụng điện di mao quản trong phân tích đồng phân quang học
Hầu hết các thuốc là hợp chất đối quang và mỗi đồng phân thể hiện tác dụng
dược lý và độc tính riêng biệt. Do đó, phân tách đồng phân đối quang là cần thiết
trong phân tích dược phẩm để có được những đồng phân an toàn và có tác dụng
mong muốn. Cho đến nay phương pháp phân tích được sử dụng cho việc tách đồng
phân đối quang bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lớp mỏng
13

(TLC), sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng siêu tới hạn (SFC), và điện di mao quản(CE).
Ứng dụng của sắc ký khí chủ yếu giới hạn trong các hợp chất dễ bay hơi. Phương
pháp được sử dụng phổ biến trong phân tích các thuốc đối quang là HPLC. CE là
một kỹ thuật bổ sung cho HPLC, đặc biệt đối với việc phân tích hợp chất phân cực
và tích điện [9]. Ưu điểm của CE gồm: hiệu lực tách cao, lượng mẫu và hóa chất sử
dụng nhỏ, thiết bị hoàn toàn tự động, cơ chế tách đơn giản và dễ dàng trong phát
triển phương pháp [9], [19]. Việc tách đồng phân đối quang bằng CE có thể được
thực hiện bằng phương pháp gián tiếp hoặc trực tiếp. Các phương pháp trực tiếp
thuận lợi hơn các phương pháp gián tiếp do sự đơn giản và tính sẵn có của một loạt
các tác nhân chọn lọc đối quang như cyclodextrins (CDs), ether vòng được
tetracarboxylat hóa và kháng sinh tạo phức lồng với các đồng phân đối quang.
Trong số đó, CD là tác nhân chọn lọc đối quang được sử dụng phổ biến nhất. Ngoài
các CD tự nhiên, các dẫn xuất CD khác nhau đã được thương mại hóa và chúng
mang lại độ chọn lọc cao trong tách đồng phân đối quang. Bên cạnh cơ chế tạo phức
lồng, các cơ chế khác dùng để tách đồng phân đối quang gồm trao đổi phối tử,
tương tác ái lực (ví dụ: việc sử dụng protein, kháng sinh là tác nhân chọn lọc đối
quang), và tương tác mixen (ví dụ: sử dụng các bề mặt tự nhiên hay tổng hợp là tác
nhân chọn lọc đối quang)[17].
CE hiện đang là mộtphương pháp được thiết lập để phân tích dược phẩm và
được khuyến khích ở một số Dược điển. Ví dụ, Dược điển Anh (BP) đề xuất việc

0,78 0,78 0,78
Độ tan (g/100ml H
2
O)
14,5 1,85 23,2
pK
a

12,33 12,20 12,08

Các nhóm hydroxyl có mặt trên vành của CD có thể dễ dàng được thay thế
bởi các phản ứng hóa học để có được các dẫn xuất CD với các mức độ thế khác
nhau, các thành phần CD biến đổi phụ thuộc vào một số thông số như điều kiện
phản ứng, loại và tỷ lệ thuốc thử…Một số lượng lớn các dẫn xuất của CD hiện đang
được sử dụng trong CE để phân tích đồng phân đối quang như dẫn xuất methyl,
hydroxyethyl, hydroxypropyl, acetyl hóa không tích điện và các dẫn xuất
methylamino, sulphobutylether, carboxymethyl, sulfat, photphat hóa tích điện. Các
dẫn xuất của CD có thể biểu hiện tính chất rất khác so với những CD tự nhiên, có
thể được sử dụng dễ dàng để cải thiện độ chọn lọc trong tách đồng phân đối quang,
ví dụ như tăng độ tan, tăng khả năng tạo ra các liên kết thứ cấp khác nhau, tiềm
15

năng trong phân tích những hợp chất không tích điện, mức độ kị nước khác nhau
của hốc kị nước. Ví dụ, so sánh β - CD và DM- β- CD, có thể thấy rằng sự có mặt
của các nhóm methoxy làm tăng hoặc độ sâu hoặc độ tan của tác nhân chọn lọc đối
quang. Nhóm thế tích điện hoặc không tích điện thay thế cho nhóm hydroxyl trên
cấu trúc CD có thể rất có ích cho tối ưu phương pháp CE. Trong thực tế, đồng phân
không tích điện có thể được chuyển đến detector như chất phân tích tích điện do sự
hình thành phức lồng với dẫn xuất của CD có nhóm thế tích điện. Hơn nữa sự
chuyển động của tác nhân chọn lọc đối quang theo hướng ngược lại với chất phân

và nồng độ CD, pH, thành phần của BGE, nhiệt độ mao quản, hiệu điện thế…[13]
1.5. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG
CỦA ATENOLOL
1.5.1. Nghiên cứu trong nước
 Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Thu Hiền,
Nguyễn Thị Kiều Anh [8], đã tách và định lượng đồng phân đối quang của
Atenolol bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, sử dụng:
 Cột: Chirex 3022 ((S)-indoline-2-carboxylic acid và (R)-1-(α-
naphtyl)ethylamin) (4,0 x 250 mm; 5 μm).
 Pha động: n-hexan : 1,2 dicloromethan : methanol : acid trifluoroacetic =
57,5 : 35 : 7,5 : 0,2 (tt/tt/tt/tt).
 Bước sóng phát hiện : 229 nm.
 Thể tích tiêm mẫu: 20 μL.
 Nồng độ chất phân tích: 0,05 mg/ml (racemic)
 Tốc độ dòng: 1 ml/ phút.
 Nhóm tác giả Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân
Bình, Nguyễn Thị Kiều Anh (2013) [7], đã khảo sát và lựa chọn để đưa ra
điều kiện điện di bằng CE như sau:
 Cột mao quản silica nung chảy: chiều dài tổng 58,5 cm (chiều dài hiệu
dụng 50 cm), đường kính trong 75 μm.
 Dung dịch điện ly nền: Tris 50 mM, CM-β-CD 8 mM, pH 4,0.
 Nhiệt độ: 20
0
C.
17

 Hiệu điện thế: 16 kV
 Chế độ tiêm mẫu: 50 mbar x 3s.
 Bước sóng phát hiện: 194 nm
 Nồng độ chất phân tích: 100 ppm (kl/tt) Atenolol racemic.