ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA SINH HỌC
------------

Nguyễn Thị Thu Tươi

NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN OsHKT2,1 MÃ
HÓA CHO PROTEIN VẬN CHUYỂN ION Ở MỘT
SỐ GIỐNG LÚA
Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy
Ngành : Công nghệ Sinh học
(Chương trình đào tạo : Chuẩn)

LỜI CẢM ƠN
Cán bộ hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Phúc
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này ngoài sự cố gắng của bản
thân, tôi đã nhận được sự động viên giúp đỡ rất nhiệt tình của các thầy cô, gia
đình và bạn bè.
Hà tôi
Nộixin
- 2014
Lời đầu tiên của khóa luận
gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới
TS. Đỗ Thị Phúc- người đã trực tiếp hướng dẫn tôi, chỉ dạy tận tình trong suốt
quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành khóa luận.


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị
Hồng Vân, cùng tập thể các thầy cô trong bộ môn Di truyền học- Khoa Sinh


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
CDS

Coding sequence

CTAB

Cetyl trimethylamoni bromide

dNTP

Deoxyribonucleotide Triphosphate

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic

Kb

Kilobase

M

Maker

Thang chuẩn

PCR


44


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B

55


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
MỞ ĐẦU
Việt Nam là nước có truyền thống trồng lúa với nền văn minh lúa nước
có trên 4.000 năm lịch sử.Việt Nam nằm trong vùng địa lý – được xem như là
khởi nguyên của cây lúa, chạy dài từ chân núi Hi Mã Lạp Sơn cho đến bờ biển
Đông. Lúa gạo là nguồn thức ăn căn bản của dân tộc Việt Nam. Cây lúa có thể
sinh sống và thích nghi trong nhiều điều kiện khác nhau: lúa rẩy, lúa nước trời,
lúa nước sâu, lúa nổi; với nhiều điều kiện đất đai khác nhau như phèn, mặn,
phù sa, thành phần cơ giới từ sét nặng đến cát pha; chịu được nóng, lạnh, khô,
hạn ở các vĩ độ, cao độ vô cùng thay đổi mà không phải loài cây lương thực
nào cũng có thể có những tính trạng vô cùng đa dạng như vậy. Lúa gạo cung
cấp nguồn lương thực cơ bản, tạo việc làm cho hàng triệu người, đóng vai trò
quan trọng trong đời sống kinh tế, xã hội chính trị trong lịch sử phát triển đât
nước Việt Nam.
Trong tình trạng nguồn lương thực khan hiếm và giá lương thực tăng
như hiện nay, thế giới sẽ phải đối mặt với nguy cơ thiếu lương thực. Theo
thống kê năm 2002: diện tích đất trồng trọt trên thế giới chiếm 10% trong tổng
số 13 tỉ ha. Sự khan hiếm về nước tưới phục vụ cho nông nghiệp đã được báo
động trong nhiều hội nghị khoa học của thế giới gần đây. Do sự thay đổi khí
quyển với hiệu ứng nhà kính, nhiệt độ của khí quyển ấm dần lên, băng tan ở
hai cực sẽ tạo sự ngập lụt ở các vùng đất thấp (như đồng bằng sông Cửu Long).
Như vậy, lũ lụt và sự xâm nhập mặn sẽ trở thành vấn đề lớn trong nhiều năm

1.1.Tổng quan về tính chịu mặn của cây lúa
1.1.1. Vài nét sơ lược về cây lúa
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính của
nước ta và nhiều nước trên thế giới.Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các
nước Châu Á với mức tiêu dùng hàng năm khoảng 180 - 200 kg/người, ở Châu
Mỹ, Châu Âu khoảng 100 kg/người[2,9].

Hình 1.Cây lúa (Oryza sativa L.)
Cây lúa trồng thuộc họ Poaceae, trước đây gọi là họ Hoà thảo
(Gramineae), họ phụ Pryzoideae, tộc Oryzae, chi Oryza, loài Oryza sativa và
Oryza glaberrima. Loài Oryza sativa là lúa trồng ở Châu Á và Oryza
glaberrima là lúa trồng ở Châu Phi. Năm 1753, Lineaeus là người đầu tiên đã mô
tả và xếp loài lúa sativa thuộc chi Oryza. Dựa vào mày hạt và dạng hạt tác giả đã
phân chi Oryza thành bốn nhóm là sativa, granulata, coarctala, rhynchoryza và chi
Oryza gồm tất cả 19 loài [85].
Hội nghị di truyền lúa Quốc tế đã tổ chức họp tại Viện nghiên cứu lúa
Quốc tế, Philippines năm 1967 khẳng định chi Oryza có 22 loài trong đó có 20
loài lúa dại và hai loài lúa trồng.

88


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Sau này, Vaughan phát hiện thêm một loài lúa dại mới ở Papua New
Ginea là loài Oryza rhizomatis, đưa số loài của chi Oryza lên 23 loài và chia
thành bốn nhóm genome [85]. Danh sách các loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ
gen của từng loài được ghi ở Bảng 1.
Bảng 1: Phân loại chi Oryza[85].

Ngày nay, các nhà phân loại học đều thống nhất là chi Oryza có 23


Thân thấp

Chồi

-Nở bụi mạnh

-Nở bụi thấp

Nở bụi trung bình

Lá

-Lá rộng, xanh nhạt

-Lá rộng, cứng, xanh
nhạt

Lá hẹp, xanh đậm

-Hạt thon dài, dẹp

Hạt

-Hạt hầu như không
có đuôi
-Trấu ít lông và lông
ngắn
-Hạt dễ rụng


của hiện tượng mặn, độ pH của đất, hàm lượng chất hữu cơ trong đất, chế độ
thuỷ văn và nhiệt độ [2,6,8] Những ảnh hưởng của đất nhiễm mặn tới cây lúa
được thể hiện ở những nội dung sau:
1.1.2.1. Ảnh hưởng sinh lý, sinh hóa tới cây
-Gây hạn sinh lý.
Mặn ảnh hưởng đến các hoạt động sinh lý của cây


Sự trao đổi nước: mặn thường cản trở sự hấp thu nước của cây và có thể
gây nên hạn sinh lý và cây bị héo lâu dài…



Sự tổng hợp xytokinin bị ngừng vì rễ là cơ quan tổng hợp phithormon
nên cây thiếu xytokinin ảnh hưởng đến sinh trưởng của các cơ quan trên
mặt đất.



Sự hút khoáng của rễ cây bị ức chế nên thiếu chất khoáng. Do thiếu
Phospho (P) nên quá trình phosphoryl hoá bị kìm hãm và cây thiếu năng
lượng.[6,8]



Sự vận chuyển và phân bố các chất đồng hoá trong mạch libe bị kìm
hãm nên các chất hữu cơ tích luỹ trong lá ảnh hưởng đến quá trình tích
luỹ vào cơ quan dự trữ…

-Kìm hãm sinh trưởng

Dhan29 trong cùng điều kiện xử lý mặn.
Sự biểu hiện gen liên quan đến tính chống chịu mặn được thể hiện qua
quá trình truyền tín hiệu gây áp lực mặn vào tế bào, các gen mã hóa cho các
protein có chức năng chuyên hóa ở các mô được khởi động và hàng loạt quá
trình phiên mã, dịch mã xảy ra từ đó biểu hiện thành tính trạng và kết quả được
thể hiện trên hình đối với giống Pokkali còn đối với giống BRRI Dhan29 thì
do không chứa gen kháng mặn nên không biểu hiện ra kiểu hình.

1212


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B

Hình 2. Cây lúa sau 2 tuần trồng trong điều kiện nồng độ NaCl khác nhau
(cvs. BRRI Dhan29 và Pokkali)
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy: quá trình vận chuyển làm giảm bớt
nồng độ ion Na+ đưa vào tế bào sẽ làm giảm số lượng độc hại do ion Na + gây
ra cho tế bào. Con đường này giúp duy trì áp lực của việc đáp ứng thải loại
chất độc của cây trong điều kiện mặn.

1313


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
1.1.3.Tính chống chịu mặn của cây lúa
Tính chống chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi theo
các giai đoạn sinh trưởng khác nhau đối với cây lúa. Cơ chế chống chịu mặn
của cây được biết thông qua nhiều công trình nghiên cứu rất nổi tiếng [59,60].
Mặn ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng của cây lúa dưới những mức độ
thiệt hại khác nhau ở từng giai đoạn sinh trưởng phát triển khác

trong chồi
Tỉ lệ Na+/K+ trong chồi được xem như là chỉ tiêu chọn lọc giống lúa
chống chịu mặn [41,42,43].Tất cả những cơ chế này đều nhằm hạ thấp nồng độ
Na+ trong các mô chức năng, do đó làm giảm tỉ lệ Na+/K+ trong chồi (< 1).
Mỗi một giống lúa đều có một hoặc hai cơ chế nêu trên, không phải có
tất cả [90]. Phản ứng của cây trồng đối với tính chống chịu mặn vô cùng phức
tạp, đó là hiện tượng tổng hợp từ những yếu tố riêng lẻ. Do vậy, mục tiêu của
chúng ta là phối hợp tất cả những cơ chế sinh lý ấy vào trong giống lúa cải tiến
tính chống chịu mặn.
1.2.Protein vận chuyển ion liên quan đến tính chịu mặn ở thực vật
Kali (K+) có thể tạo lên đến 10 % tổng số trọng lượng khô của cây và
là cation phong phú nhất trong bào tương vì nó tương thích với cấu trúc protein
thậm chí ở nồng độ cao.Ở cấp độ tế bào, cation này được sử dụng cho các chức
năng cơ bản như: trung hòa điện của các nhóm anion, kiểm soát các tế bàophân
cực màng, điều hòa áp suất thẩm thấu và điều chỉnh sức trương của tế
bào[19]. Ở cả cấp độcơ thể, K+được tham gia vào các chức năng tích hợp . Ví
dụ, liên quan đến sự tham gia của nótrong điều chỉnh sức trương của tế bào,
K+đóng một vai trò trong hướng kích thích, cho phép thực vật điều chỉnh độ
mở các khí khổng trên bề mặt lá. Tầm quan trọng củacác chức năng này có thể
giải thích lý do tại sao vận chuyển K + qua màng tế bào đã được nghiên cứu
rộng rãi hơn các ion dinh dưỡng khác.
Để hoạt động trao đổi chất ở thực vật có hiệu quả thì nồng độ ion Kali
( K+ ) cần phải được duy trì trong khoảng từ 100-200mM ở trong tế bào chất.

1515


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Trong quá trình bị nhiễm mặn, nồng độ ion K+ trong tế bào được điều tiết
tương thích với cơ chế điều tiết áp suất thẩm thấu và khả năng tăng trưởng tế

Arabidopsis và lúa, protein HKT (High-affinity K + Transporter ) có vai trò
quan trọng trong việc kiểm soát vận chuyển tích lũy Na + [2-6] , do đó xác
định được khả năng chịu mặn của cây. Tuy nhiên, trong khi protein lúa mì
TaHKT1 vận chuyển cả Na+ và K+ thì protein AtHKT1 trong Arabdiopsis
thaliana lại vận chuyểnNa+ [7,8] và trình tự của hai protein này không liên
quan chặt chẽ với nhau. Nghiên cứu gần đây cho thấy các protein thuộc họ
protein HKT ở lúa và Arabidopsis được biểu hiện trong các tế bào xylem và
bảo vệ lá khỏi stress mặn bằng cách loại bỏ muối natri từ nhựa xylem [5,6]. Để
tránh nhầm lẫn về cấu trúc và chức năng giữa các protein HKT thuộc các loài
thực vật khác nhau, một nhóm các nhà khoa học của CSIRO Plant Industry và
các tổ chức khoa học khác đã đưa ra danh pháp quốc tế cho họ protein HKT
này ( Bảng 3)

1717


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Bảng 3 .Danh sách các protein thuộc họ protein HKT

a: Từ dự án bộ gen cây dương, athttp :/ / genome.jgi-psf.org.
b: Dịch từ trình tự nucleotide.
c: Bởi vì OsHKT1; 2 là một gen giả (gen giống với các gen khác nhưng trình
tự bazơ của chúng có những sai sót làm cho chúng không có khả năng chứa
những thông tin sinh học hữu ích) trong giống lúa Nipponbare, và stop codons
trong gen bị bất hoạt để tạo ra một chuỗi axit amin có độ dài đầy đủ.
Dựa vào độ dài trình tự gen HKT mã hóa cho các acid amin thuộc họ
ptotein HKT và các công cụ tin sinh học cần thiết: neighbor-joining, UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) and maximum
parsimony,… các nhà khoa học đã chia họ gen HKT ở thực vật thành 2 nhóm
chính đó là: gen HKT từ các loài thực vật 2 lá mầm nằm trong chính phân họ

1919


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
thông tin dự đoán cấu trúc cho các protein HKT chủ yếu được dựa trên phân
tích sử dụng các công cụ tin sinh học. Gần đây, các mô hình phân tử của các
gen vận chuyển HKT ở lúa: OsHKT1, 5 và OsHKT1, 4, dựa trên một cấu trúc
tinh thể của vi khuẩn TrkH K+vận chuyển từ vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
(VpTrkH), đã được xây dựng, và các dữ liệu cấu trúc đã được đồng nhất với dữ
liệu sinh lý. Một cấu trúc tinh thể VpTrkH đã được sử dụng ở đây, protein vận
chuyểnHKT này có cùng tính chất và chức năng như một hệ quả của sự giống
nhau giữa trình tự và cấu trúc.

Hình 5. Mô hình cấu trúc phân tử của một số gen thuộc họ gen HKT dựa
trên một cấu trúc tinh thể của vi khuẩn TrkH

2020


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
1.3.2.Chức năng của protein HKT
Chức năng quan trọng của protein HKT trong việc giúp cho thực vật có
thể tồn tại trong điều kiện đất nhiễm mặn cao đã được khẳng định trong các thí
nghiệm loại gen trực tiếp làm cây mẫn cảm với muối và thông qua biểu hiện
biến đổi gen của các gen trong họ gen HKT ở các loài thực vật khác, ví dụ:
biểu hiện của các OsHKT1; 1 gen trong gạo cho phép cây lúa phát triển tốt hơn
trong điều kiện mặn.

Hình 6: Chức năng vận chuyển của protein HKT.
Hình minh họa chức năng vận chuyển của protein trong việc bảo vệ

Garciadeblás et al. (2003) cũng cho thấy OsHKT1 có ái lực cao với vận
chuyển Na+ và OsHKT4 (hay OsHKT1;1) có ái lực thấp với vận chuyển Na +.
OsHKT8(hay OsHKT1;5) gần đây đã được biết đến là một gen mã hóa cho
protein có vai trò vận chuyển Na+ , góp phần vào khả năng chịu mặn ở thực vật
bằng cách duy trì cân bằng nồng độ K + [70] . Do đó, họ gen HKT ở lúa có vai
trò quan trọng đối với cân bằng nồng độ ion ở thực vật nhờ việc loại bỏ ion
Na+ trong điều kiện đất nhiễm mặn [13]mặc dù một số gen khác trong họ gen
HKT có vai trò mã hóa cho protein vận chuyển Na+.
Bảng 4: Danh sách thuộc họ gen HKT ở lúa
Protein

Species

Common name

2222


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
OsHKT1;1

Oryza sativa

Rice

OsHKT1;2

Oryza sativa

Rice


OsHKT2;3

Oryza sativa

Rice

OsHKT2;4

Oryza sativa

Rice

Và vị trí, kích thước các đoạn exon , intron của 9 genesOsHKT được
biểu thị trên hình sau:

Hình 7. Sơ đồ biểu thị vị trí và kích thước các đoạn exon, intron của chín
gen OsHKT ở lúa
Các thanh màu đen đại diện cho khung đọc mở, và các vị trí và độ dài của
intron được quy định bởi các vết cắt và thanh màu xám. Intron lớn đượcđưa ra khỏi
cấu trúc mô hình gen và độ dài được ghi nhận. Các đường chấm chấm nối hai mảnh

2323


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
màu đen của OsHKT2 không cho thấy sựtương đồng với gen HKT khác. Đoạn này
nằm ngoài cấu trúc mô hình, và chiều dài được ghi nhận.

1.4.Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến gen


Khóa luận tốt nghiệp- Nguyễn Thị Thu Tươi K55B
Na+ Uniport với nồng độ Na+ trong khoảng millimolar [19,20]. Ni- OsHKT2; 1
được chứng minh vận chuyển cả Na+ và K+ ở nồng độ thấp khi thay đổi điện
tích - điện áp (I- V) .Ở nồng độ Na+ cao, OsHKT2 ; 1không tiếp tục vận
chuyển K+ nữa. Một đặc tính đặc trưng của OsHKT2; 1 là có ái lực cao với K+.
Các tính chất chức năng của protein mã hóa bởi gen Ni- OsHKT2; 1 ở lúa
được so sánh với biến thể OsHKT2; 1biểu hiện trong tế bào trứng ếch và nhận
thấy không có sự khác biệt về tính thấm Na + và K+ cũng như cho thấy tính chất
chức năng chính của Ni- OsHKT2; 1 được bảo toàn trong 6 biến thể: G17/V,
G17/V D403/E, R21/K R32/K, R21/R32 K/ KD403/E, F61/ S và các biến thể
D403/ E gen OsHKT2,1 trong tế bào trứng ếch [32]
1.5.Mục tiêu và các nội dung nghiên cứu của đề tài
Dựa trên cơ sở những hiểu biết nêu trên , những tồn tại hiện có xung
quanh khả năng chịu mặn của lúa chúng tôi đề xuất nghiên cứu “ Nghiên cứu
trình tự gen OsHKT2,1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một số giống
lúa” với các mục tiêu và nội dung nghiên cứu chính sau:
1.5.1.Mục tiêu
Phát hiện sự sai khác trong trình tự nucleotide của gen OsHKT2,1 và
trong trình tự acid amin suy diễn tương ứng của protein mã hóa bởi gen
OsHKT2,1 ở một số giống lúa.
1.5.2. Nội dung nghiên cứu




Nhân bản gen OsHKT2,1 mã hóa cho protein vận chuyển ion ở một số
giống lúa
Xác định trình tự gen OsHKT 2,1ở một số giống lúa.
So sánh trình tự nucleotide của gen OsHKT2,1 và trình tự acid amin suy