MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. BA KÍCH............................................................................................... 3
1.1.1. Tên khoa học................................................................................ 3
1.1.2. Mô tả cây ...................................................................................... 3
1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến ...................................................... 4
1.1.4. Công dụng .................................................................................... 5
1.1.5. Thành phần.................................................................................. 6
1.2. NHÓM HOẠT CHẤT IRIDOID GLYCOSID ................................. 8
1.3. MONOTROPEIN................................................................................. 9
1.3.1. Đặc điểm và tính chất ................................................................. 9
1.3.2. Tác dụng dược lý của monotropein......................................... 10
1.4. CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT TỪ
DƯỢC LIỆU .............................................................................................. 11
1.4.1. Vài nét về chiết xuất dược liệu ................................................. 11
1.4.2. Vài nét về phân lập và tinh chế ................................................ 12
1.5. CHẤT CHUẨN ĐẶC TRƯNG TỪ DƯỢC LIỆU .......................... 12
1.5.1. Vài nét về chất chuẩn................................................................ 12
1.5.2. Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu ...................... 14


1.5.3. Tình hình nghiên cứu chất chuẩn kiểm nghiệm Ba kích ...... 16
1.6. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ SỬ DỤNG TRONG ĐỀ TÀI
..................................................................................................................... 17
1.6.1. Sắc ký lớp mỏng ........................................................................ 17

3.3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONOTROPEIN TINH CHẾ ĐƯỢC
..................................................................................................................... 45
3.3.1. Xác định tinh khiết bằng HPLC .............................................. 45
3.3.2. Xác định hàm ẩm bằng TGA ................................................... 47
3.4. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
MONOTROPEIN TRONG BA KÍCH.................................................... 48
3.4.1. Chuẩn bị mẫu ............................................................................ 48
3.4.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký ........................................................ 48
3.4.3. Xây dựng phương pháp phân tích monotropein trong Ba kích
............................................................................................................... 51
3.4.4. Thẩm định phương pháp phân tích monotropein trong Ba
kích ....................................................................................................... 52
3.5. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
MONOTROPEIN TRONG CHẾ PHẨM CHỨA BA KÍCH ............... 60
3.5.1. Chuẩn bị mẫu ............................................................................ 60
3.5.2. Xây dựng phương pháp phân tích monotropein trong chế
phẩm chứa Ba kích ............................................................................. 61
3.5.3. Thẩm định phương pháp phân tích monotropein trong chế
phẩm chứa Ba kích ............................................................................. 62
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 68


4.1. NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ, PHƯƠNG PHÁP CỦA ĐỀ TÀI . 68
4.1.1. Về chiết xuất, phân lập và tinh chế ......................................... 68
4.1.2. Cấu trúc monotropein tinh chế được ...................................... 68
4.1.3. Định tính, định lượng monotropein trong Ba kích và chế
phẩm chứa Ba kích bằng HPLC ........................................................ 68
4.2. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ............................................ 69
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 71
1. KẾT LUẬN ............................................................................................ 71


Kali dihydrophosphat

LC-MS

Sắc ký lỏng – khối phổ

LOD

Giới hạn phát hiện

LOQ

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

MS

Phổ khối

NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PA

Đạt tinh khiết phân tích


Quang phổ tử ngoại – khả kiến

VKNTTW

Viện Kiểm nghiệm thuốc TW

VKNT TP.HCM Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng

Nội dung

Trang

1.1

Một số chất nhóm anthraquinon trong Ba kích

6

1.2

Một số chất nhóm iridoid trong Ba kích

7

2.1


Kết quả khảo sát độ lặp lại đối với mẫu Ba kích

57

3.5

Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian với mẫu thử Ba

58

kích
3.6

Kết quả đánh giá độ đúng với mẫu thử Ba kích

59

3.7

Kết quả khảo sát LOD và LOQ

60

3.8

Kết quả khảo sát độ lặp lại với chế phẩm Hatkick

65


Rễ Ba kích (Radix Morindae) mẫu trồng tại Lục Ngạn, Bắc

5

Giang
1.3

Công thức cấu tạo của monotropein

9

1.4

Đường nystose

16

1.5

Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

20

2.1

Chế phẩm HatKick

28

2.2

3.5

Phổ 1H NMR của hợp chất monotropein

43

3.6

Phổ 13C NMR của hợp chất monotropein

43

3.7

Phổ khối phân giải cao của monotropein tinh chế được

44

3.8

Giá trị độ tinh khiết píc tại vị trí xuất hiện píc monotropein

45

3.9

SKĐ monotropein tinh chế so sánh với mẫu trắng

46



3.15

Chồng phổ UV-Vis pic monotropein của chuẩn và pic

54

monotropein trong mẫu thử Ba kích
3.16

Độ phân giải giữa pic monotropein với pic tạp trên SKĐ

54

mẫu thử Ba kích
3.17

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích

56

pic monotropein
3.18

SKĐ giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng

60

(LOQ)
3.19

dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu đã và đang gia tăng. Thị trường
dược liệu và các sản phẩm từ dược liệu vì thế rất đa dạng và phong phú về
nguồn gốc và chủng loại. Ngoài ra, các sản phẩm thực phẩm chức năng có
nguồn gốc từ dược liệu đã và đang phát triển mạnh mẽ.
Dược liệu dùng làm thuốc được cung cấp từ nguồn thu hái tự nhiên,
trồng trọt và nhập khẩu. Nguồn gốc dược liệu phức tạp, không rõ ràng, số
lượng lại lớn khó kiểm soát dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo, nhầm lẫn,
kém chất lượng vẫn được tự do lưu thông trên thị trường gây ảnh hưởng
không tốt đến độ an toàn, hiệu lực và chất lượng của các chế phẩm từ dược
liệu. Trong khi đó công tác kiểm tra, giám sát chất lượng dược liệu gặp nhiều
khó khăn do thiếu chất chuẩn với vai trò là hoạt chất hoặc chất đặc trưng cho
dược liệu. Chất chuẩn dùng cho dược liệu hiện nay thường được nhập từ
Trung Quốc với giá thành tương đối cao và nguồn hàng thường không ổn
định, ảnh hưởng đến công tác nghiên cứu và công tác kiểm tra chất lượng
thuốc thảo dược, do đó việc tạo lập chất chuẩn là cần thiết.
Dược liệu Ba kích (sau đây gọi chung là Ba kích) với những tác dụng
sinh học quý giá như làm tăng sức dẻo dai, tăng sức đề kháng, chống viêm,
tăng cường khả năng sinh dục… từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong dân
gian theo phương thức truyền thống là ngâm rượu hoặc trong các bài thuốc
đông y. Theo danh mục số đăng ký thuốc trong nước cấp SĐK từ 2010 đến
hết tháng 4/2016 hiện có 36 chế phẩm có thành phần Ba kích gồm: dạng viên
hoàn cứng, thuốc nước, viên nang cứng, cao lỏng, hoàn mềm và dược liệu,
ngoài ra còn rất nhiều thực phẩm chức năng chứa Ba kích cũng đang được
cấp phép lưu hành trên thị trường [4].
1


Thành phần hóa học chính của Ba kích là anthranoid và irridoids, trong
đó có một lượng đáng kể là monotropein (một chất thuộc nhóm iridoids). Tuy
nhiên, hiện nay chúng ta chưa thiết lập được các chất chuẩn là hoạt chất đặc

những lá đài nhỏ phát triển không đều; tràng hoa hàn liền ở phía dưới thành
ống ngắn, nhị 4, bầu hạ. Quả hình cầu, rời nhau hoặc dính liền thành khối, khi
chín màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh. Mùa hoa: tháng 5-6. Mùa quả: tháng 710 [5],[6],[8],[15].
Hiện nay Ba kích vẫn bị nhầm lẫn: do hình dáng giống với Ba kích lông
(Morinda cochinchinensis Lour), cây mặt quỷ (Morinda villosa Hook), cây
giang mủ (Zygostelma benthami Baillon var. lineare Cost) hoặc đôi khi do tên
gọi Dây ruột gà còn dùng chỉ Sam trắng - Bacopa monnieri (L.) Pennell.
(Herpestis monnieri (L.) Rothm.). Rau đắng biển, thyme - leaved gratiola
(Anh), họ Hoa mõm chó Scrophulariaceae hoặc Mộc thông – Clematis
chinensis Osbeck (C.minor L.). Họ Mao lương Ranunculaceae [16],[17].
3


Hình 1.1: Cây Ba kích (Morinda officinalis How)
mẫu trồng tại Lục Ngạn, Bắc Giang
1.1.3. Phân bố, thu hái và chế biến
Ở Việt Nam: Cây mọc hoang ở ven rừng, phân bố phổ biến ở vùng đồi
núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc: Quảng Ninh, Vĩnh
Phú, Hà Tây, Phú Thọ, Bắc Ninh, Bắc Giang. Ba kích cũng mọc nhiều ở phía
nam Trung Quốc: Quảng Đông, Quảng Tây… Thời gian thu hoạch thường
vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay.
Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae).
Chế biến: Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, phơi khô tới khi
không dính tay, đập nhẹ cho bẹt, phơi đến khô hoặc sấy nhẹ đến khô [3],[5],
[16].

4


Hình 1.2: Rễ Ba kích (Radix Morindae) mẫu trồng tại Lục Ngạn, Bắc Giang

không đều phong thấấp cước khí, gân cốt yếu mềm, lưng gốii đau
đ mỏi.
1.1.5. Thành phần
Theo các nghiên cứu
c đã được công bố, thành phầnn hóa học
h chính của Ba
kích là anthranoid
nthranoid (anthraquinon) và iridoid [17],[23],[27],[28],[31],[32]
[28],[31],[32],[33].
Ngoài ra trong Ba kích còn có một
m số hợp chất đường,
ng, hợp
h chất sterol,
hợp chấtt saponintriterpen kiểu
ki ursan, 1 vài acid amin…
Bảng
ng 1.1: Một số chấtt nhóm anthraquinon trong Ba kích
Stt
Tên khoa học
h
Công thức phân tử
C16H12O6
1 1,6-dihydroxy--2,4dimethoxyanthraquinone

2 1,6-dihydroxy--2methoxyanthraquinone

C15H10O5

3 1-hydroxy-2methoxyanthraquinone


3 Morofficinalosid

C16H24O11

4 Asperulosid

C18H22O11

5 Acid asperulosidic

C18H24O12

7

Công thức
th cấu tạo


1.2. NHÓM HOẠT CHẤT IRIDOID GLYCOSID
Iridoid là một nhóm các monoterpenoid glycosid thường được gặp nhiều
nhất trong thực vật, cho đến nay người ta đã biết đến trên 600 chất thuộc
nhóm này [3].
Về cấu tạo Iridoid là những glycosid có bộ khung của phần aglycon gồm
2 đơn vị isopren. Chúng gồm một vòng cyclopentan nối với một vòng
hydropyran. Khi tạo thành glucosid, phần đường thường gặp là glucose nối
vào vị trí số 1 trên vòng hydropyran theo dây nối acetal [3],[7].
Iridoid gồm các nhóm:
- Iridoid có aglycon gồm đủ 10 carbon: Geniposid, gardenosid,
gardosid trong quả Dành dành (Gardenia jasminoides Ellis.), loganin trong lá
Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.), monotropein trong rễ Ba kích

thù du), Valerinaceae, Gentianaceae (long đởm),
m), Caprifoliaceae (kim ngân),
Oleaceae, Ericaceae, Loganiaceae (mã tiền),
ti n), Scrophulariaceae (sinh địa,
huyền sâm)… [3].
1.3.. MONOTROPEIN
1.3.1. Đặc điểm vàà tính chất
ch
- Công thứcc phân tử:
t C16H22O11 [3].
- Khối lượng
ng phân tử:
t 390,34.
- Tên khoa học: [1S-(1a,4aa,7b,7aa)]-1-(b-D-Glucopyranosyloxy)
Glucopyranosyloxy)1,4a,7,7a-tetrahydro--7-hydroxy-7-(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran
(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran-4carboxylic acid.
ridoid [3].
- Thuộc nhóm iridoid
- Monotropein có công thức
th hóa học như sau [3]:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo củaa monotropein
9


- Tỷ trọng: 1,73 g/cm3.
- Tính chất:
+ Bột kết tinh màu trắng.
+ Nhiệt độ nóng chảy: 175oC
+ Tan tốt trong nước, ethanol và methanol.

nhau [9],[11]:
- Căn cứ vào nhiệt độ: Chiết nóng; Chiết nguội.
- Căn cứ vào chế độ làm việc: Phương pháp chiết gián đoạn; Phương
pháp chiết bán liên tục; Phương pháp chiết liên tục.
- Căn cứ vào chuyển động tương hỗ giữa 2 pha: Phương pháp chiết
ngược dòng; Phương pháp chiết xuôi dòng; Phương pháp chiết chéo
dòng.
- Căn cứ vào áp suất làm việc: Phương pháp chiết ở áp suất thường (áp
suất khí quyển); Phương pháp chiết ở áp suất giảm (áp suất chân
không); Phương pháp chiết ở áp suất cao (chế độ làm việc có áp lực).
- Căn cứ vào trạng thái làm việc của 2 pha: Phương pháp ngâm; Phương
pháp ngấm kiệt.
- Dựa vào những biện pháp kỹ thuật đặc biệt: Phương pháp dùng siêu
âm; Phương pháp khí hoá lỏng; Phương pháp tạo dòng xoáy.
Các iridoid glycosid nói chung và monotropein nói riêng thường dễ tan
trong nước, cồn loãng hoặc methanol. Thường dùng nước hoặc cồn 50% làm
dung môi chiết xuất, sử dụng kết hợp các phương pháp: cô đặc, lọc, kết tinh,
sắc ký, chiết dung môi... Ngoài ra, methanol cũng được dùng để hạn chế tạp.
11


Tùy theo mỗi loại iridoid glycosid mà có phương pháp phân lập và tinh
chế khác nhau phù hợp. Thông thường, dùng phương pháp sắc ký cột, sắc ký
chế hóa hoặc kết tinh phân đoạn trong các dung môi thích hợp.
1.4.2. Vài nét về phân lập và tinh chế
Để phân lập và tinh chế ta có thể dùng các phương pháp sau [1],[9],[11]:
- Tách phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau và
không hòa lẫn nhau.
- Tách bằng sắc ký cột.
- Tách qua cột sắc ký nhiều lần với chất hấp phụ là polyamid, cellulose,

nhiều vào chất chuẩn.
Các chất chuẩn theo Dược điển Mỹ (USPRS), Dược điển Châu Âu
(EPRS), Dược điển Quốc tế (ICRS) và chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS)
được thiết lập với sự hợp tác của nhiều phòng thí nghiệm độc lập trên thế giới
và được sản xuất tại các trung tâm như:
- Hội đồng chất đối chiếu Dược điển Mỹ (USP Reference Standard
Committee);
- Ban thư ký Kỹ thuật thuộc Hội đồng Dược điển Châu Âu (Technical
Secretariat of the European Pharmacopoeia Commission);
- Trung tâm hợp tác về các chất chuẩn hoá học của Tổ chức Y tế Thế
giới (WHO Collaborating Centre for Chemical Reference Substances).
- Chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) được thiết lập với sự đánh giá hợp
tác của các nước trong khối ASEAN theo chương trình Hợp tác kỹ thuật giữa
các nước ASEAN về lĩnh vực Dược phẩm; và Viện Kiểm Nghiệm Thuốc
Trung Ương – Bộ Y tế là thành viên chính thức đánh giá, thiết lập chất chuẩn.

13


Thông thường một chất đối chiếu được đánh giá bởi các nội dung chính
[21]:
- Định tính.
- Định lượng.
- Mất khối lượng do làm khô.
- Tạp chất liên quan.
- Độ tinh khiết.
1.5.2. Khái quát về thiết lập chất chuẩn từ dược liệu
Bất cứ quốc gia nào cũng đều cần phải thiết lập và sản xuất các chất
chuẩn đối chiếu hóa học ở mức quốc gia giúp cho công tác kiểm tra, giám sát
chất lượng thuốc và nguyên liệu làm thuốc. Khi sử dụng một chất nào đó từ

acid gallic, acid oleanolic, asiaticosid, berberin HCl, colchicin, curcumin,
damnacanthal, diacerein, diosgenin, epigallocatechin (ECGC), ginsenosidRb1, ginsenosid-Rg1, hesperidin, majonosid-R2, quercetin, rutin, syllibin
[19].
Hiện nay, nếu VKNTTW và VKNT TP.HCM không chủ động được
nguồn chất chuẩn, đặt biệt là chất chuẩn chiết từ dược liệu thì ngành Dược nói
chung và công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc nói riêng sẽ gặp nhiều
khó khăn, có thể kể đến như:
- Không kiểm nghiệm được chất lượng dược liệu một cách đầy đủ và
toàn diện.
- Không kiểm tra giám sát chất lượng các dạng bào chế có nguồn gốc từ
dược liệu đang lưu hành trên thị trường một cách đầy đủ.
- Không tiêu chuẩn hóa được các thuốc sản xuất trong nước bào chế từ
dược liệu hoặc chiết xuất từ dược liệu về mặt hàm lượng dược chất, do đó
không giúp được ngành dược bào chế ra các thuốc có chất lượng cao phục vụ
nhu cầu phòng và chữa bệnh.
15


Từ những
ng lý do trên cho thấy
th ngành Dược đứng trướcc nhiệm
nhi vụ cấp bách
phải chủ động nguồnn chất
ch chuẩn và xây dựng được Quỹ chất
ch chuẩn quốc gia
trong đó có các chấtt chuẩn
chu chiết ra từ dược liệu nhằm đáp ứng kịp thời công
tác đảm bảo chấtt lượng
lư
thuốc, phục vụ bảo vệ, chăm

ng nystose. Trong chuyên luận
lu liên quan, chỉ tiêu định
nh lượng
l
kiểm soát
hàm lượng đường
ng nystose sử
s dụng phương pháp sắcc ký lỏng
l
hiệu năng cao
dùng detector tán xạạ bay hơi [22], trong khi DĐVN chưa
ưa có chỉ
ch tiêu này và
việc sử dụng
ng detector tán xạ
x bay hơi cũng chưa phổ biến.

Hình 1.4: Đường nystose
(β-D-Fruf-(2->1)
>1)-β-D-Fruf-(2->1)-β-D-Fruf-(2<-->1)
>1)-α-D-Glup)

16


Nhìn chung, việc kiểm nghiệm Ba kích và các chế phẩm đông dược chứa
Ba kích gặp nhiều khó khăn về mặt phương tiện kỹ thuật cũng như đòi hỏi
kinh phí cao, nên ở thời điểm hiện tại không phù hợp với mặt bằng chung của
các phòng thí nghiệm tại Việt Nam. Bên cạnh đó nhu cầu thực tế cần có chất
chuẩn để kiểm nghiệm Ba kích ngày càng tăng đòi hỏi công tác nghiên cứu,