MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan

ii

Lời cảm ơn

iii

Mục lục

iv

Danh mục những chữ viết tắt

vi

Danh mục bảng

vii

Danh mục biểu đồ

viii

Danh mục hình

ix

MỞ ĐẦU

7

1.2.3. Tình hình PED trên địa bàn tỉnh Hưng Yên

7

1.3. Bệnh dịch tiêu chảy cấp tính ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED)

8

1.3.1. Phân loại

8

1.3.2. Hình thái, cấu trúc của PEDV

8

1.3.3. Đặc tính nuôi cấy của virút

9

1.3.4. Dịch tễ học

10

1.3.5. Triệu chứng lâm sàng

12


18

2.3.2. Khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh

18

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

21

3.1. Một số đặc điểm dịch tễ của bệnh

21

3.1.1. Kết quả điều tra bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn theo lứa tuổi

21

3.1.2. Tỷ lệ tử vong do bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn theo lứa tuổi

29

3.1.3. Triệu chứng lâm sàng của bệnh

32

3.1.4. Kết quả mổ khám bệnh tích đại thể

35


49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

51

v


DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

DNA

Axit deoxyribonucleic

ELISA

Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

EVD

Epidemic Viral Diarrhea

PED

Porcine Epidemic Diarrhea


3.1

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi với độ tin

21

3.2

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện

23

3.3

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện Phù Cừ với
độ tin cậy 95%CI.

24

3.4

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện

25

3.5

Kết quả điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi tại huyện

27


37

3.12 Kết quả chẩn đoán bệnh PED bằng RT-PCR theo lứa tuổi

39

3.13 Thông tin về các mẫu bệnh phẩm được sử dụng giải trình

41

3.14 Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự nucleotide của gene S của các chủng 43
3.15 Tỷ lệ (%) tương đồng về trình tự acid amin của gene S của

vii

45


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
STT

Tên biểu đồ

Trang

3.1

Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo độ tuổi



29

3.7

Tỷ lệ tử vong do mắc bệnh PED theo độ tuổi

30

3.8

Tỷ lệ tử vong do bệnh PED theo lứa tuổi của 4 huyện Tiên

32

3.9

Kết quả mổ khám bệnh tích đại thể

36

3.10 Kết quả chẩn đoán mẫu bằng kỹ thuật RT-PCR

38

3.11 Kết quả chẩn đoán mẫu bằng kỹ thuật RT-PCR của 4

38

3.12 Kết quả chẩn đoán mẫu bằng kỹ thuật RT-PCR theo lứa

phẩm khác nhau tương ứng là VNUA/PED-HY1, VNUA/PED-HY2,
VNUA/PED-HY3,VNUA/PED-HY4,

VNUA/PED-HY5,

VNUA/PED-HY6, VNUA/PED-HY7, VNUA/PED-HY8 . Sản phẩm
PCR có kích thước là 651bp
3.2

41

So sánh trình tự nucleotide của gen S giữa các chủng virus PED
trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng virus PED tham
chiếu khác. Dấu (.) biểu thị trình tự nucleotide giống với trình tự
nucleotide của chủng virus VNUA/PED-HY1

3.3

44

So sánh trình tự amino acid suy diễn của gen S giữa các chủng virus
PED trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng virus PED
tham chiếu khác. Dấu (.) biểu thị giống với trình tự amino acid của
chủng VNUA/PED- HY1, sự sai khác về amino acid của các chủng

3.3

tiếp theo được thể hiện bằng các chữ cái ký hiệu của chúng.

46

bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ Coronaviridae
gây ra. Bệnh PED xảy ra quanh năm nhưng thường phổ biến hơn vào mùa đông và
trên 90% ca bệnh xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi. Ở Châu Âu Dịch PED xuất
hiện lần đầu tiên vào năm 1971 (Wood, 1977), sau đó bệnh lây lan ra nhiều Quốc
gia khác ở Châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan.
Ở Việt Nam, bệnh PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ
đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng

1


cho ngành chăn nuôi lợn trong cả nước. Việc phòng chống bệnh tiêu chảy do
virus PED gây ra chủ yếu dựa vào sử dụng vắc xin. Trong khi các chủng virus
thực địa thường xuyên có những biến đổi phức tạp về mặt di truyền, do đó việc
nắm bắt và cập nhật được các đặc tính sinh học của các chủng virus PED đóng
vai trò quan trọng, giúp cho việc lựa chọn được vắc xin thích hợp và hiệu quả
phục vụ cho công tác tiêm phòng.
Để hạn chế dịch bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn do virus PED gây ra thì
việc nghiên cứu về dịch tễ học, và nghiên cứu được những đặc tính sinh học phân
tử của virus PED là vô cùng quan trọng và là công việc nghiên cứu hết sức cần
thiết mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn to lớn để từ đó góp phần quan trọng
trong công tác phòng, chống dịch bệnh xảy ra trên đàn lợn và định hướng chiến
lược cho việc sản xuất vắc xin phòng bệnh trong tương lai. Vì vậy, xuất phát từ
yêu cầu của thực tiễn chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh tiêu chảy thành dịch ở
lợn tại Hưng Yên, khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu tổng quát
Xác định một số đặc điểm dịch tễ, sự phân bố của các type virus PED
đang lưu hành trên địa bàn tỉnh Hưng Yên để làm cơ sở đề xuất các biện pháp



Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.1.1. Nước ngoài
Bệnh PED ở lợn lần đầu tiên được phát hiện ở Anh vào năm 1971 do virus
PED gây ra. Ban đầu virus PED được gọi là EVD (Epidemic viral diarrhea) gây
bệnh trên lợn con, đặc biệt là lợn mới sinh, có tỉ lệ gây chết lên tới 100%. Đến
năm 1976, một phân type mới của virus EVD được phát hiện trên lợn ở mọi lứa
tuổi, được gọi là virus EVD type 2 để phân biệt với virus EVD type 1 ban đầu
(Wood, 1977). Năm 1978, Debouck và Pensaert đã phát hiện virus EVD type 2 là
một dạng giống với coronavirus (Debouck and Pensaert, 1980), cũng từ thời gian
này, dịch EVD được chuyển tên thành dịch PED.
Trong khoảng thời gian từ năm 1980 tới 1990, các ổ dịch liên tục được
phát hiện và xảy ra phổ biến ở các Quốc gia Châu Âu như Bỉ, Anh, Đức, Pháp,
Hà Lan, Thụy Sỹ. Hiện nay, PED ngày càng xuất hiện phổ biến ở các Quốc gia
Châu Á, đặc biệt PED ngày càng trở nên cấp tính và nghiêm trọng hơn (Song and
Park, 2012). Ở Trung Quốc, trường hợp nhiễm PEDV đầu tiên được phát hiện
năm 1973, sau hơn hai thập kỷ sử dụng vaccine vô hoạt nhũ dầu, sự xuất hiện trở
lại của PEDV tương đối ít. Tuy nhiên đến năm 2010, bệnh đã xuất hiện trở lại và
bùng phát ngày càng trầm trọng ở các Tỉnh có sự phát triển ngành chăn nuôi lợn.
Từ tháng 2 năm 2010 đến tháng 11 năm 2011, tỷ lệ lợn chết từ 90 tới 100%
(tương ứng 50.000 con), chủ yếu là lợn dưới 7 ngày tuổi (Chen et al., 2012). Ở
Nhật, dịch PED xuất hiện lần đầu tiên năm 1993, gây chết 14.000 con, tỉ lệ chết
từ 30 tới 100% lợn con, dịch PED năm 1996 gây chết 39.509 con. Ở Hàn Quốc,
dịch PED xuất hiện đầu tiên năm 1992, sau đó đến năm 2007-2008, dịch liên tiếp
xuất hiện ở các Quốc gia Ðông Nam Á như Thái Lan, Philippines và Việt Nam.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, PEDV là một virus có vỏ ngoài, vật chất di
truyền là RNA dạng sợi dương có kích thước khoảng 28kb. Hệ gen bao gồm ít

phương pháp RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) được
phát triển để phát hiện virus cả trong phòng thí nghiệm và từ thực địa (Tobler and
Ackermann, 1995; Tobler and Ackermann, 1996). Để khẳng định sự có mặt của

5


PEDV trong mẫu bệnh phẩm, mồi đặc hiệu được thiết kết dựa trên trình tự gen
M. Trong những năm gần đây, dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản, đã có rất nhiều
những cải tiến để cho những ứng dụng hiệu quả hơn, như việc sử dụng multiplexRT-PCR để phát hiện PEDV trong sự có mặt của nhiều virus khác nhau, là một kỹ
thuật thường được sử dụng cho chẩn đoán nhanh, độ nhạy và hiệu quả kinh tế cao trên
các đối tượng với các virus gây ra viêm ruột-dạ dày cấp tính ở lợn (Song et al., 2006).
RT loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) cũng là một kỹ thuật hữu
dụng được phát triển dựa trên kỹ thuật RT-PCR cơ bản. Trong kỹ thuật này, 4-6 mồi
được sử dụng để nhận biết 6-8 vùng DNA đích, điều này tạo ra tính đặc hiệu cao hơn
so với kỹ thuật gel-based RT-PCR hay ELISA bởi vì nó tạo ra số lượng lớn hơn các
đoạn DNA (Ren and Li, 2011). Các kit phân tích Immunochromatography cũng được
sử dụng phổ biến ở các trại chăn nuôi để phát hiện PEDV trên cơ sở protein S với độ
nhạy 92% và độ đặc hiệu 98%. Kỹ thuật này có độ chính xác kém hơn RT-PCR tuy
nhiên cho phép chẩn đoán nhanh trong vòng 10 phút (Song and Park, 2012).
1.1.2. Trong nước
Hiện nay ở Việt Nam, Nguyễn Đình Quát và cộng sự đã sử dụng phương
pháp nested-RT-PCR để phát hiện PEDV (Nguyen Dinh Quat et al., 2011) và
Nguyễn Tất Toàn và cộng sự đã nghiên cứu đặc tính di truyền của PEDV phân
lập được từ các Tỉnh Miền Nam Việt Nam (Nguyễn Tất Toàn et al., 2012). Ngoài ra
chưa có nghiên cứu nào về mức độ quy mô và chuyên sâu để đánh giá một cách có
hệ thống về đăc điểm dịch tễ và sự phân bố của các chủng PEDV đang lưu hành ở
Việt Nam hiện nay. Các kết quả nghiên của đề tài này sẽ là cơ sở khoa học quan
trọng trong việc khoanh vùng dịch, định hướng chọn chủng sản xuất vaccine, cũng
như góp phần đánh giá chất lượng vaccine nhập khẩu và sản xuất trong nước để từ

thống kê của phòng xét nghiệm nhanh công ty C.P Việt Nam trong 5 tháng đầu
năm 2010 cả nước có 31 trại bị nhiễm PED và tỉnh có nhiều ca bệnh nhất là
Đồng Nai với 15 ca bệnh. Các trại bị nhiễm bệnh này chủ yếu tập trung ở miền
Nam (Đồng Nai, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Phước, Củ Chi), ở các
tỉnh ở miền Bắc thì phòng xét nghiệm nhanh chỉ mới ghi nhận có một trại bị
nhiễm bệnh này thuộc tỉnh Thái Nguyên.
Nhìn chung, bệnh chủ yếu xảy ra ở khu vực Nam Bộ với những trận dịch
lớn, tuy nhiên ở khu vực phía Bắc cũng đã xuất hiện rải rác ở 1 số trại tại các tỉnh
Thái Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang…
1.2.3. Tình hình PED trên địa bàn tỉnh Hưng Yên
Trên địa bàn tỉnh Hưng Yên trong những năm gần đây bệnh vẫn xảy ra rải
rác, tập trung chủ yếu tại những địa phương có mật độ chăn nuôi lợn cao. Bệnh

7


xảy ra quanh năm không theo mùa nhất định. Bệnh tiến triển rất nhanh, trên toàn
đàn lợn và gây chết gần như 100% lợn con theo mẹ. Tỷ lệ tử vong dao động từ
65 – 91%. Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu cụ thể nào về dặc điểm dịch tễ và
đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh trên địa bàn do vậy việc áp dụng các
biện pháp phòng chống bệnh của người chăn nuôi còn gặp nhiều khó khăn gây ra
tổn thất về kinh tế cũng như cơ cấu đàn.
1.3. Bệnh dịch tiêu chảy cấp tính ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED)
1.3.1. Phân loại
Năm 1978, Pensaert và Deouck đã phân lập được virus gây dịch tiêu chảy
ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea Virus – PEDV), mẫu được lấy từ ổ dịch xảy ra
ở Bỉ và Anh (1976). Virus gây dịch tiêu chảy (PEDV) là một thành viên họ
Coronaviridae, phân họ Coronavirinae, giống Coronavirus. PEDV được xếp vào
nhóm 1 giống Coronavirus, cùng với TGEV, coronavirus gây bệnh cho mèo
(feline coronavirus), coronavirus gây bệnh cho chó (canice coronavirus) và

nhân). Hiệu giá virus đạt tối đa sau khi nuôi cấy 15 giờ. Ngoài ra, virus PED đã
được nhân lên thành công trên các tế bào thận lợn và bàng quang lợn ở Nhật Bản
(Shibata và cs, 2000). Chủng virus phân lập tại Nhật Bản (P – 5V) đã được sử

9


dụng làm chủng virus vaccine và được nuôi cấy trên các dòng tế bào lợn KSEK6
và IB – RS2 (Kadoi K và cs,2002).
- Sức đề kháng: PEDV ổn định giữa pH 5 – 9 tại 40C và giữa pH 6.5 – 7.5
tại 370C, bất hoạt khi pH < 4 và pH > 9. Trong môi trường nuôi cấy thích nghi,
virus bị mất khả năng lây nhiễm ở nhiệt độ 600C/30’, nhưng ổn định ở 500C.
Virus mẫn cảm với ether, chloroform và không gây ngưng kết hồng cầu
của nhiều loài. PEDV bị bất hoạt bởi hầu hết các chất khử trùng bao gồm cả:
cresol, natri hydroxyt 2% (NaOH 2%), formol 1%, natri cacbonate (4% muối
khan hoặc 10% dạng tinh thể với 0,1% chất tẩy rửa), chất tẩy rửa có ion và không
ion, iodophor mạnh (1%) trong acid phosphoric và dung môi lipid như
chloroform (Callebaut P và DeBouck, 1981).
1.3.4. Dịch tễ học
1.3.4.1. Động vật cảm nhiễm
Bệnh xảy ra ở loài lợn. Lợn có thể mắc ở mọi lứa tuổi. Trong nhiều ổ dịch,
tỷ lệ nhiễm có thể lên đến 100%, tỷ lệ chết trung bình của lợn con là 50% nhưng
cũng có thể rất cao 100%.
- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 0 – 5 ngày tuổi: tỷ lệ chết 100%
- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi 6 – 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 50%
- Nếu lợn con mắc bệnh ở độ tuổi lớn hơn 7 ngày tuổi: tỷ lệ chết khoảng 30%
1.3.4.2.Phương thức truyền lây:
Phương thức truyền lây của PEDV tương tự với TGEV, nhưng PEDV có
xu hướng tồn tại dễ dàng hơn trên cơ thể đã bị nhiễm bệnh. Đường truyền phân
miệng có thể là phương thức chủ yếu để virus truyền sang vật chủ khác. PED cấp

Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn chưa được
nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể quan sát
thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự nhiên hoặc
được gây nhiễm. Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có làm cho bệnh
nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ. Hiện vẫn chưa có cơ chế thích hợp nào
được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo việc hoại tử cơ lưng
cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành. (Nguyễn Văn Điệp và
Nguyễn Thị Lan, 2012).
Vị trí nhân lên của virus được xác định thông qua kĩ thuật miễn dịch
huỳnh quang và kính hiển vi điện tử. Cho tới nay, chưa có công bố nào cho thấy
sự nhân lên của virus ở các tế bào bên ngoài đường tiêu hóa. Shibata và cộng sự
(2000) đã chỉ ra rằng ở lợn sạch bệnh (SPF - specific pathogen free) khi được
uống virus PED phân lập từ thực địa ở độ tuổi từ 2 ngày đến 12 tuần, sức đề

11


kháng tăng dần theo tuổi và lợn chỉ bị chết khi trong giai đoạn từ 2 – 7 ngày tuổi
(Shibata và cs, 2000). Cơ chế sinh bệnh của PEDV ở lợn giai đoạn lớn hơn vẫn
chưa được nghiên cứu chi tiết, nhưng bằng kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang có
thể quan sát thấy virus có mặt trong tế bào biểu mô kết tràng của lợn mắc bệnh tự
nhiên hoặc được gây nhiễm. Ý nghĩa của việc virus xâm nhiễm ở kết tràng có
làm cho bệnh nặng hơn hay không vẫn chưa được rõ. Hiện vẫn chưa có cơ chế
thích hợp nào được đưa ra để lý giải hiện tượng lợn chết đột ngột kèm theo hoại
tử cơ lưng cấp tính quan sát thấy ở lợn vỗ béo và lợn trưởng thành.
Biểu hiện và tiến triển lâm sàng của lợn sạch bệnh bị gây nhiễm chủng
PEDV đã thích nghi trên môi trường nuôi cấy tế bào (ca – PEDV) nhẹ hơn nhiều
so với lợn nhiễm chủng thể hoang dại (wt – PEDV), độc lực của chủng ca –
PEDV yếu hơn nhiều, tốc độ sinh sản của virus chậm hơn và sự biến đổi về mặt
vi thể ở các cơ quan của lợn nhiễm virus cũng kém rõ ràng hơn.

thường từ 1 -3%, lợn chết nhanh thường ở giai đoạn mới bắt đầu tiêu chảy hoặc
trước khi có biểu hiện tiêu chảy.Tỷ lệ chết cao nhất được thấy ở những trại lợn có
giống mẫn cảm và chịu nhiều stress.
1.3.6. Bệnh tích
Bệnh tích đại thể và vi thể của PED tương tự như bệnh TGE. Bệnh tích
thường tập trung ở đường tiêu hóa, đặc biệt là ở ruột non. Dạ dày thường trống
rỗng do lợn nôn và ống dưỡng chấp không chứa nhiều dịch dưỡng do sự kém hấp
thu ở ruột. Ruột non màu nhợt nhạt, chứa đầy dịch, căng phồng, thành ruột mỏng
tới mức có thể nhìn thấy được bên trong do sự teo lại của tầng niêm mạc.Chất
chứa trong ruột non lợn cợn. Hạch ruột xung huyết, xuất huyết.

Hình 1.2: Bệnh tích ruột căng phồng ở lợn con
Nguồn: Daesub Song và Bongkyun Park, 2012(14)

13


Về mặt vi thể, có sự hình thành không bào to, rõ trong bào tương tế bào
biểu mô và sự bong tróc của tế bào này làm cho lông nhung ngắn và dồn lại, hòa
lẫn vào nhau rõ rệt. Tuy nhiên, các biểu hiện này không rõ bằng TGE. Ở kết
tràng chưa có bệnh tích vi thể nào được báo cáo. Điều thú vị là các nghiên cứu
siêu vi thể đã cho thấy sự hiện diện rõ rệt của các hạt virus bên trong bào tương
tế bào và sự thay đổi ở các tế bào biểu mô ruột non và kết tràng. Những thay đổi
cấu trúc siêu vi thể được khởi đầu đặc trưng bằng sự mất đi của các bào quan, vi
nhung, lưới tận và phần nhô ra của bào tương tế bào hấp thu vào trong xoang
ruột. Sau đó, các tế bào trở nên phẳng, dẹt, các mối liên kết chặt chẽ bị mất đi và
các tế bào rơi vào trong lòng ống ruột.
1.3.7. Các phương pháp chẩn đoán PEDV
1.3.7.1. Chẩn đoán lâm sàng
Dựa vào triệu chứng lâm sàng để chẩn đoán. Các triệu chứng điển hình như:

tỷ lệ chết cao 50 - 100%. Triệu chứng điển hình là phân nhão như hồ sau phân
lẫn nhiều nước màu vàng trắng hoặc xám, chứa nhiều chất vón. Do virus cư trú,
hủy hoại làm thoái hóa lớp nhung mao ruột làm khả năng tiêu hóa và hấp thu
kém nên khi lợn khỏi bệnh nếu được nuôi tiếp lợn sẽ còi cọc và chậm lớn.
* Bệnh do E.coli (Colibaccillosis):
Sau khi xâm nhập vào hệ thống tiêu hóa, vi khuẩn bám dính vào tế bào
nhung mao ruột non bằng các yếu tố bám dính. Tại đây vi khuẩn phát triển nhân
lên, phá hủy tế bào tổ chức, gây viêm và sản sinh độc tố Toxigenic hoặc
Verotoxin, gây tụ huyết, xuất huyết, hoặc vi khuẩn cư trú tại ruột gây chứng viêm
ruột cấp. Nếu con vật vượt qua giai đoạn này thường để lại bệnh tích ở hạch
màng treo ruột, gan, lách và túi mật. Với những gia súc trưởng thành khỏe mạnh
có thể không có triệu chứng lâm sàng nhưng có bệnh tích ở phủ tạng, vùng bụng.
* Bệnh phó thương hàn (Salmonellosis):
Nguyên nhân bệnh do vi khuẩn Salmonella gây ra. Bệnh thường xảy ra ở lợn sau
cai sữa đến 4 tháng tuổi, lợn lớn ít mắc hơn. Con vật có triệu chứng bỏ ăn, sốt
cao 40.5 -41.6oC, ho khan khò khè, lúc đầu đi táo, sau khi nhiệt độ hạ xuống, con
vật ỉa chảy nặng, phân lỏng sống màu vàng bột như cám, da xuất hiện những đám
tụ máu, gan có những điểm hoại tử hoặc áp se, lợn chết ở những ngày đầu lách
sưng to, tụ máu. Nếu lợn mắc ở thể mãn tính lách dai như cao su. Niêm mạc ruột

15


già viêm loét, vết loét lan tràn bờ nông. Do ỉa chảy nhiều, con vật dễ dẫn đến lòi
dom và giai đoạn sau liệt cơ vòng hậu môn. Da nhợt nhạt lông xù, bụng hóp lại
hõm sâu xuống.
* Bệnh hồng lỵ do Treponema:
Bệnh do xoắn khuẩn Treponema hyodysenteria gây nên thường kết hợp với phẩy
khuẩn Vibro và các nhóm vi khuẩn đường ruột khác. Bệnh thường xảy ra ở lợn
sau cai sữa từ 3-6 tháng tuổi, dấu hiệu lâm sàng chủ yếu là tiêu chảy, phân có lẫn


Trình tự mồi (5’ – 3’)

P1

TTCTGAGTCACGAACAGCCA

P2

CATATGCAGCCTGCTCTGAA

Kích thước (bp)

Tác giả

651

Kim và cs,
2001[20]

2.3. Địa điểm nghiên cứu.
- Địa điểm nghiên cứu: các huyện có cơ cấu đàn lợn lớn trên địa bàn tỉnh
Hưng Yên. Cụ thể, đề tài được tiến hành trên địa bàn 4 huyện: Tiên Lữ, Phù Cừ,

17


Ân Thi và Văn Giang. Nội dung nghiên cứu được thực hiện tại địa bàn 4 huyện
nêu trên.
2.4. Phương pháp nghiên cứu.

cDNA được tổng hợp từ RNA đã được tách chiết nhờ enzyme phiên mã
ngược (reverse transcriptase). Để tạo cDNA chúng tôi dùng bộ Kit
SuperScriptTM (Invitrogen) sử dụng mồi Oligo dT với trình tự 5’CTGTGAATGCTGCGACTACGATTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’. Thành phần
phản ứng và điều kiện tổng hợp cDNA như sau: 5µl RNA tinh sạch, 4.5µl nước
đã loại RNase, 3µl dNTPs (2.5 mM mỗi loại), 2µl mồi oligo dT (200 pM/µl), 1µl
SuperscriptTM II RNase H-reverse transcriptase (200 U/µl), 0.5µl RNase
inhibitor (10 U/µl) và 4µl 5x first strand buffer. Phản ứng tổng hợp cDNA được
thực hiện ở 37°C trong 60 phút và sau đó 94°C trong vòng 5 phút.
d) Phương pháp PCR và giải trình tự gen (sequencing)
cDNA được tổng hợp ở trên được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng
PCR sử dụng Kit AccuPower PCR PreMix (BIONEER). Kit này chứa DNA taqpolymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình khuếch đại DNA. Phản ứng
PCR được thực hiện theo chương trình chuẩn như sau: 30 chu kỳ (94°C - 1 phút,
54°C - 1 phút, 72°C - 1 phút) và cuối cùng 8 phút ở 72°C. Sản phẩm PCR sẽ
được kiểm tra trên gel agarose và được gửi sang công ty Macrogen của Hàn
Quốc để tiến hành giải trình tự gen. Trình tự DNA thu được sẽ được phân tích
bằng phần mềm BioEdit và DNAstar. Hơn thế nữa, chúng tôi cũng tiến hành so
sánh với trình tự genome của virus PED trong ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế
bằng phần mềm MegAlign (DNASTAR, Madison, WI).
e) Phương pháp one-step RT-PCR để chẩn đoán và định type PEDV
RNA sau khi tổng số được tách chiết từ các mẫu bệnh phẩm nghi nhiễm
PEDV sẽ được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng RT-PCR sử dụng kit
Accupower RT-PCR premix (BIONEER, Hàn Quốc). Kit này chứa enzyme
phiên mã ngược, taq-polymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình tạo
cDNA và khuếch đại DNA. Sau đó bổ sung cặp primer đặc hiệu được thiết kế
trên vùng bảo thủ của gen cấu trúc gai (S) của PEDV. Phản ứng one-step RTPCR được thực hiện theo chương trình như sau: 42o C trong 30 phút để tạo
cDNA, tiếp đến là 5 chu kỳ (94o C trong 30 giây, 55o C trong 30 giây, 72o C trong

19