TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
----------------

NGUYỄN THỊ THẮM

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN

MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG
CHUYỂN HÓA BÃ MÍA THÀNH MÙN HỮU CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp em đã nhận đƣợc sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của Nhà
trƣờng, Thầy cô và các bạn.
Trƣớc hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo,
PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã định hƣớng ý tƣởng nghiên cứu, tận tình
hƣớng dẫn, sửa luận văn để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo trong Khoa Sinh-KTNN,
Trƣờng ĐH Sƣ Phạm Hà Nội 2 đã giảng dạy, tạo điều kiện cho chúng em
trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Vi sinh vật, Khoa
Sinh-KTNN, Trƣờng ĐH Sƣ Phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn,

3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu..................................................... 2
3.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................... 2
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 3
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................. 3
4.1. Ý nghĩa khoa học ................................................................................. 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn.................................................................................. 3
5. Nhiệm vụ nghiên cứu .............................................................................. 3
6. Tính mới................................................................................................. 4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 5
1.1. Đặc điểm và phân loại nấm mốc ........................................................... 5
1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes) ......................................................... 5
1.1.2. Bào tử trần (conidia) ......................................................................... 7
1.2. Sơ lƣợc về chi Penicillium .................................................................... 8
1.3. Sơ lƣợc về chi Aspergillus .................................................................... 9
1.3.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới ..................... 9
1.3.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus ..................................................... 9
1.4. Cellulose và Cellulase .........................................................................11
1.4.1. Cellulose ..........................................................................................11
1.4.2. Cellulase ..........................................................................................12
1.5. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới và Việt Nam ..................................13
1.5.1. Trên Thế giới ...................................................................................13
1.5.2. Ở Việt Nam......................................................................................14


1.6. Định hƣớng ứng dụng..........................................................................15
1.6.1. Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ giàu cellulose .........................15
1.6.2. Ứng dụng trong ủ phân hữu cơ bón cho cây trồng..............................15
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............17
2.1. Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu .......................................................17
2.1.1. Vi sinh vật .......................................................................................17

PHỤ LỤC ..........................................................................................................................45


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả các chủng nấm mốc thu đƣợc sau 5 lần phân lập .............22
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc đã phân lập ..............24
Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trƣờng chứa 1% CMC ....27
Bảng 3.4. Đánh giá hoạt tính cellulase của các chủng nấm mốc đã phân
lập .............................................................................................27
Bảng 3.5. Kết quả thử hoạt tính cellulase của 2 chủng Penicillium M4,
Penicillium M6 với các tỷ lệ bột đậu tƣơng khác nhau...................33
Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm trồng rau mầm củ cải xanh trên bã mía ủ
và đất đối chứng .........................................................................36


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các dạng Hyphomycetes............................................................... 6
Hình 1.2. Giá sinh bào tử Coelomycetes ....................................................... 6
Hình 1.3. Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt ...................................... 7
Hình 1.4. Một số hình dạng bào tử trần ........................................................ 8
Hình 1.5. Chi Penicillium (Các thành phần của chổi )................................... 9
Hình 1.6. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a. 1 lớp b. 2 lớp - c. phiến - d. tia, e. tể .....................................................10
Hình 1.7. Cấu trúc lập thể của cellulose ......................................................11
Hình 1.8. Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase .................13
Hình 3.1. Khuẩn lạc một số chủng nấm mốc trên môi trƣờng Czapeckdox ............................................................................................23
Hình 3.2. Hoạt tính cellulase của hai chủng nấm mốc đã tuyển chọn............28
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Penicillium M4 trên KHV
(x1000) ......................................................................................30
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Penicillium M4 trên KHV
(x1000) .....................................................................................32

6. VK

: Vi khuẩn

7. VSV

: Vi sinh vật

8. XK

: Xạ khuẩn


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Hiện nay, vấn đề môi trƣờng đang đƣợc hầu hết các quốc gia trên thế
giới đặc biệt quan tâm. Ô nhiễm môi trƣờng đang ngày càng trở lên trầm
trọng, kéo theo thiên tai biến động ảnh hƣởng tới môi trƣờng sinh thái. Một
trong những nguồn thải gây ô nhiễm mỗi trƣờng là các chất thải, phế phẩm
khó đƣợc phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên, bã mía là một trong số đó. Mía
là loại cây lấy đƣờng quan trọng của ngành công nghiệp đƣờng với tổng diện
tích hàng triệu hec-ta và sản lƣợng mía thu hoạch mỗi năm lên tới 1,83 tỷ tấn.
Lƣợng bã mía thải ra ƣớc tính chiếm 25-30% lƣợng mía đem ép, nguồn bã
mía nếu không đƣợc xử lý sẽ đem lại một nguy cơ lớn về lƣợng phế phẩm gây
ô nhiễm môi trƣờng.
Trên thế giới, nhiều công trình khoa học đã đề cập đến công nghệ xử lý
mùn cƣa, trấu, rơm và một số nguyên liệu khác thành phân hữu cơ. Ở Việt
Nam trong những năm gần đây, vấn đề về xử lý bã mía, rơm rạ sau thu hoạch
đã nhận đƣợc nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu khoa học. Trong đó
có nhiều công trình khoa học nghiên cứu và ứng dụng công nghệ xử lý phế

2. Mục đích nghiên cứu
Tuyển chọn đƣợc các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme phân
giải cellulose từ khối ủ bã mía; xác định hàm lƣợng bột đậu tƣơng bổ sung
thích hợp vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm nâng cao hoạt tính enzyme cellulase
của chủng nấm mốc tuyển chọn và ứng dụng chuyển hóa bã mía thành mùn
hữu cơ, thử nghiệm trồng rau sạch.
3. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose trong khối ủ bã
mía thu đƣợc tại Phƣờng Xuân Hòa, Thị xã Phúc Yên, Tỉnh Vĩnh Phúc.

2


3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phƣơng pháp ủ và lấy mẫu
3.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc
3.2.3. Phƣơng pháp nuôi cấy và bảo quản chủng giống
3.2.4. Phƣơng pháp quan sát hình thái nấm mốc
3.2.5. Phƣơng pháp xác định hoạt tính cellulase của nấm mốc
3.2.6. Phƣơng pháp thống kê và xử lý kết quả
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Tìm hiểu sự đa dạng của các chủng nấm mốc có khả năng phân giải
cellulose trên các phế phụ phẩm nông nghiệp, qua đó tuyển chọn và định loại
sơ bộ một số chủng nấm mốc có hoạt tính enzyme cellulase tốt từ bã mía.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tìm ra hƣớng đi mới tốt hơn cho phế phẩm bã mía, đồng thời ứng dụng
trong quá trình phân giải bã mía và rác thải có cấu trúc cellulose thành mùn
hữu cơ, khắc phục ô nhiễm môi trƣờng.

Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, một số là
dạng sinh sản vô tính của các nhóm nấm túi (Ascomycetes) hoặc nhóm nấm
đảm (Basidiomycetes). Deuteromycetes bao gồm khoảng 2400 chi trong đó có
1700 chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes và 700 chi thuộc nhóm
Ceolomycetes. Theo E. Kiffer, M. Morelet (2000), trong số các chi nấm thuộc
tổ chi Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành
phụ Deuteromycetes) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223
loài, tiếp theo là chi Aspergillus có khoảng 185 loài.
1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes)
Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính của nấm túi hoặc nấm đảm. Theo hệ
thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes
(1953). Lớp nấm bất toàn đƣợc chia thành 3 nhóm: Nhóm Hyphomycetes:
Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên
các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá). Nhóm
Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở
trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata. Nhóm Agonomycetes:
Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần. Ở đây giới thiệu 2 khoá phân
loại đến chi của lớp nấm bất toàn.
1.1.1.1. Hyphomycetes (moniliaales- nấm bông, 1700 chi, 11000 loài)
Các dạng hệ sợi nấm mang các bào tử trên sợi riêng rẽ hoặc trên cụm
sợi nấm (nhƣ các đệm nấm, các bó giá), nhƣng không ở trong các
conidiomata (fruit body) riêng biệt.

5


Hình 1.1. Các dạng Hyphomycetes

1.1.1.2. Coelomycetes (nấm xoang, 700 chi, 9000 spp) riêng rẽ
Bào tử trần sinh ra trong các túi giá, đĩa giá, túi giá dạng cốc, đệm giá.

Hình 1.3. Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt

1.1.2. Bào tử trần (conidia)
Có nhiều hình dạng khác nhau: Hình dạng đơn giản. Ví dụ: Cầu, gần
cầu, elip, hình quả thận (H.1.4a). Bào tử sợi, tỷ lệ chiều dài và rộng của bào tử
= 15:1(H1.4b). Bào tử vách lƣới, bào tử đƣợc chia nhỏ ra bởi các vách ngăn
chéo nhau (H1.4c). Bào tử xoắn ốc trục bào tử uốn cong hơn 1800 (H1.4d ).
Bào tử dạng chữ thập, bào tử có nhiều trục, có mấu, có lông mềm chiếm 1/4
chiều dài của bào tử (H1.4e).

7


Hình 1.4. Một số hình dạng bào tử trần

1.2. Sơ lƣợc về chi Penicillium
Theo E. Kiffer, M. Morelet (2000), trong số các chi nấm thuộc tổ chi
Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ
Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài,
chúng phân bố khắp nơi trên trái đất, cƣ trú ở trên rất nhiều các ổ sinh thái.
Theo Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2001) [5] chi Penicillium đặc
trƣng bởi các đặc điểm:
Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi
màu sẫm. Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi có
màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng. Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc
khác nhau, môi trƣờng thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt
các sắc tố hòa tan tƣơng ứng.
Bộ máy mang bào tử trần hoặc chỉ gồm giá bào tử trần với một vòng
thể bình ở đỉnh giá, hoặc gồm giá bào tử trần với hai đến nhiều cuống thể bình
ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có các thể bình.


9


Các đặc điểm cơ quan sinh bào tử trần: cơ quan sinh bào tử trần phát triển
tử một tế bào đặc biệt gọi là tế bào chân có đƣờng kính lớn hơn, màng dày hơn
các tế bào lân cận của sợi nấm. Từ tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần.
Giá bào tử trần có thể có vách ngăn, bề mặt nhẵn hoặc không nhẵn,
trong suốt hoặc có màu, dài hay ngắn tùy thuộc vào loài. Phần ngọn của giá
bào tử phình rộng tạo thành bọng đỉnh giá (versicle). Bọng đỉnh giá có thể có
nhiều hình thái khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trƣng để phân loại
Aspergillus với các loại nấm Hyphomycetes khác, đặc biệt với các chi
Penicillium. Bọng đỉnh giá có thể có hình cầu, hình bán cầu, hình chùy, hình
quả bầu, hình bàn chang.
Từ bọng đỉnh giá sinh ra các tế bào sinh bào tử trần gọi là thể bình
(phialide). Nếu các thể bình sinh ra trực tiếp từ bọng đỉnh giá thì gọi là dạng
đơn tầng (uniseriate). Nếu các thể bình đƣợc sinh ra qua một lớp tế bào gốc
xuất phát từ bọng đỉnh giá (lớp cuống thể bình, metulae) thì gọi là dạng lƣỡng
tầng (biseriate). Philade hoặc metulae mọc trên bọng đỉnh giá c ng là đặc
điểm đặc trƣng để phân biệt Aspergillus với các chi có quan hệ gần g i với
nó. Từ thể bình sinh ra các bào tử trần (conidia). Bào tử trần không có vách
ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thƣớc, màu sắc ở các loài khác nhau.

Hình 1.6. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a. 1 lớp b. 2 lớp - c. phiến - d. tia, e. tể

10


1.4. Cellulose và Cellulase
1.4.1. Cellulose

cứu về hệ enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei, hệ enzyme thủy
phân gồm 3 loại hoạt tính enzyme (Hình 1.8).
Endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase
Enzyme endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là
enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong phân tử cellulose
bởi tác dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự
do và các chuỗi oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy
phân cellulose tinh thể hiệu quả nhƣng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực
vô định hình tƣơng đối dễ tiếp cận.
Exoglucanase
Enzyme

ngoại

bào

exoglucanase

gồm

cả

1,4-beta-D-glucan

glucanohydrolase, giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và 1,4beta-D-glucan cellobiohydrolase, giải phóng D-cellobiose. Tỷ lệ thủy phân
của enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu
chuỗi cellulose.
β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase
β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase giải phóng phân tử Dglucose từ đƣờng cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác [15].


1.5.2. Ở Việt Nam
Đến nay, c ng đã có nhiều công trình nghiên cứu về nấm mốc sinh
cellulase, tối ƣu điều kiện môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc và ứng dụng nấm
mốc sinh cellulase trong thực tiễn [3], [8], [9], [16]. Các nghiên cứu gần đây
của Nguyễn Thị Dung (2013), nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm
mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để
thu cellulase phục vụ chăn nuôi. Nghiên cứu của Kiều Ngọc Bích, 2012,
“Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái của một số chủng
nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao”, kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn
đƣợc 25 chủng nấm mốc, trong đó 3 chủng M4V, M251, M151 có hoạt tính
cellulase mạnh nhất. Luận văn thạc sĩ của Khƣu Phƣơng Yến Anh (2007),
“Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của một số chủng nấm sợi phân
lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ” đã phân lập đƣợc 312 chủng nấm sợi khác
nhau từ RNM Cần Giờ. Trong đó có 114 chủng phân lập từ đất, 96 chủng
phân lập từ lá, 102 chủng phân lập từ thân, cành và tuyển chọn ba chủng có
hoạt độ cellulase cao nhất là: chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3 (55,01 IU/g)
và chủng Đ2b (53,10 IU/g), đồng thời xác định đƣợc điều kiện môi trƣờng
thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của ba chủng nấm sợi
[1]. Hay nghiên cứu của Trịnh Đình Khá, Nguyễn Quyền Thi, Nguyễn Sỹ Lê
Thanh (2007), “Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hƣởng của các yếu tố môi
trƣờng lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Penicillium sp.DTQHK1” [7]...
Ngoài ra có nhiều các nghiên cứu khác ở trong và ngoài nƣớc về vấn đề
phân giải và ứng dụng cellulose, phế phẩm giàu cellulose của nấm mốc c ng
nhƣ các loài vi sinh vật [2], [6], [12], [19], [20]. Tuy nhiên chƣa có công trình

14


nghiên cứu đầy đủ về nấm mốc sinh enzyme cellulase đặc biệt là từ nguồn bã
mía trong quá trình phân giải tạo mùn.

hủy hoặc chất đống, vừa mất thời gian cải tạo đất. Vì vậy, ứng dụng bón phân
hữu cơ có ý nghĩa rất lớn trong nông nghiệp [4]. Với sản lƣợng phế phụ phẩm
bã thải hàng năm thải ra môi trƣờng nếu nhƣ đƣợc tận dụng, xử lý ủ mủn rồi
đem bón cho cây trồng sẽ đem lại nhiều lợi ích đáng kể. Vì vậy hƣớng nghiên
cứu này có ý nghĩa thực tiễn và là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng trong sản
xuất phân hữu cơ vi sinh, đồng thời góp phần xử lý nguồn phế thải bã mía,
giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng.

16