ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
------------------

VŨ MẠNH TUYỀN
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH
CÂY DÂU TÂY (Fragaria vesca L.) TỪ MẢNH LÁ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính qui
: Công nghệ Sinh học
: CNSH - CNTP
: 2011 – 2015

Thái Nguyên, năm 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
------------------

VŨ MẠNH TUYỀN
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH

Qua 6 tháng thực tập tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật,
Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên. Để đạt được kết quả như
ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn KS. Lã Văn Hiền đã giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Bằng Phương và
ThS. Bùi Đình Lãm đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian
thực hiện đề tài.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ủng hộ
động viên để em có tự tin trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Do thời
gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất
mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em
được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn !
Thái Nguyên, ngày 28 tháng 5 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Vũ Mạnh Tuyền


ii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng của quả dâu tây .......................................... 6
Bảng 2.2. Diện tích, năng suất, sản lượng dâu tây trên thế giới giai đoạn 2006
- 2012 ................................................................................................. 8
Bảng 2.3. Sản lượng dâu tây ở các Châu lục trên thế giới năm 2012 ............... 9
Bảng 2.4. Diện tích và năng suất dâu tây của một số nước qua các năm 2010 –
2012............................................................................................................ 9


STT Từ và thuật ngữ viết tắt
1

BAP

6-Benzylaminopurine

2

Cs

Cộng sự

3

CT

Công thức

4

CV

Coeficient of Variation

5

DNA


11

MT

Môi trường

12

NAA

α-Naphthalene acetic acid

13

TDZ

Thidiazuron

14

2,4-D

2,4 - Dichlorophenoxy Acetic Acid

Food and Agriculture Organization of the
United Nations


v


vi

2.6.1. Vật liệu nuôi cấy ................................................................................... 16
2.6.2. Môi trường dinh dưỡng ......................................................................... 16
2.6.3. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................ 20
2.6.4. Chất điều hòa sinh trưởng ..................................................................... 20
Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 23
3.2. Hóa chất và thiết bị sử dụng ..................................................................... 23
3.2.1. Hóa chất sử dụng ................................................................................... 23
3.2.2. Thiết bị sử dụng..................................................................................... 23
3.3. Địa điểm và thời gian tiến hành ............................................................... 23
3.4. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 24
3.5. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 24
3.5.1. Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng ........................................................... 24
3.5.2. Nghiên cứu tạo mô sẹo từ mảnh lá........................................................ 25
3.5.3. Nghiên cứu tái sinh cây dâu tây từ mô sẹo ........................................... 26
3.6. Phương pháp đánh giá và xử lý số liệu .................................................... 27
Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 29
4.1. Nghiên cứu khả năng nảy mầm của hạt ................................................... 29
4.2. Ảnh hưởng của 2,4D và TDZ đến khả năng tạo mô sẹo từ mảnh lá ....... 30
4.3. Ảnh hưởng của điều kiện sáng/tối đến khả năng tạo mô sẹo từ mảnh lá 34
4.4. Ảnh hưởng của BAP và TDZ đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi 35
4.5. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. .................. 39
Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 42
5.1. Kết luận .................................................................................................... 42
5.2. Kiến Nghị ................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC



2

dụng để phục vụ tái sinh cây dâu tây cũng đã được đa dạng hơn, sử dụng các
bộ phận khác nhau của cây để nuôi cấy như: Lá (Nehra và cs, 1988) [31];
(Hossam Zakaria và cs, 2014) [36]; (Arzu Birinci Yildirim và cs, 2014) [35];
(Nehra và cs, 1988) [31], cuống lá, (Debnath và cs, 2005) [25]; (Foucault và
cs, 2005) [27], nụ hoa, (Owen và Miller, 1996) [32]), rễ (Owen và Miller,
1996) [32], hạt phấn, đoạn thân (Foucault và cs, 2005 [27].
Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn trên tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu tạo mô sẹo và tái sinh cây dâu tây (Fragaria vesca L.) từ mảnh lá”.
1.2. Mục tiêu
Nghiên cứu được khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây dâu tây từ
mảnh lá.
1.3. Yêu cầu
 Nghiên cứu tạo vật liệu vô trùng
 Nghiên cứu tạo mô sẹo từ mảnh lá
 Nghiên cứu tái sinh cây dâu tây từ mô sẹo
1.4. Ý nghĩa của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Hoàn thiện quy trình tạo mô sẹo để tạo nguồn nguyên liệu cho tái sinh
và tạo cây hoàn chỉnh ở cây dâu tây.
- Cung cấp tài liệu học tập, nghiên cứu cho sinh viên, nhà khoa học trên
đối tượng câu dâu tây.
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và bổ
sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn.
- Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, tích lũy đượckinh nghiệm
thực tế cũng như tác phong làm việc, nghiên cứu khoa học phục cho cho công
tác sau này.
- Hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Đại học.

Bộ

: Rosales (hoa hồng)

Họ

: Rosaceae (hoa hồng)

Chi

: Fragaria

Loài

: Fragaria sp.
Hình 1.1. Cây dâu tây

2.1.2. Đặc điểm sinh học của cây dâu tây
Theo Võ Khắc Chi (2003) [2], cây dâu tây có đặc điểm:
2.1.2.1. Rễ
Rễ cây dâu tây thuộc loại rễ chùm. Đầu chóp rễ dâu tây có sức phân
nhánh mạnh. Rễ cây dâu tây phát triển tốt nhất trong điều kiện khi nhiệt độ
đất là 25oC.
2.1.2.2. Thân
Dâu tây thuộc loài cây thân thảo, có 2 kiểu thân là thân chính và thân
bò. Thân bò bắt đầu từ cổ rễ vươn dài trên mặt đất và tận cùng là một chồi,


5


Các thành phần dinh dưỡng trung bình cho quả dâu tây được xác
định ở bảng sau:
Bảng 2.1. Thành phần dinh dƣỡng của quả dâu tây
Thành phần dinh dƣỡng

Đơn vị

Hàm lƣợng dinh dƣỡng
(100g ăn đƣợc)

Năng lượng
Nước
Protein
Lipid
Glucid tổng số
Tro
Natrium (Na)
Kalium (K)
Calcium (Ca)
Vitamin A
Β-caroten
Vitamin E
Vitamin B1
Vitamin B2
Vitamin PP
Vitamin B6
Vitamin C

Kcal
g

0,3
0,06
60,0

(Nguồn: Thái Thị Thúy Liên và cs, 2008) [8]
2.1.3.2. Giá trị kinh tế của dâu tây
Ở Việt Nam cây dâu tây là một loại cây trồng khá mới mẻ. Tuy nhiên
đây lại là một loại cây có giá trị kinh tế cao. Diện tích trồng dâu tây ở Việt
Nam chủ yếu tập trung ở một số vùng như: Đà Lạt – Lâm Đồng, Sapa – Lào
Cai...những vùng có khí hậu ôn đới phù hợp cho sự phát triển của cây. Hiện
nay, giá dâu tây chính vụ đạt khoảng 100.000 – 130.000 đ/kg, thời gian của
vụ chính kéo dài khoảng 4 tháng từ tháng 12 năm trước đến tháng 3 năm sau,


7

năng suất trung bình đạt 20 – 25 tấn/ha. Ngoài ra với việc áp dụng các công
nghệ hiện đại thì cũng có thể trồng dâu tây trái vụ từ tháng 4 đến tháng 9 hàng
năm với việc trồng dâu tây trong các hệ thống nhà kính, nhà lưới cùng với các
kỹ thuật chăm sóc tốt có thể cho năng suất 7 – 9 tấn/ha với giá bán dâu tây trái
vụ không dưới 150.000 đ/kg.
2.1.4. Phƣơng pháp nhân giống cây dâu tây
2.1.4.1. Phương pháp nhân giống truyền thống
Gieo hạt
Là phương pháp lấy hạt giống cho nảy mầm thành cây con, hạt giống
được thu từ quả đã chín, trong điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm hình thành cây.
Ưu điểm: vận chuyển và bảo quản hạt giống dễ dàng do kích thước
hạt giống nhỏ.
Nhược điểm: phương pháp này cho hệ số nhân thấp.
Cắt cành từ cây mẹ

lượng đạt 4,516,810 tấn tăng 545,625 tấn so với năm 2006 (FAOSTAT, 2006
- 2012) [26].
Bảng 2.2. Diện tích, năng suất, sản lƣợng dâu tây trên thế giới
giai đoạn 2006 - 2012
Năm
Chỉ tiêu

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

264 299

264 734

247 825

245 871

228 272

9

Bảng 2.3. Sản lƣợng dâu tây ở các Châu lục trên thế giới năm 2012
Diện tích thu

Châu lục

hoạch (ha)

Năng suất (tạ)

Sản lƣợng (tấn)

Thế giới

241 109

187 335

4 516 810

Châu Á

32 083

258 460

829 223

Châu Mỹ


(Nguồn: FAOSTAT, 2012) [26]
Các quốc gia sản xuất dâu tây trên thê giới chủ yếu tập trung ở Châu
Mỹ (Mỹ, Mexico) và Châu Âu (Tây Ban Nha, Thổ Nhĩ Kỳ).
Châu Mỹ được coi là cái nôi của cây dâu tây và là nơi sản xuất dâu tây
trên thế giới chủ yếu ở Mỹ, Mexico,…đây là vùng có diện tích cũng như sản
lượng dâu tây đứng đầu thế gới.
Bảng 2.4. Diện tích và năng suất dâu tây của một số nƣớc qua các năm
2010 – 2012
2010
Nƣớc

2011

2012

Diện tích

Năng suất

Diện tích

Năng suất

Diện tích

Năng suất

(ha)


6 896

380 989

7 600

381 447

Thổ Nhĩ Kỳ

11 679

256 820

11 967

252 708

12 793

276 067

Hàn Quốc

7 049

328 845

5 816


1 562

197 241

Mexico

6 282

360 804

6 978

328 031

8 664

416 004

(Nguồn: FAOSTAT, 2010 - 2012) [26]


10

2.2.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam cây dâu tây chủ yếu được trồng ở Đà Lạt – Lâm Đồng và
một số vùng có khí hậu ôn đới ở miền Bắc như: Sapa – Lào Cai, Mộc Châu –
Sơn La…Hiện nay nguồn dâu tây sản xuất ở Việt Nam chủ yếu được nhập từ
Pháp, Mỹ, Nhật, Newzeland và một số giống được nhập từ Isarel (Nguyễn Thị
Hường, 2012) [5].
Tuy nhiên, do thiếu quan tâm đến việc trồng và phát triển cây dâu tây

Ngoài ra các nghiên cứu của Arzu Birinci Yildirim và cs (2014) [34],
Landi L. và cs (2005) [29]. Thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của các chất
kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh cây dâu tây. Hossam Zakaria và
cs [35] nghiên cứu cải tiến tái sinh và chuyển đổi gen cho ba loại dâu tây.
Otroshy Mahmoud và Moradi Kosar (2013) [24] nghiên cứu tái sinh và tạo
mô sẹo có nguồn gốc từ lá dâu tây in vitro. Marta Barceló và cs (1998) [24]
nghiên cứu tái sinh và chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefacien cho giống dâu tây Chandler. Kristi Lee Whitley (2004) [34]
nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tái sinh cây dâu tây (Fragaria x
ananassa Duch.) từ lá.
2.3.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, các nhà khoa học cũng đã ứng dụng các kĩ thuật nuôi
cấy mô tế bào thực vật vào nhân giống cây dâu tây để có thể nhân nhanh các
giống dâu tây cũng như tạo ra nguồn giống sạch bệnh phục vụ cho nhu cầu
sản xuất.
Phân viện Sinh học Tây Nguyên là nơi có nhiều những nghiên cứu về
cải tiến tái sinh cây dâu tây như: Dương Tuấn Nhựt và cs (2004) [14] đã
nghiên cứu cải tiến hệ thống nhân giống dâu tây bằng nuôi cấy trong túi nilon.
Nguyễn Trí Minh và cs (2008) [11] đã nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ
ánh sáng và hàm lượng CO2 lên khả năng sinh trưởng in vitro và ex vitro cây
dâu tây (Fragaria ananassa Duch.). Phạm Xuân Tùng và Phạm Thị Lan
(2007) [19] đã nghiên cứu ảnh hướng của các biện pháp khử trùng mẫu và các


12

yếu tố môi trường trong nhân nhanh giống dâu tây in vitro. Nguyễn Trí Minh
(2010) [11] nghiên cứu hệ thống nhân giống cây dâu tây Fragaria x ananassa
Duch. bằng công nghệ nuôi cấy mô thực vật, đặc biệt chú trọng công nghệ
quang tự dưỡng, nhằm tạo ra cây dâu tây sạch bệnh và chất lượng cao. Trần

cơ quan chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau.
Tuy nhiên ở tất cả các loại tế bào đều có nguồn gốc từ một tế bào đầu tiên (tế
bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào tiếp tục phân chia thành nhiều tế bào phôi
sinh mang chức năng chuyên biệt (chưa chuyên hóa). Sau đó, từ các tế bào
phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc
hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau (Nguyễn Như Hiền,
2009)[4].
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào
mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào
có thể biểu thị:
Tế bào phôi sinh

Tế bào dãn

Tế bào phân hóa có chức năng

riêng biệt.
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng
chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong
trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào
phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào,
ngược lại với sự phân hóa tế bào.
Phân hóa tế bào
Tế bào phôi sinh

Tế bào dãn

Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào

lý của mô được đưa vào nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy.
+ Phân chia tế bào:
Tế bào đi vào giai đoạn phân chia tăng sinh khối: tế bào đi vào quá
trình biệt hóa, xuất hiện sự biệt hóa tế bào và sự xuất hiện các con đường trao
đổi chất dẫn đến việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Trần
Văn Minh, 2003) [13]. Mô sẹo thường có màu vàng, trắng hay xanh hoặc màu
sắc tố anthocyanin.


15

+ Biệt hóa:
Sự biệt hóa của tế bào hình thành các chất liệu cấu tạo nhu mô các loại,
các tế bào rây, hình thành vùng mô phân sinh, trung tâm của sự tạo nên chồi
và rễ.
Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào. Sự
biến tính này xảy ra do độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế
bào đa bội thể có số lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều
kiện nuôi cấy, thành phần môi trường nhất là hoocmon.
Để tạo môi trường có bổ xung chất kích thích sinh trưởng, đôi khi có
dịch chiết (Trần Văn Minh, 2003) [13]. Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy
mà chất kích thích sinh trưởng bổ xung vào có khác nhau (Trần Văn Minh,
2003) [13]. Chất hoocmon thường tổ hợp thành 4 nhóm:
- Auxin
- Cytokinine
- Auxin + Cytokinine
- Dịch chiết
Sau khi mô sẹo hình thành, mô sẹo được cấy chuyển. Môi trường cấy
chuyển cũng giống như môi trường tạo mô sẹo nhưng giảm nồng độ chất kích
thích sinh trưởng. Kích thước tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển

- Một số thành phần khác
2.6.2.1. Nguồn Cacbon
Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương
thức dị dưỡng. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon
hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn cacbon thông dụng nhất hiện nay là
saccharose, ngoài ra vẫn có thể sử dụng maltose, glucose (Trần Thị Lệ và cs,
2008) [7].


17

2.6.2.2. Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng
+ Nitrogen: Thường được sử dụng ở dạng NO3- hoặc NH4+, thực vật sẽ
sử dụng nguồn nitơ này để đồng hóa và tạo nên các sản phẩm hữu cơ. Hàm
lượng Nitrat trong môi trường khoảng 25 mM. Trong môi trường MS, amôn
được cung cấp ở dạng muối NH4NO3, trong số các nguyên tố của môi trường
thì nitơ có hàm lượng lớn nhất (Vũ Văn Vụ và cs, 2009) [23].
+ Phospho: Phospho (P) tham gia vào nhiều hợp chất quan trọng quyết
định đến quá trình trao đổi chất và năng lượng, quyết định đến các hoạt động
sinh trưởng phát triển của cây: P tham gia vào thành phần của axit nucleic;
tham gia vào thành phần của photpholipit; P có mặt trong hệ thống ADP, ATP;
P tham gia vào các hoạt động của enzyme oxi hóa khử là NAD, NADP, FAD,
FMN…
Hai dạng Phospho thường dùng là NaHPO4.7H2O và KH2PO4, P cũng
có tác dụng như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường (Vũ Văn Vụ và cs,
2009) [23].
+ Kali: Có vai trò điều chỉnh các đặc tính lý hóa của keo nguyên sinh
chất và từ đó ảnh hưởng đến tốc độ và chiều hướng của quá trình xảy ra trong
tế bào. Kali có tác dụng điều chỉnh sự đóng mở khí khổng, điều chỉnh dòng
vận chuyển các hợp chất hữu cơ trong mạch libe, ngoài ra Kali hoạt hóa rất