Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH-KTNN

………………………………

NGUYỄN THỊ HOA

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO
VÀ TÁI SINH CÂY Ở MỘT SỐ GIỐNG
LÚA NHẬT BẢN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền học

Ngƣời hƣớng dẫn:

TS. LÊ XUÂN ĐẮC

HÀ NỘI - 2012

Nguyễn Thị Hoa

1

K34E Sinh - KTNN




Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận này là kết quả nghiên cứu của riêng tôi,
những tƣ liệu đƣợc trích dẫn trong khóa luận này là trung thực.
Kết quả nghiên cứu này không hề trùng lặp với bất kì công trình nghiên
cứu nào đƣợc công bố trƣớc đây.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

Ngƣời thực hiện

Nguyễn Thị Hoa

Nguyễn Thị Hoa

3

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

MỤC LỤC

Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.4.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam .................................................... 24
Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 25
2.1.

Nguyên liệu ............................................................................................... 25

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 25

2.2.1. Tạo nguyên liệu vô trùng .......................................................................... 26
2.2.2. Nuôi cấy tạo mô sẹo .................................................................................. 26
2.2.3. Nhân mô sẹo .............................................................................................. 26
2.2.4. Tái sinh cây ............................................................................................... 27
2.2.5. Tạo cây hoàn chỉnh ................................................................................... 27
2.2.6. Đƣa cây ra trồng ........................................................................................ 27
2.3. Thu thập và xử lý số liệu ........................................................................... 28
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 30
3.1.

Tạo nguyên liệu vô trùng .......................................................................... 30

3.2.

Tạo mô sẹo ................................................................................................ 31


Kết luận ............................................................................................................... 42
Kiến nghị ............................................................................................................. 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 43

Nguyễn Thị Hoa

6

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 3.1

Tỷ lệ hạt nhiễm khi khử trùng

30

Bảng 3.2

Tỷ lệ mô sẹo trên môi trƣờng 2,4D (2 mg/l)

31


Bảng 3.8

Tỷ lệ cây sống trên các loại giá thể

41

Nguyễn Thị Hoa

7

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang
Hình 3.1

Tạo giống mô sẹo NIP1 và NH3 trên môi trƣờng 0,2mg/l
BAP

Hình 3.2

33

Tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống trên các công thức môi

8

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D

2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit

BAP

6 - Benzyl Amino Purin

ĐC

Đối chứng

IAA

Indol - 3- Axetic Axit

IBA

3 - Indol Butyric Axit


vitamin

Nguyễn Thị Hoa

9

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài

Lúa là lƣơng thực chính của các nƣớc châu Á. Nó đã đi vào văn hóa của
nhiều dân tộc, do có khẩu vị và sở thích ăn loại cơm khác nhau. Trong khi dân
Đông và Đông Nam Á thích loại gạo hạt dài nhƣ Basmati, Jasmine thì các nƣớc
Đông Bắc Á lại thích loại gạo tròn. Gạo tròn chỉ thích hợp trồng ở vùng ôn đới.
Những nƣớc ăn gạo hạt tròn thƣờng thuộc những nƣớc phát triển và sản xuất
không đủ, do đó họ sẵn sàng trả tiền cao để mua loại gạo này. Điều này trong
thời gian tới có thể sẽ thay đổi, Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI gần đây đã
chọn tạo đƣợc 2 giống lúa có dạng hạt gạo tròn nhiệt đới Japonica ở
Philippines, đó là 2 giống NSIC Rc170 và IRRI 142 để gieo trồng trên diện
rộng. Các giống lúa này mang đầy kỳ vọng giúp nông dân Philippines đạt
lợi nhuận cao hơn, và nhất là giúp ngƣời tiêu dùng có thể thƣởng thức đƣợc
gạo Nhật với giá rẻ, đồng thời cũng mở ra triển vọng mới đối với nông dân
Việt Nam.
Dù đƣợc mệnh danh là cƣờng quốc xuất khẩu gạo lớn thứ hai thế giới,

việc tăng tính chống chịu lạnh, kháng bệnh cháy lá, cháy bìa lá, khô vằn,
dạng hình cây lúa, vàng (lão hóa) lá sớm, cải thiện hình dạng hạt gạo, độ
dẻo, hóa hồ và các đặc tính khác.
Những nghiên cứu chọn tạo các giống cây trồng mới để ứng dụng vào sản
xuất là rất quan trọng và đƣợc nhiều quốc gia chú trọng đầu tƣ, phát triển.
Một trong các kỹ thuật đƣợc quan tâm ứng dụng vào chọn tạo giống lúa là sử
dụng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế
bào thực vật đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nhân
giống và phục tráng cây trồng, chọn tạo giống chống chịu các điều kiện bất
lợi của môi trƣờng, chuyển gen có giá trị kinh tế vào cây trồng, kết hợp nuôi
cấy mô và đột biến thực nghiệm…
Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn ở trên, chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài: “Đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở một số giống
lúa Nhật Bản”, nhằm phục vụ các nghiên cứu tiếp theo đối với các giống lúa
này.
2. Mục đích nghiên cứu
Xây dựng hệ thống tạo mô sẹo, tái sinh cây trong ống nghiệm đối với một
số giống lúa Nhật Bản để phục vụ các nghiên cứu ứng dụng nhƣ đột biến mô
sẹo hay chuyển gen để chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao.

Nguyễn Thị Hoa

11

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về cây lúa
1.1.1. Nguồn gốc
Cây lúa trồng Oryza sativa L. (2n= 24) là loại thân thảo sống hàng năm.
Thời gian sinh trƣởng của các giống dài ngắn khác nhau và nằm trong khoảng
60 - 250 ngày. Về nguồn gốc cây lúa có nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và
đƣa ra nhiều ý kiến khác nhau.
+ Theo Candalle (1886) cây lúa có nguồn gốc từ Ấn Độ.
+ Theo Roselevicz (1931) cây lúa có nguồn gốc từ Đông Nam Á, đặc biệt Ấn
Độ và Đông Dƣơng.
Tuy có nhiều ý kiến khác nhau về nguồn gốc cây lúa nhƣng cho đến nay
các nhà khoa học đã thống nhất là cât lúa có nguồn gốc ở Đông Nam Á và
Nam Trung Hoa.
Việc xác định nguồn gốc cây lúa ở Đông Nam Á dựa vào các cơ sở sau
đây:
+ Đây là vùng trồng lúa có diện tích tập trung và lớn trên thế giới.
+ Tổ tiên của các loài loài lúa trồng hiện nay là lúa dại vẫn còn tìm thấy ở
nhiều nƣớc trong khu vực này.
+ Theo các tài liệu lịch sử, các di tích lịch sử khảo cổ học đã cho thấy cây lúa
đƣợc trồng ở khu vực này từ rất sớm khoảng 4000 - 5000 năm trƣớc.

Nguyễn Thị Hoa

13

K34E Sinh - KTNN



+ Oryza Sativa Sub. Sp. Indica Kato (loài phụ Ấn Độ).
- Loài Oryza Sativa L. đƣợc chia làm 3 loài phụ:
+ Loài phụ Indica đƣợc trồng ở các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới (Việt
Nam, Ấn Độ, Mianma, Philippin…). Loài phụ Indica có đặc điểm hạt dài,
thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh khá, năng suất thấp, mẫn cảm với chu kỳ
ánh sáng.
+ Javanica phân bố ở những nơi có vĩ độ cao (bắc Trung Quốc, Nhật Bản,
Triều Tiên…), có những đặc điểm nhƣ chịu rét cao, nhƣng ít chịu sâu bệnh.
+ Japonica là loại hình trung gian giữa Indica và Javanica nhƣng gần với
Indica hơn. Javanica có đặc điểm hạt dày và rộng hơn hạt của Indica, chỉ
đƣợc trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia (Mai Thọ Trung,1990; Khush, 1997)
[10] [14].

Nguyễn Thị Hoa

14

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Ngoài ra còn một số cách phân loại khác tùy theo tiêu chí đặt ra nhƣ:
- Dựa vào hình thái hạt lúa: lúa hạt tròn; lúa hạt dài…
- Dựa vào thành phần dinh dƣỡng: lúa nếp; lúa tẻ…
- Dựa vào thời gian sinh trƣởng: lúa ngắn ngày; lúa dài ngày…
- Dựa vào mùa vụ gieo trồng có: lúa chiêm xuân; lúa mùa; lúa hè thu…
1.2. Các phƣơng pháp chọn tạo giống lúa


cúc... đã tạo ra nhiều dòng đột biến có giá trị, đƣợc chọn lọc và phát triển trực
tiếp thành các giống quốc gia hoặc các dòng có triển vọng phục vụ cho công
tác lai tạo giống mới.
Việc chọn lọc dòng/giống nào để xử lý đột biến phụ thuộc vào tính trạng
cần cải tiến. Các bức xạ bức xạ ion hoá mật độ cao chủ yếu gây ra những biến
đổi nhiễm sắc thể (sắp xếp lại, mất đoạn...), trong khi bức xạ ion hoá mật độ
thƣa (tia X, tia gamma) và bức xạ không ion hóa (tia tử ngoại) gây ra nhiều
đột biến điểm hơn. Các tác nhân hoá học đa dạng hơn nhiều về chủng loại so
với tác nhân lý học. Các tác nhân nhƣ ethyl methane sulphonate (EMS) và các
hợp chất siêu đột biến nitrozo urê (nitrozoethyl urê) gây ra tần số đột biến cao
ở nhiều loại cây trồng.
a. Xử lý bằng chiếu xạ
Để xử lý bằng chiếu xạ, hạt, cây con, các bộ phận sinh dƣỡng (hoa, bao
phấn, hạt phấn...) đƣợc đặt dƣới nguồn chiếu.
Trong quá trình xử lý phải đảo trộn nhiều lần hạt hoặc cây con, các bộ
phận sinh dƣỡng và tuân thủ điều kiện bảo hộ lao động.
Thời gian chiếu phụ thuộc vào công suất của nguồn và liều lƣợng cần xử
lý. Công suất nhỏ thì thời gian xử lý dài và ngƣợc lại.
Độ ẩm của hạt có ý nghĩa quyết định đối với tác động đột biến của tia
bức xạ vì nó ảnh hƣởng trực tiếp tới trạng thái sinh lý của hạt. Phơi khô cũng
nhƣ tăng thủy phần của hạt đều làm tăng tác động của tia bức xạ. Ngoài ra,
nhiệt độ và ôxy của hạt và của không khí cũng ảnh hƣởng tới kết quả xử lý.
Với tia bức xạ, có thể xử lý nhanh (từ vài phút đến vài giờ) hoặc xử lý
lâu dài trong trƣờng gamma (từ nhiều tuần trở lên với cƣờng độ thấp), nhƣng

Nguyễn Thị Hoa

16



Nguyễn Thị Hoa

17

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

hổng trên màng tế bào đƣợc hình thành tùy thuộc vào điện trƣờng, làm cho
ADN bên ngoài môi trƣờng đƣợc truyền qua lỗ hổng vào tế bào. Một số tế
bào thực vật có thể tiếp thu ADN nhờ xung điện mà không cần xử lí trƣớc
nhƣ tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì. Zang và cs (1988) đã đƣa ra cây lúa
chuyển gen từ tế bào trần sử dụng phƣơng pháp xung điện. Sau một năm
Shimamoto và cs (1989) đƣa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên ở giống
lúa Japonica sử dụng phƣơng pháp xung điện.
- Chuyển gen bằng vi tiêm (Microinjection):
Ngƣời ta sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lƣợng nhỏ
ADN vào những tế bào nhất định, có thể là một tế bào nguyên vẹn. Phƣơng
pháp này có ƣu điểm là ADN đƣa vào tế bào một cách chính xác, thậm chí
vào tận nhân và có thể quan sát đƣợc. Phƣơng pháp này cần có thiết bị có độ
chính xác cao, thao tác khéo léo, kỹ thuật và kỹ năng của ngƣời thực hiện phải
chính xác.
- Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (Pollen tube):
Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ nảy
mầm hình thành ống phấn. Lúc này tiêm gen mong muốn đi theo ống phấn
mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang

không những không phụ thuộc vào kiểu gen mà tần suất lại cao. Ở một vài
trƣờng hợp, tần suất chuyển gen bằng phƣơng pháp này ngang với cây hai lá
mầm.
b, Chuyển gen gián tiếp
- Chuyển gen gián tiếp nhờ virus:
Đối với việc chuyển gen vào thực vật thì virus thực vật cũng đƣợc coi
nhƣ một vectơ. Virus làm vectơ chuyển gen phải có các tiêu chuẩn sau:
+ Bộ gen có cấu trúc ADN
+ Có độ thiệt hại thấp hoặc không hại
+ Phổ kí chủ rộng
+ Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào

Nguyễn Thị Hoa

19

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Có hai loại vius đảm nhận đƣợc vai trò chuyển gen là: Cauliflow mosaic
virus (caMV) và Genini virus.
- Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens:
Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
đƣợc xem là phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm)
dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium.
1.2.3. Tạo giống bằng phương pháp lai

phức tạp nhiều bậc.
Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI (tại Manina, Philippines) dùng phƣơng
pháp lai các giống ngoại với giống địa phƣơng có kết hợp đột biến theo
phƣơng pháp lai phức tạp. Vì vậy đã tạo ra đƣợc những giống lúa tốt, nhiều
giống lúa tốt đƣợc trồng ở Việt Nam nhƣ IR5, IR8, IR64…
- Lai thuận nghịch: tiến hành lai cả thuận và nghịch giữa các dòng tự thụ phấn
để thăm dò, tìm ra tổ hợp lai có giá trị kinh tế nhất.
- Lai khác thứ tạo giống cây trồng mới: là phƣơng pháp lai giữa hai hay nhiều
thứ có nguồn gen khác nhau để tạo ra giống mới, thông thƣờng đều có biểu
hiện ƣu thế lai.
1.2.4. Nhập nội giống thích nghi
Việc nhập nội các vật liệu khởi đầu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc
chọn giống. Nhập nội theo nghĩa rộng là đƣa vật liệu (có thể là giống, dạng
loài hoang dại họ hàng với cây trồng) vào môi trƣờng mới mà trƣớc đây chƣa
đƣợc gieo trồng. Theo nghĩa hẹp, nhập nội là di chuyển vật liệu từ nƣớc này
sang nƣớc khác. Nếu vật liệu nhập nội thích hợp tốt với môi trƣờng mới thì
sau khi khảo nghiệm có thể đƣợc công nhận là giống đƣa vào sản xuất mà
không cần thay đổi gọi là nhập nội sơ cấp (sử dụng trực tiếp). Ngƣợc lại, nếu
vật liệu nhập nội mà không thích ứng mà phải qua chọn lọc hoặc sử dụng lai
để chuyển hay kết hợp gen có ích gọi là nhập nội thứ cấp (sử dụng gián tiếp).
Những đặc tính quý của thực vật nhƣ tính chín sớm, tính chịu rét, chịu
nóng, chịu phèn, chịu mặn, kháng sâu bệnh có phẩm chất tốt… chỉ có thể hình

Nguyễn Thị Hoa

21

K34E Sinh - KTNN




22

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

1.3.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở lý luận của phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính
toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Theo quan điểm
của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ mang
toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật, khi gặp điều
kiện thích hợp thì mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn
chỉnh.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật (plant tissue culture) là kĩ thuật đƣa một
mô, bộ phận hoặc tế bào của thực vật vào trong một hệ thống vô trùng có thể
kiểm soát về: thành phần chất khoáng, điều hòa sinh trƣởng, các chất hữu cơ
cung cấp cho cây, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để mô, bộ phận sinh trƣởng đó
phát triển theo mục đích của ngƣời nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1998; Nguyễn Đức
Thành, 2000)[12][8].
Mục đích chung của nuôi cấy mô - tế bào thực vật là sử dụng các điều
kiện nhƣ: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dƣỡng, các chất điều hoà sinh
trƣởng thực vật… để điều khiển quá trình sinh trƣởng và phát triển của tế bào,
mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra.
Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu hƣớng về những ứng
dụng thực tiễn nhƣ:
- Tạo đƣợc quần thể lớn và đồng nhất trong thời gian ngắn, với diện tích nhỏ,

Bên cạnh đó sự ổn định và độc lập, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài
tự nhiên.
Ngoài ra, nuôi cấy mô - tế bào thực vật còn là một phƣơng pháp nghiên
cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật. Phƣơng
pháp này giúp mở ra những hƣớng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền
thực vật nhƣ: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý
dinh dƣỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…
Nuôi cấy mô - tế bào bao gồm:
- Nuôi cấy mô và cơ quan tách rời
- Nuôi cấy mô phân sinh
- Nuôi cấy phôi

Nguyễn Thị Hoa

24

K34E Sinh - KTNN


Trường ĐHSP Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

- Nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
- Nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần
- Nuôi cấy mô sẹo
Các bước nhân giống bằng nuôi cấy mô (microproparation):
- Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng hoặc chồi đỉnh chồi bên.
- Tạo thể nhân giống in- vitro.
- Nhân giống in vitro.