MỞ ĐẦU
Lúa là cây lương thực quan trọng thứ ba trên thế giới, 90% diện tích trồng lúa
và tiêu thụ chủ yếu ở châu Á... Hiện nay lúa được trồng trong những điều kiện sinh
thái và khí hậu rất khác nhau ở cả ba vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới trên tất
cả các châu lục [8, 12].
Việt Nam là một nước nông nghiệp với truyền thống trồng cây lúa nước và
được xếp vào hàng những nước xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Sản lượng gạo xuất
khẩu năm 1999 lên tới 4,3 triệu tấn song hiệu quả xuất khẩu và khả năng cạnh tranh
trên thị trường quốc tế còn thấp, một trong những nguyên nhân là do chất lượng gạo
chưa đáp ứng được nhu cầu về phẩm chất của thị hiếu người tiêu dùng. Trong khi đó
nhiều địa phương của nước ta có những giống lúa rất quý như Tám Thơm, Tám Ấp
Bẹ, Dự Thơm,Tẻ Di Hương... hạt trong, cơm dẻo và rất thơm ngon. Đây là những
giống có tiềm năng nâng cao giá trị xuất khẩu nhưng năng suất còn thấp vì cây cao,
thân mềm chống đổ kém, lá dài, mỏng và rủ, hạt thưa, thời gian sinh trưởng kéo dài,
phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn [4, 11, 12].
Bằng phương pháp chọn dòng tế bào mang biến dị soma Viện Công nghệ sinh
học đã chọn tạo được ba giống lúa DR
1
, DR
2
và DR
3
cho năng suất cao, ổn định và có
khả năng chịu hạn, chịu lạnh tốt hơn so với giống gốc X
11
và CR203 [14]. Sử dụng
công nghệ tế bào thực vật, công nghệ gen kết hợp với kỹ thuật gây đột biến bằng tia
gamma cho phép cải biến một số đặc điểm nông học còn hạn chế của các giống lúa
nêu trên theo hướng hạ thấp chiều cao cây, chống đổ và rút ngắn thời gian sinh
trưởng. Mặt khác để nắm vững đặc điểm của các giống lúa đặc sản trước hết cần sử
dụng kỹ thuật sinh học phân tử để đánh giá sự đa dạng về di truyền của nhóm lúa

C. Enzym này hoạt động tốt nhất ở
70
0
C - 80
0
C. Trọng lợng phân tử của Taq ADN polymeraza là 94 KD, gen tổng hợp
dài 2499 cặp bazơ nitơ, mã hoá cho 832 axit amin [34].
Năm 1988, Saiki đã chỉ ra rằng hoạt tính của Taq polymeraza giảm 50% sau
130 phút ở 92,5
0
C; sau 40 phút ở 95
0
C và sau 5-6 phút ở 97
0
C. Mặt khác, nồng độ
ion Mg
++
và dNTP trong hỗn hợp phản ứng cũng ảnh hởng rất nhiều đến hoạt tính
của Taq polymeraza [23, 34].
Đoạn mồi là những đoạn oligonucleotit đợc thiết kế bổ sung với mạch ADN
khuôn. Để gắn mồi một cách đặc hiệu, đoạn mồi thờng đợc tổng hợp dài từ 18 - 24
nucleotit. Phản ứng PCR dùng một cặp mồi gồm một mồi xuôi (forward) và một
môi ngợc (reverse), mồi luôn gắn với ADN khuôn theo chiều từ 3

- 5

và ADN
polymeraza kéo dài chuỗi tổng hợp về đầu 5

.

I : chiều dài của mồi.
- Giai đoạn 3: giai đoạn kéo dài (extension) ở nhiệt độ 72
0
C, ADN Taq
polymeraza hoạt động tổng hợp, kéo dài các mạch theo nguyên tắc bổ sung từ hai
đầu sợi khuôn ban đầu. Geifand và White (1990) đã thông báo về tốc độ tổng hợp
của Taq là: 150 nucleotit/giây ở 75
0
C - 80
0
C; >60 nucleotit/giây ở 70
0
C; 24
nucleotit/giây ở 55
0
C; 1,5 nucleotit/giây ở 37
0
C; 0,25 nucleotit/giây ở 22
0
C [23].
Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn nh trên, từ một phân tử ADN khuôn đợc
nhân lên thành hai, các đoạn ADN vừa nhân bản trong mỗi chu kỳ lại làm khuôn
cho chu kỳ nhân bản tiếp theo vì đầu tận cùng của sản phẩm bổ sung với mồi. Do đó
sau mỗi chu kỳ tổng hợp đựơc lợng ADN gấp đôi và nh vậy sau n chu kỳ nhân bản
sẽ tạo ra 2
n
bản ADN khuôn ban đầu [13].
Công thức: Y = x.2
n


đoạn mồi ngẫu nhiên có chiều dài 10 nucleotit với thành phần G + C cao (60%) để
bám chặt vào ADN khuôn.
Điểm khác giữa RAPD so với PCR là nó chỉ sử dụng một mồi ngẫu nhiên dài
10 nucleotit, quá trình nhân bản ADN là ngẫu nhiên. Đoạn mồi này có thể bám vào
bất kỳ vị trí nào trong bộ genom khi tìm đợc vị trí bổ sung. Với chiều dài ngắn nên
khả năng đoạn mồi tìm đợc các đoạn tơng đồng trên các mạch đơn của ADN trong
genom không quá khó khăn. Vì thế RAPD là một phơng pháp có hiệu quả để xác
định tính đa hình về trật tự nucleotit giữa các cá thể. Tùy vào từng nhóm loại thực
vật hay vi sinh vật cụ thể mà các đoạn mồi ngẫu nhiên đợc thiết kế đặc dụng. Theo
4
lý thuyết, số lợng các đoạn ADN đợc nhân bản phụ thuộc vào độ dài và vị trí gắn
của các đoạn mồi, kích thớc và mức độ phức tạp của cấu trúc genom. Kết quả là sau
khi điện di sản phẩm RAPD sẽ xuất hiện nhiều phân đoạn khác nhau. Sự khác nhau
đó gọi là tính đa hình.
Sự đa hình của sản phẩm RAPD là do mức độ tơng đồng của trình tự ADN
trong genom với trình tự mồi và kích thớc của bộ genom. Độ tơng đồng càng cao thì
phân đoạn càng nhiều.
Kỹ thuật RAPD cũng giống PCR gồm ba giai đoạn nhng điểm khác là trong
giai đoạn gắn mồi RAPD có nhiệt độ bắt mồi thấp hơn (từ 35
0
C - 45
0
C). Đây cũng là
một nguyên nhân dẫn đến có nhiều phân đoạn ADN đợc nhân bản ngẫu nhiên [2].
RAPD là một phơng pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích
quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập bản đồ di truyền. Kỹ thuật
RAPD đợc sử dụng để nhận biết và phân loại các giống cây trồng khác nhau, sự đa
dạng di truyền trong các kiểu gen lúa nớc và lúa nơng, sự đa dạng di truyền giữa lúa
Indica và Japonica, xác định sự đa hình của các giống.
Yang và Quiros đã sử dụng 28 đoạn mồi có trình tự 10 nucleotit để nghiên

B
là số băng chỉ có ở loài B.
Ngày nay, các nhà nghiên cứu đã thiết lập đợc phần mềm máy tính để tự
động vẽ nên biểu đồ mối quan hệ hay độ tơng đồng di truyền của các đối tợng
nghiên cứu sau khi nhập dữ liệu về các băng nhân bản của các cá thể. NTSYSpc
version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) là tên của một trơng trình thuộc
kiểu trên để tạo các biểu đồ hình cây. Biểu đồ thu đợc sẽ thể hiện mức độ gần nhau
của các cá thể cho phép đánh giá đợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể đợc
nghiên cứu. Chơng trình này cho phép giảm bớt thời gian nghiên cứu và có độ chính
xác cao nên nó là một phần mềm có hiệu quả trong việc phân tích kỹ thuật RAPD.
1.2. Đặc điểm của các giống lúa Đặc sản ở miền Bắc Việt Nam
ở nớc ta cây lúa giữ vị trí trọng yếu trong hệ thống cây lơng thực. Ngày nay
khi năng suất lúa gạo đã đáp ứng đủ nhu cầu trong nớc và có d để xuất khẩu thì ngời
ta quan tâm nhiều đến chất lợng gạo. Các giống lúa đang đợc sản xuất trên diện tích
lớn mặc dù cho năng suất cao nhng chất lợng cha đáp ứng đợc nhu cầu của thị trờng
đòi hỏi. Vì vậy vị trí các giống lúa đặc sản ngày càng quan trọng trong việc nâng
cao chất lợng gạo Việt Nam.
Các giống lúa đặc sản có chất gạo tốt và có mùi thơm ngon thuộc nhóm lúa
mùa chính vụ. Đa số các giống lúa này đợc trồng ở một số tỉnh thuộc khu vực miền
Bắc nớc ta (Thái Bình, Nam Định, Hà Tây, Hải Dơng, Hải Phòng...), nh Tám Xoan
Hải Hậu, Tám ấp Bẹ Xuân Đài, Tám Cổ Ngỗng Nam Định, Dự Thơm, Tẻ Di H-
ơng... Là những giống lúa có tiềm năng xuất khẩu và đáp ứng nhu cầu thiết thực
trong nớc [12].
Nhng các giống lúa này có diện tích gieo trồng ít, năng suất còn thấp và
không ổn định, do có nhiều đặc điểm yếu nh cây cao (từ 145 -170 cm), thân mềm
yếu, chống đổ kém, lá dài rủ, hạt tha, cổ bông dài, kém chịu phân, phản ứng chặt
chẽ với ánh sáng ngày ngắn và có thời gian sinh trởng khá dài (từ 155-170 ngày) cần
6
2N
AB

1983) [30]. Bằng cách này nhiều tác giả đã thông báo thu đợc những giống cây
trồng mới [3, 15, 20, 33].
Thuật ngữ biến dị soma đợc Larkin và Scowcroft (1982) [27] dùng để chỉ
tất cả các biến dị xảy ra trong quá trình nuôi cấy mô và tế bào. Biểu hiện của biến dị
soma đợc quan sát thấy ở kiểu hình của những cây tái sinh từ nuôi cấy mô sẹo.
Nguyên lý chung của việc chọn dòng mang biến di soma là ở tế bào nuôi cấy in
vitro tần suất biến động di truyền dao động từ 10
-5
- 10
-8
trong môi trờng nuôi cấy
bình thờng khi không xử lý đột biến, còn nếu kết hợp với xử lý đột biến bằng chất
7
hoá học (EMS, BU...) hoặc các loại bức xạ (tia UV, tia gamma...) thì tần số đột biến
có thể tăng lên gấp 10 - 100 lần, vì vậy có thể chọn ra các cá thể đột biến nhanh hơn
và có hiệu quả hơn so với các biện pháp chọn giống thông thờng khác áp dụng cho
cây nguyên vẹn. ở mức độ tế bào, nhất là tế bào đơn bội hầu nh các đặc điểm đột
biến đợc thể hiện ra ngay. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào còn cho phép giảm bớt đáng
kể thời gian cần thiết để chọn đợc những tính trạng theo ý muốn [22].
Shepart và CS (1980) qua nuôi cấy tế bào trần của khoai tây đã chọn lọc và
đã thu đợc giống khoai tây có thời gian sinh trởng ngắn, củ đều, hình dạng đẹp và
chống chịu đợc một điều kiện bất lợi của môi trờng tốt hơn so với giống gốc [trích
dẫn từ 1].
Larkin và CS (1982) [27], Barwale và CS (1987) [19] cũng cho rằng biến dị
soma thờng xuất hiện ở các cây tái sinh đợc sau khi nuôi cấy tế bào qua giai đoạn
mô sẹo. Có nhiều kiểu đột biến nh: đột biến nhân, đột biến tế bào chất, đa bội thể và
các bất thờng khác trong nhiễm sắc thể.
Trong nghiên cứu thực nghiệm Maliga (1984) [28] đã tiến hành xử lý tia cực
tím đối với tế bào trần thuốc lá và xử lý tia gamma Co
60

Giống lúa DR3 đã qua ba vụ khảo nghiệm cơ bản và hiện đang đợc triển khai mở
rộng sản xuất ở các vùng sinh thái khó khăn.
Tơng tự nh vậy Viện lúa đồng Bằng sông Cửu Long cũng đã chọn tạo thành
công dòng lúa Khao 105 có tính ứng dụng và các dòng chịu muối triển vọng từ
giống lúa Một Bụi (Bùi Bá Bổng, 1997) [3] và hiện nay giống Khao 105 đã đợc công
nhận là giống Quốc gia. Phòng Di truyền Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh
học cũng đã chọn tạo thành công giống lúa BR12 kháng bệnh đạo ôn, có nguồn gốc
từ giống lúa CR203.
Việc chọn đợc những dòng tế bào kháng nấm bệnh, kháng chất diệt cỏ,
kháng kháng sinh, kháng kim loại nặng, thích nghi tốt với các yếu tố bất lợi của môi
trờng (nóng, lạnh, khô, hạn, chua, mặn...), trên nhiều đối tợng cây trồng khác nhau
có một ý nghĩa to lớn trong nông nghiệp.
1.4. Đột biến thực nghiệm và ứng dụng trong chọn tạo giống
cây trồng
Vật chất di truyền đợc duy trì ổn định từ thế hệ này sang thế hệ khác, nhng
không phải là tuyệt đối, có thể bị biến đổi bởi tác nhân tự nhiên hoặc gây tạo nh tác
nhân gây đột biến vật lý và hoá học. Ngời ta gọi những biến đổi dù là nhỏ nhất trong
cấu trúc gen hoặc nhiễm sắc thể là đột biến [16].
Trong chọn giống cổ điển để chọn đợc một giống tốt, ổn định ngời ta phải
cần ít nhất từ 6 đến 10 thế hệ vì những đột biến trong tự nhiên suất hiện với tần số
rất thấp. Trong khi đó bằng phơng pháp đột biến nhân tạo (đột biến thực nghiệm),
chỉ cần từ 3 đến 6 thế hệ, thậm chí cá biệt chỉ có trờng hợp cần 2-3 thế hệ (Nguyễn
Hữu Đống, 2000) [10]. Với phơng pháp đột biến nhân tạo, sử dụng các tác nhân gây
đột biến lý hoá có thể làm tăng nguồn đa dạng di truyền trong quần thể. Trong hàng
loạt các đột biến xuất hiện, những đột biến có lợi có thể nhân trực tiếp thành giống
mới hoặc đợc sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn giống. Trong nhiều
9
tác nhân gây đột biến thì các tác nhân vật lý (tia Rơnghen, tia gamma, bức xạ
nơtron...) hiện là những tác nhân gây đột biến có hiệu quả, giúp chọn tạo ra các
giống cây trồng có những tính trạng tốt (chịu hạn, kháng nấm, năng suất cao, chất l-

60
lên tế bào hoặc mô thì các phân
tử sinh học chịu tác dụng trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hoá:
- Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp ion hóa và kích thích các phân tử sinh
học làm tổn thơng các phân tử đó.
- Tác dụng gián tiếp: bức xạ ion hoá tác dụng lên các phân tử nớc (chiếm 85 -
95% trọng lợng tế bào) với ion H
+
, OH
-
, tạo ra các gốc tự do OH

, H

và các sản
phẩm oxy hoá mạnh nh H
2
O
2
chúng có khả năng hoạt động rất mạnh về mặt hoá
học, do đó nó công phá các phân tử sinh học làm thay đổi cấu trúc chức năng của
10
chúng. Nếu những tổn thơng hoá sinh không phục hồi đợc sẽ kéo theo những tổn th-
ơng chuyển hoá dẫn đến những tổn thơng hình thái và chức năng [7].
Công tác chọn giống và tạo giống mới có vai trò hết sức quan trọng trong việc
nâng cao năng suất và chất lợng cây trồng đặc biệt là cây lơng thực. Chính công tác
này đã đóng vai trò quyết định trong cuộc cách mạng xanh trong những năm 1960 ở
ấn Độ và nhiều nớc khác trên thế giới [7]. Một trong những thành tựu nổi bật nhất
của thế kỷ 20 là khám phá ra phơng pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực
nghiệm. Với kết quả của hơn 60 nớc đã thu đợc chứng tỏ đây là một phơng pháp có

thực nghiệm ở một số cây chồng, cho năng suất cao, chất lợng tốt và chống chịu đợc
các điều kiện bất lợi của môi trờng, nh giống lúa (A- 20, DT10, DT11, DT13, DT33,
Xuân số 5, Xuân số 6, Tép hành đột biến), giống lạc (V79, 4329, A329, DT332..),
giống ngô (DT-6, DT-8..), đậu tơng ( M103, DT83, DT84, DT90, V48..), cà chua
(Hồng Lan..)...[17, 25, 35].
Gần đây Nguyễn Minh Công và CS (1999) [4] đã tạo đợc giống Tám Thơm
đột biến không cảm quan, có thể cấy đợc cả hai vụ. Phạm Văn Chơng, 2001) [5]
cũng thông báo chọn tạo đợc ba giống lúa BM9855, LT2 và Khao 85 đột biến không
cảm quang, gieo cấy đợc cả hai vụ, có chất lợng gạo cao (hạt gạo trong, dài, ngon
cơm...), năng xuất khá. Riêng giống Khao 85 hiện nay là giống lúa duy nhất ở miền
Bắc Việt Nam đạt tiêu chuẩn quốc tế về gạo xuất khẩu chất lợng cao. Giống LT2 đ-
ợc xếp vào loại giống lúa đặc sản của Việt Nam .
Chơng 2. đối tợng và phơng pháp nghiên cứu
2.1. đối tợng nghiên cứu
1. Đối tợng nghiên cứu tính đa hình ADN là 20 giống lúa Tám có nguồn gốc
khác nhau đợc trình bày ở bảng 2.
2. Đối tợng dùng nghiên cứu chọn dòng đột biến là 4 giống lúa: Tám Xoan,
Tám ấp Bẹ, Dự Thơm và Tẻ Di Hơng.
Tất cả các giống lúa này đợc Trung tâm Tài nguyên di truyền thực vật thuộc
Viện Khoa học Kỹ Thuật Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.
- Nguồn chiếu xạ tia gamma từ nguồn Co
60
đợc tiến hành tại Trung tâm
chiếu xạ Quốc gia Từ Liêm, Hà Nội.
- Thiết bị sử dụng: máy ly tâm lạnh (Sigma), máy PCR (Thermal Cycler PTC
100 hãng MJ), máy điện di (Biorad), máy đo quang phổ Model 8425A (Hewlett
12
Packard), máy chụp ảnh Gel Doc (Pharmacia), máy chụp ảnh (Polaroid), dàn cây,
buồng tối và bình nuôi cấy.
Bảng 1: Đặc điểm nông học của các giống lúa nghiên cứu chọn dòng đột biến

chống đổ kém
Thân mềm,
chống đổ kém
Chống đổ
trung bình
-
Bảng 2: Nguyên liệu 20 giống lúa dùng để phân tích đa hình ADN
Số thứ tự Số đăng ký Tên giống
1 GB0310 Tám Thơm Hà Đông
2 GB0311 Tám Xoan Hải Dơng
3 GB0312 Tám Xoan Hải Dơng
4 GB0313 Tám Xoan Có Râu Hải Dơng
5 GB0314 Tám Xoan Bắc Ninh
6 GB0315 Tám Xoan
7 GB0316 Tám Nghệ Hạt Đỏ
8 GB0317 Tám Xoan Vĩnh Phúc
9 GB0318 Tám Nhỡ Bắc Ninh
10 GB0319 Tám Nhỡ Vĩnh Phúc
13