Header Page 1 of 258.
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Trần Thị Sao Mai

NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH
CÁC ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN
TRONG THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 62420107

(DỰ THẢO) TÓM TẮT LUẬN ÁN
TIẾN SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2014
Footer Page 1 of 258.


Header Page 2 of 258.
Công trình đƣợc hoàn thành tại:
Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. NGUYỄN THỊ KHÁNH TRÂM
2. TS. LÊ QUANG HÒA

Phản biện : .........................................................................
Phản biện : .........................................................................

phổ biến nhất. S. aureus là vi khuẩn hình cầu, Gram dƣơng, phân bố rải rác
trong tự nhiên nhƣng chủ yếu đƣợc phân lập từ da, tóc, màng nhày, mũi của
ngƣời và gia súc. Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu đƣợc định nghĩa là sự tiêu
thụ các độc tố đƣờng ruột, vốn đã tồn tại sẵn trong thực phẩm, do các chủng
tụ cầu có coagulase dƣơng tính, đặc biệt là S. aureus tổng hợp nên.
Các phƣơng pháp phân tích độc tố ruột tụ cầu (Staphylococcus
Enterotoxin – SE) trong thực phẩm hiện nay còn nhiều bất cập do tính phức
tạp trong sử dụng, giá thành cũng nhƣ yêu cầu về trang thiết bị. Phƣơng pháp
tiêu chuẩn để phát hiện SE trong thực phẩm hiện nay là phƣơng pháp
ELISA. Trên thị trƣờng thế giới hiện nay có nhiều bộ sinh phẩm để phát hiện
các SE trong thực phẩm nhƣ TRANSIA, RIDASCREEN, TECRA và
VIDAS. Nguyên tắc của các bộ sinh phẩm này đều dựa trên kỹ thuật ELISA
kẹp đôi. Toàn bộ quy trình phân tích này thƣờng kéo dài từ 90 phút đến 4
giờ. Ngƣỡng phát hiện của các bộ sinh phẩm này thƣờng dao động từ 0,1-5
ng/g hoặc ml mẫu tùy thuộc vào loại thực phẩm phân tích. Tuy nhiên, một
trong những nhƣợc điểm cơ bản của các bộ sinh phẩm này là cần một máy
đọc ELISA chuyên dụng để phân tích kết quả. Yêu cầu này hạn chế đáng kể
khả năng phân tích hiện trƣờng của các bộ sinh phẩm. Mặt khác, giá thành
của các bộ sinh phẩm nhập ngoại rất đắt, quy trình phân tích khá phức tạp.
Xu hƣớng trên thế giới hiện nay là phát triển các phƣơng pháp phân tích
1

Footer Page 3 of 258.


nhanh, dễ sử dụng để phân tích sàng lọc một số lƣợng lớn mẫu ngay tại hiện
trƣờng. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới đã thành công trong việc
phát triển que thử phát hiện SE dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch nhằm đơn
giản hóa và rút gọn thời gian phân tích xuống còn 30 phút. Hơn nữa, tại Việt
Nam việc kiểm định an toàn thực phẩm phần lớn mới chỉ dừng lại ở việc


Footer Page 4 of 258.

2


đƣợc chúng tôi chủ động tạo ra. Kết quả của đề tài luận án góp phần vào việc
kiểm soát tốt hơn các độc tố ruột tụ cầu, qua đó giảm thiểu các vụ NĐTP và
số ngƣời bị NĐTP do tụ cầu vàng gây ra, nâng cao sức khỏe cộng đồng.
Điểm mới của luận án
Kết quả nghiên cứu nổi bật của đề tài luận án là đã tạo ra que thử phát
hiện đƣợc các SE từ SEA đến SEE qua việc sản xuất đƣợc kháng nguyên tái
tổ hợp SEA, SEC1 và việc sản xuất, tinh sạch đƣợc kháng thể lòng đỏ trứng
gà (IgY) kháng BSA, kháng thể IgY kháng các đƣợc tố ruột tụ cầu (SEA,
SEB, SEC1, SED, SEE).
Cấu trúc của luận án
Ngoài phần mở đầu và kết luận, kiến nghị, luận án gồm 3 chƣơng:
- Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu nghiên cứu
- Chƣơng 2: Đối tƣợng, vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
- Chƣơng 3: Kết quả nghiên cứu và bàn luận
- Phần phụ lục: Một số kết quả và hình ảnh nghiên cứu

Header Page 5 of 258.

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỤ CẦU KHUẨN
1.1.1. Đặc điểm sinh học của tụ cầu khuẩn
Tụ cầu khuẩn còn gọi là tụ cầu vàng - Staphylococcus aureus là những
cầu khuẩn có đƣờng kính từ 0,8-1,0 μm và xếp lại với nhau thành hình chùm
nho, bắt màu Gram dƣơng, coagulase và catalase dƣơng tính, không có lông,

Hoạt tính sinh học của SE bao gồm hoạt tính siêu kháng nguyên
(superantigen) và hoạt tính gây nôn. Hoạt tính siêu kháng nguyên: gây sốt,
kích hoạt hệ miễn dịch và tăng nhanh số lƣợng tế bào T không chuyên biệt.
1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU
1.3.1 Phép thử sinh học
Nguyên tắc của các phép thử sinh học dựa trên việc phân tích khả năng
gây các triệu chứng điển hình nhƣ nôn, tiêu chảy trên các động vật thí
nghiệm hoặc hoạt động siêu kháng nguyên trong nuôi cấy tế bào. Liều lƣợng
SE tối thiểu cần sử dụng là khoảng 200 ng [80].
1.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
Các phản ứng PCR thƣờng dùng là uniplex và multiplex PCR và gần
đây là real-time PCR [24, 40, 85].
1.3.3. Phƣơng pháp miễn dịch
Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất hiện nay để phát hiện SE
trong thực phẩm là các phƣơng pháp miễn dịch. Những phƣơng pháp này
bao gồm: phƣơng pháp khuếch tán trên gel, phƣơng pháp ngƣng kết hạt latex
– RPLA sử dụng các bộ kit RPLA và phƣơng pháp ELISA [40].
1.4. KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG

Footer Page 6 of 258.

4


1.4.1. Cấu trúc và phân loại của hệ thống sắc ký miễn dịch
Header
Page 7 of 258.

Cấu trúc của hệ thống sắc ký miễn dịch (HTSKMD) thƣờng gồm các
hợp phần đƣợc biểu diễn trong Hình 1.1 dƣới đây [69]:


cặp với cả 5 loại kháng nguyên trên.
- Sắc ký miễn dịch cạnh tranh:
+ Dạng 1: tại vị trí vạch thử nghiệm, kháng nguyên (hoặc một biến thể
của kháng nguyên) đƣợc cố định. Nếu độc tố có mặt trong mẫu phân tích,
chúng sẽ tƣơng tác với kháng thể cộng hợp tạo thành phức hợp kháng
nguyên-kháng thể cộng hợp. Dƣới tác dụng của lực mao quản, dung dịch sẽ
chuyển động lên trên que thử đi về phía vùng chứa kháng nguyên cố định.
Phức hợp kháng nguyên-kháng thể cộng hợp khi chuyển động đến vị trí vạch
thử nghiệm sẽ không bị giữ lại do các vị trí liên kết đặc hiệu của kháng thể
đã bị bão hòa bởi kháng nguyên trong mẫu phân tích. Do đó, sự không xuất
hiện của vạch thử nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử chứa độc tố đƣờng
ruột tụ cầu. Nhƣ vậy, trong trƣờng hợp dƣơng tính, có độc tố trong mẫu phân
tích, thì sẽ xuất hiện một vạch màu ở vị trí vạch kiểm chứng. Ngƣợc lại, mẫu
âm tính sẽ có hai vạch màu ở cả vị trí vạch thử nghiệm và vạch kiểm chứng.
+ Dạng 2: Tại vị trí vạch thử nghiệm một kháng thể có khả năng bắt
cặp với kháng nguyên cần phân tích đƣợc cố định. Trong trƣờng hợp này,
cộng hợp sẽ là kháng nguyên gắn với hạt nano vàng hoặc nano carbon. Nếu
độc tố không có mặt trong mẫu phân tích thì khi dung dịch chuyển động lên
trên que thử đi về phía vùng chứa các kháng thể cố định, kháng nguyên cộng
hợp sẽ tƣơng tác với kháng thể tạo thành phức hợp kháng thể - kháng
nguyên cộng hợp có màu ở vị trí vạch thử nghiệm. Sự xuất hiện vạch thử
nghiệm đồng nghĩa với việc mẫu thử không chứa độc tố ruột của tụ cầu.
Ngƣợc lại, nếu trong mẫu phân tích có độc tố ruột tụ cầu thì chúng cạnh
tranh với kháng nguyên cộng hợp về việc bị giữ lại ở vị trí vạch thử nghiệm.
Chính vì vậy, sự không xuất hiện vạch màu đồng nghĩa với việc mẫu thử có
chứa độc tố ruột tụ cầu.
Trong luận án này, chúng tôi đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký miễn
dịch cạnh tranh dạng 2 để ứng dụng sản xuất que thử phát hiện 5 loại độc tố
(SEA-SEE) trong thực phẩm. Các ƣu điểm của phƣơng pháp sắc ký miễn

1.6. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU
1.6.1. Sản xuất độc tố ruột tụ cầu từ S. aureus và từ phƣơng pháp tái tổ
hợp
Việc sản xuất độc tố tái tổ hợp biểu hiện trên E. Coli các độc tố ruột tụ
cầu ở dạng dung hợp với đuôi His hoặc đuôi GST nên có thể giúp đơn giản
hóa quy trình tinh sạch. Năm 2012, nhóm nghiên cứu của chúng tôi cũng đã
sản xuất thành công độc tố SEA tái tổ hợp với đuôi GST. Vector đƣợc sử
dụng là pGEX-6P-1 và chủng E. Coli BL21 để biểu hiện protein. Sau khi

Footer Page 9 of 258.

7


tinh sạch bằng bộ kit GST SpinTrap, protein tƣơng ứng có kích thƣớc 53
kDa ở dạng dung hợp với GST đã đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di
SDS-PAGE [3].

Header Page 10 of 258.

1.6.2. Phƣơng pháp tinh sạch độc tố ruột tụ cầu
Đã có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong việc tinh sạch SE nuôi
trực tiếp từ tụ cầu vàng: tinh sạch bằng trao đổi ion, lọc gel, sắc ký, điện
phân, sắc ký Dye ligand, HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) và FPLC (sắc
ký lỏng nhanh protein). Phƣơng pháp sắc ký ái lực có thể cho phép thu
protein đích bằng một bƣớc duy nhất, với độ tinh sạch lên tới hơn 90%. Đuôi
His có ái lực cao với Ni2+ do có vòng thơm imidazole, vì thế protein dung
hợp với đuôi His đƣợc giữ lại trên cột sắc ký chứa các hạt resin có gắn Ni2+,
còn những protein không mong muốn sẽ ra khỏi cột này.
CHƢƠNG 2

Các máy và thiết bị chuyên dụng nhƣ máy ly tâm, tủ ổn nhiệt, bộ điện
di,… có ngồn gốc từ Mỹ, Đức và Trung Quốc.
2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn S.aureus
Sử dụng các chất tẩy rửa (SDS, CTAB) và chloroform làm biến tính
thành tế bào, protein dạng Histon và polysaccharide của S. aureus. Sau đó bổ
sung lysozyme, protease K phá vỡ thành tế bào và liên kết peptid . Bổ sung
EDTA ức chế hoạt động của Dnase và nồng độ muối CH3COONa cao hỗ trợ
cho việc kết tủa DNA. Sau khi ly tâm, hút lớp dung môi phân cực phía trên
chứa DNA và thêm ethanol 1000, 1 giờ, nhiệt độ phòng. DNA kết tủa thu
đƣợc sau khi ly tâm tiếp tục đƣợc rửa trong ethanol 700 trƣớc khi hòa tan
trong đệm TE (Tris-EDTA).
2.3.2. Kỹ thuật PCR
Gen sec1 đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc
hiệu (SEC-F và SEC-R) có gắn vị trí cắt của 2 enzyme giới hạn BamHI và
HindIII. Trong đó, các thành phần của phản ứng PCR đã đƣợc chuẩn hóa với
tổng thể tích là 50 µl và chu trình nhiệt nhƣ sau: biến tính ở 950C, 4 phút và
quá trình nhân bản với 35 chu kỳ, kéo dài thêm ở 720C, 5 phút và bảo quản
ở 100C. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc: biến tính ở 950C, 30 giây, gắn mồi ở 550C,
30 giây và kéo dài chuỗi ở 720C, 1 phút. Sản phẩm PCR sau khi tổng hợp
đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose.
2.3.3. Thu nhận DNA từ gel agarose
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng kit tinh sạch GeneJET Gel Extraction
Kit (Fermentas) theo phƣơng pháp của nhà sản xuất.

Header Page 11 of 258.

Footer Page 11 of 258.

9

2.3.9. Phƣơng pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE)
Điện di biến tính protein bằng SDS-PAGE (12,5%) đƣợc tiến hành
theo các phƣơng pháp của Laemmli.
2.3.10. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
Để đánh giá lƣợng SEA trong dịch chiết protein thô, phƣơng pháp
ELISA kẹp đôi đã đƣợc sử dụng.
2.3.11. Phƣơng pháp định lƣợng protein bằng OD

Footer Page 12 of 258.

10


Nguyên tắc của phƣơng pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím
cực đại ở bƣớc sóng 280nm.

Header Page 13 of 258.

2.3.12. Phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà
Gây miễn dịch cho gà để sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và
kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE)
theo quy trình sản xuất kháng thể IgY đặc hiệu của Agro-Bio 2011.
2.3.13. Phƣơng pháp tinh sạch kháng thể IgY gây kết tủa phân đoạn
bằng PEG
Tinh sạch kháng thể bằng phƣơng pháp gây kết tủa phân đoạn bằng
PEG 6000 theo mô tả của Polson 1980.
2.3.14. Phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng pha loãng trong nƣớc, chỉnh
pH và gây kết tủa bằng Natri clorua
Tinh sạch theo phƣơng pháp pha loãng trong nƣớc chỉnh pH và gây
kết tủa bằng Natri clorua đƣợc Petr Hokder tối ƣu hóa năm 2013.

vạch, kết quả dƣơng tính ứng với việc không xuất hiện vạch tại vị trí vạch in
kháng thể.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU
3.1.1. Sản xuất và tinh chế protein tái tổ hợp SEA
3.1.1.1. Biến nạp plasmid mang gen mã hóa SEA vào tế bào E.Coli
Plasmid pGEX-6P-1-sea mang gen mã hóa SEA đƣợc biến nạp vào tế bào E.
coli khả biến bằng phƣơng pháp sốc nhiệt trên môi trƣờng LB có bổ sung
ampicillin
3.1.1.2.Chọn dòng các chủng mang gen mã hóa SEA
Sau khi tiến hành biến nạp và thu nhận các dòng tế bào E. coli đƣợc
chuyển gen, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc các dòng tế bào E. coli để chọn
ra những dòng tạo độc tố ruột SEA nhiều nhất bằng việc sử dụng kỹ thuật
ELISA kẹp đôi để đánh giá lƣợng SEA đƣợc tạo ra trong canh trƣờng nuôi
cấy. Sau khi chọn đƣợc 5 dòng khuẩn lạc cho khả năng sinh SEA cao nhất,
chúng tôi tiến hành lặp lại quy trình trên có tính đến nồng độ protein trong
mỗi mẫu để tìm ra khuẩn lạc có khả năng sinh SEA cao nhất là dòng tế bào
số 2.
3.1.1.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp SEA
Tiến hành khảo sát trên ba yếu tố là nhiệt độ, nồng độ chất cảm ứng và
thời gian cảm ứng, lựa chọn nuôi ở hai nhiệt độ là 300C và 160C. Quy trình
nuôi cũng đƣợc tiến hành tƣơng tự nhƣ trong quá trình sàng lọc, nuôi tế bào
trong môi trƣờng LB lỏng tới khi đạt OD600 = 0.8 thì thêm chất cảm ứng
IPTG với các nồng độ tƣơng ứng là 0,25mM, 0,5mM và 1mM, sau đó tiến
hành lấy mẫu ở các mốc thời gian: với nhiệt độ 300C, thời gian lấy mẫu là
2h, 5h, 7h; với nhiệt độ là 160C, thời gian lấy mẫu là 12h, 16h,19h.

Footer Page 14 of 258.


13


Header Page 16 of 258.

3.1.2. Sản xuất và tinh chế protein tái tổ hợp SEC1
3.1.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ Staphylococcus aureus
Hình ảnh điện di kiểm tra kích thƣớc DNA tổng số của chủng
Staphylococcus aureus cho thấy có 1 băng sáng rõ có kích thƣớc lớn ở trên
cao chính là DNA tổng số của S. aureus. Điều này chứng tỏ DNA tổng số
sau khi tách chiết không bị đứt gãy, còn nguyên vẹn nên đƣợc chúng tôi
dùng làm khuôn trong phản ứng PCR khuếch đại gen sec1.
Hình 3.3. Điện di đồ DNA tổng số
của chủng Staphylococcus aureus
Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn 1kb;
1-5: DNA tổng số S.aureus
3.1.2.2. Kết quả khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR
Từ cơ sở nguồn DNA tổng số tách từ chủng S.aureus, chúng tôi tiến
hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R để
khuếch đại gen sec1 khoảng 801 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra
trên gel agarose 1,2%.
Hình 3.4.Điện di đồ sản phẩm PCR
trên gel agarose 1,2%
Ghi chú: Kênh M: Thang DNA
chuẩn 1kb; 1, 2: Đoạn gen sec1

Kết quả điện di cho thấy với cặp mồi đặc hiệu SEC-F và SEC-R đã
thu đƣợc đoạn DNA đặc hiệu, rõ nét không có vạch phụ k m theo, có kích
thƣớc khoảng 801 bp, đúng với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi. Do
vậy, sản phẩm PCR này đƣợc chúng tôi sử dụng cho nghiên cứu tiếp theo.

đó, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp trên môi trƣờng có ampicillin. Để nghiên
cứu sự biểu hiện của protein tái tổ hợp, vi khuẩn sau khi biến nạp thành
công đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicillin,
lắc với tốc độ 150 vòng/phút, ở 370C cho đến khi OD600 đạt 0,6-0,8 thì bổ
sung thêm chất cảm ứng IPTG với nồng độ 1mM và nuôi tiếp ở 300C trong
5 giờ. Protein tổng số của dịch chiết tế bào đã đƣợc phân tích trên gel
polacrylamide và cho thấy sự xuất hiện của một băng protein với cƣờng độ
đậm, có trọng lƣợng phân tử trong khoảng từ 42,7– 66,2 kDa khi so sánh
với thang protein chuẩn, kết quả này là phù hợp với protein SEC1 mà chúng
tôi đã tính toán trên lý thuyết.

Footer Page 17 of 258.

15


Header Page 18 of 258.

Hình 3.6. Điện di đồ biểu hiện gen
SEC1 trong protein tổng số của các
tế bào E.coli BL21
Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1:
Đối chứng âm (protein tổng số trong
dịch chiết dòng khuẩn lạc E.coli
BL21); 2: Protein trong dịch chiết
dòng E. coli đã biến nạp được cảm
ứng IPTG.

3.1.2.5. Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen sec1
Để xác định đƣợc điều kiện tối ƣu, chúng tôi đã tiến hành thử biểu

Header Page 19 of 258.

Hình 3.8. Điện di đồ protein SEC1 tái
tổ hợp sau tinh sạch
Ghi chú:
Kênh 1,4 : Protein trước khi tinh sạch;
Kênh 2,3: Protein sau khi tinh sạch;
M: Marker.

3.2. CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IGY
3.2.1. Kết quả tinh sạch kháng thể IgY
Chúng tôi lựa chọn tách chiết IgY bằng hai phƣơng pháp sau: phƣơng
pháp tách phân đoạn bằng nƣớc và muối natri clorua đã đƣợc tối ƣu hóa
năm 2013 [ 6 5 ] và phƣơng pháp gây kết tủa phân đoạn bởi PEG [27].
Đây là những phƣơng pháp có quy trình đơn giản, hiệu quả, dễ thực hiện,
xử lý mẫu đơn giản, sản lƣợng tách chiết và độ tinh sạch IgY c a o , đang
đƣợc áp dụng phổ biến trong nhiều nghiên cứu [77]. Chúng tôi so sánh hai
phƣơng pháp tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng này để lựa chọn phƣơng pháp
phù hợp cho tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà. Kết quả điện di của cả hai
phƣơng pháp đều cho thấy hình ảnh IgY gồm hai băng đậm, rõ nét có khối
lƣợng phân tử tƣơng ứng với khối lƣợng phân tử của chuỗi nặng (khoảng
67kDa) và chuỗi nhẹ (khoảng 25 kDa), ngoài ra trên các đƣờng điện di vẫn
còn các vạch khác rất mờ. Do vậy, có thể kết luận rằng đã tách chiết thành
công kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà với độ tinh sạch khá cao. Tuy
nhiên, khi so sánh hình ảnh điện di IgY của đƣờng số 1 và đƣờng số 2 cho
thấy vạch protein tạp không phải kháng thể ở đƣờng số 1 ít hơn so với
đƣờng số 2, điều này chứng tỏ phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng tách phân
đoạn nƣớc và NaCl có độ tinh sạch cao hơn so với phƣơng pháp pháp kết
tủa phân đoạn bởi PEG.



18


Kháng thể gắn lên vạch kiểm chứng là kháng thể đa dòng kháng BSA
đƣợc tách chiết và tinh sạch từ lòng đỏ trứng gà. Tiến hành pha loãng IgY tới
các nồng độ 0,1; 0,3; 1 µg/µl và in lên màng nitrocellulose với liều lƣợng
1µl/cm. Chúng tôi sử dụng nồng độ kháng thể đơn dòng là 0,3 μg/μl để in
màng với liều lƣợng là 1 μl/cm.

Header Page 21 of 258.

Hình 3.11. Lựa chọn lượng kháng
thể đa dòng kháng BSA để cố định lên vạch
kiểm chứng.
1. Nồng độ kháng thể là 400 ng /que thử
2. Nồng độ kháng thể là 120 ng /que thử
3. Nồng độ kháng thể là 40 ng /que thử

1

2

3

3.3.2. Xác định lƣợng kháng thể cần cố định lên vạch thử nghiệm
Chúng tôi đã sử dụng kháng thể lòng đỏ trứng IgY từ lô gà tiêm 5 loại
độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+ D+E), sau khi tinh sạch bằng phƣơng pháp
tách phân đoạn nƣớc và NaCl, đƣợc tinh sạch tiếp bằng cột sắc ký in lên
vạch thử nghiệm của que thử. Pha loãng kháng thể tới các nồng độ 5; 1,5;

3.3.4. Xác định độ nhạy phát hiện của que thử với 5 loại độc tố
Chúng tôi đã chuẩn bị các mẫu kháng nguyên SEA, SEB, SEC1,
SED và SEE với nồng độ ban đầu là: 1000ng/ml rồi tiến hành pha loãng đến
các nồng độ 300 ng/ml, 100 ng/ml, 30 ng/ml, 10 ng/ml, 3 ng/ml và 1 ng/ml.
Các kết quả thí nghiệm với từng độc tố cho thấy:
Với SEA, SEB và SED khi phân tích bằng mắt thƣờng, độ nhạy phát
hiện của que thử là khoảng 30-100 ng/ml.

Hình 3.14. Thử độ nhạy của que thử với SEA, SEB, SED trong đệm
Ghi chú: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1
ng/ml và mẫu âm tính không chứa SEA.

Footer Page 22 of 258.

20


Header Page 23 of 258.

Với SEC1, SEE độ nhạy phát hiện của que thử là khoảng 10-30 ng/ml.

Hình 3.15. Thử độ nhạy của que thử với SEC1
Ghi chú: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1
ng/ml và mẫu âm tính không chứa SEC1.
Ứng dụng que thử phát hiện SEA-SEE trong sữa
Chúng tôi áp dụng kết quả của lƣợng kháng nguyên cộng hợp cho mẫu
âm tính là 3 µl để thử nghiệm với các nồng độ sữa pha loãng khác nhau
nhằm tìm ra nồng độ sữa pha loãng thấp nhất mà vẫn đảm bảo mẫu âm tính
xuất hiện vạch.


ng/ml.

Hình 3.18. Thử độ nhạy của que thử với SEC1 trong sữa
Ghi chú: 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30;
9; 3 ng/ml, mẫu âm tính sữa không chứa SEC1.

Footer Page 24 of 258.

22


Header Page 25 of 258. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN
Nghiên cứu của đề tài luận án đã đã đạt đƣợc các kết quả sau:
1. Đã thiết kế thành công vector biểu hiện pGS-21a-sec1 mang gen mã hóa
cho độc tố ruột tụ cầu SEC1.
2. Đã biến nạp thành công plasmid pGEX-6P-1-sea mang gen mã hóa SEA
và plasmid pGS-21a- sec1 mang gen mã hóa độc tố ruột tụ cầu vào tế bào
E. coli BL21. Đã sàng lọc đƣợc dòng tế bào E. coli có khả năng sinh SEA
và SEC1 cao.
3. Đã xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy phù hợp cho sinh tổng hợp SEA và
SEC1: nhiệt độ 30oC; nồng độ chất cảm ứng IPTG với SEA là 1 mM,
còn với SEC1 là 0,3 mM; thời gian cảm ứnglần lƣợt là 5 giờ và 8 giờ. Đã
tinh sạch SEA tinh khiết ở dạng dung hợp với GST, SEC1 ở dạng dung
hợp với đuôi GST và 2 vùng đuôi His.
4. Đã sản xuất và tinh sạch kháng thể lòng đỏ trứng IgY kháng BSA và
kháng thể IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE (A+B+C1+ C2+ D+E) từ
gà Leghorn trắng với độ tinh sạch và hiệu suất thu hồi cao.
5. Đã tạo thành công que thử phát hiện các độc tố ruột tụ cầu với độ nhạy