ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Sao Mai
NGHIÊN CỨU TẠO QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH
CÁC ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU KHUẨN
TRONG THỰC PHẨM
Chuyên ngành: 
62420107
 
 - 2014


gi Vit Nam làm ng ln sc khi và
kinh t xã h   n lý thc phm và c phm Hoa K
(FDA), hin ti m gii vn có khong 76 triu ca ng c
thc phi phi nhp vin và khong 5 nghìn
i chcó th t hóa cht, vi sinh
vc t t nhiên hon t thc t
các v   y ra cho thy nguyên nhân chính là do thc phm b
nhim vi sinh vt. Trong s các tác nhân t vi sinh v   
Staphylococcus aureus (S.areus) là mt trong nhng vi khun gây ng c
ph bin nht. S. aureus là vi khun hình cu, G ri rác
trong t  yc phân lp t a
i và gia súc. 

S. aureus 
          (Staphylococcus
Enterotoxin – SE) 

     SE        
ELISA. 
      TRANSIA, RIDASCREEN, TECRA và


. Ngá0,1-5
 
 

.  thành

        
2

 tài lun án i quyt hn ch này. Vic to ra que th n
c các SE vi thi gian phân tích ngn, d s dng, thích hp
vi các phân tích hing không cn các thit b phc tt tin. Các
nguyên li sn sut que th (các kháng nguyên và kháng thu
3

c chúng tôi ch ng to ra. Kt qu c tài lun án góp phn vào vic
kim soát tc t rut t cm thiu các v  và
s i b  cu vàng gây ra, nâng cao sc khe cng.
Điểm mới của luận án
Kt qu nghiên cu ni bt c tài lun án là o ra que th phát
hic các SE t n SEE qua vic sn xut c kháng nguyên tái
t hp SEA, SEC1 và vic sn xut, tinh sch c kháng th  trng
gà (IgY) kháng BSA, kháng th c t rut t cu (SEA,
SEB, SEC1, SED, SEE).
Cấu trúc của luận án
Ngoài phn m u và kt lun, kin ngh, lun án g:
- ng quan tài liu nghiên cu
- ng, vt liu
- t qu nghiên cu và bàn lun
- Phn ph lc: Mt s kt qu và hình nh nghiên cu

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. T CU KHUN
1.1.1. Đặc điểm sinh học của tụ cầu khuẩn
T cu khun còn gi là t cu vàng - Staphylococcus aureus là nhng
cu khung kính t 0,8-1,0 m và xp li vi nhau thành hình chùm
nho, b,
không có v, không sinh nha bào [1].
1.1.2. Những yếu tố ảnh hƣởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu vàng

Hot tính sinh hc ca SE bao gm hot tính siêu kháng nguyên
(superantigen) và hot tính gây nôn. Hot tính siêu kháng nguyên: gây st,
kích hot h min d ng t bào T không chuyên bit.
1.3. C T RUT T CU
1.3.1 Phép thử sinh học
Nguyên tc ca các phép th sinh hc da trên vic phân tích kh 
gây các triu ch      y   ng vt thí
nghim hoc hong siêu kháng nguyên trong nuôi cy t bào. Ling
SE ti thiu cn s dng là khong 200 ng [80].
1.3.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
Các phn ng PCR thng dùng là uniplex và multiplex PCR và gn
ây là real-time PCR [24, 40, 85].
1.3.3. Phƣơng pháp miễn dịch
   c s dng nht hi   phát hin SE
trong thc ph n dch. Nh
bao gm: ph pháp khuch tán trên gel,
ng
pháp t ht latex
 RPLA s dng các b kit RPLA  [40].

1.4. K THUT SC KÝ MIN DCH VÀ NG DNG
5

1.4.1. Cấu trúc và phân loại của hệ thống sắc ký miễn dịch
Cu trúc ca h thng sc ký min dng gm các
hp phc biu din trong Hình 1.1 9]:

Hình 1.1. Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịch
K thut sc ký min dc chia làm hai loi chính là sc
ký min dch kc ký min dch cnh tranh.


 

+ 




             - kháng
nguy
            

 


án 
  
(SEA-SEE) trong  .    
7


1
, SED, SEE bao
:  n hóa quy trình phát trin que th do ch cn s dng mt
kháng th.
1.4.2. Một số nghiên cứu chế tạo que thử để phát hiện độc tố ruột tụ cầu
trong thực phẩm

            
 [19]. 

trc tip t t cu vàng: tinh sch b i ion, lc gel, s n
phân, sc ký Dye ligand, HPLC (sc ký lng hic
ký lng nhanh protein).   sc ký ái lc có th cho phép thu
ng mc duy nht, v tinh sch lên t 
His có ái lc cao vi Ni
2+
 protein dung
hp vc gi li trên ct sc ký cha các ht resin có gn Ni
2+
,
còn nhng protein không mong mun s ra khi ct này.

CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NG NGHIÊN CU
- Các SE (SEA, SEB, SEC, SED và SEE) 
- Gà Leghorn trng, 1 ngày tui, cân nng 35-40g, có ngun gc t
Công ty c phn ging gia cm Ba Vì.
- Kháng th  trng IgY c t trng gà Leghorn trng t
nuôi và c gây min dch bc t rut t cu và BSA.

2.2. VT LIU NGHIÊN CU
2.2.1. Vi sinh vật và plasmid
- T bào S.aureus c cung cp bi phòng Vi sinh,
Ving Quc gia.
- T bào vi khun E. coli kh bin BL21 mua ca Biolab.
- Plasmid pGEX-6P-1-sea, mang gen mã hóa SEA  dng dung hp
v   -S- c cung cp bi phòng công
ngh gen, Vin Công ngh Sinh hc và Công ngh Thc ph i hc
Bách Khoa Hà Ni.

--Bam
Hindn ca phn c chun hóa vi
tng th tích là 50 µl và chu trình nhit n tính  95
0
C, 4 phút và
quá trình nhân bn vi 35 chu k, kéo dài thêm  72
0
o qu

0
C. Mi chu k gc: bin tính  95
0
C, 30 giây, gn mi  55
0
C,
30 giây và kéo dài chui  72
0
Sn phm PCR sau khi tng hp
c kim tra bn di trên gel agarose.
2.3.3. Thu nhận DNA từ gel agarose
Sn phc tinh sch bng kit tinh sch GeneJET Gel Extraction
a nhà sn xut.
10

2.3.4. Phƣơng pháp cắt DNA bằng enzyme giới hạn và nối với vector tạo
dòng
Gen sec1 (sn phm PCR sau khi tinh s c ct bng enzyme
gii hn là BamHI và HindIII và kim tra bn di trên gel
agarose 0,8%.
Sau khi làm tan các hóa cht (tr T4 DNA ligase)  nhi ng,

xut.
2.3.9. Phƣơng pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE)
n di bin tính protein bng SDS-  c tin hành
a Laemmli.
2.3.10. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
           
.
2.3.11. Phƣơng pháp định lƣợng protein bằng OD
11

Nguyên tc cp th tia cc tím
ci  c sóng 280nm.
2.3.12. Phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà
Gây min dch cho gà  sn xut kháng th IgY kháng BSA và
kháng th c t rut t cu (SEA, SEB, SEC1, SED, SEE)
theo quy trình sn xut kháng th c hiu ca Agro-Bio 2011.
2.3.13. Phƣơng pháp tinh sạch kháng thể IgY gây kết tủa phân đoạn
bằng PEG
Tinh sch kháng th bt tn bng
PEG 6000 theo mô t ca Polson 1980.
2.3.14. Phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng pha loãng trong nƣớc, chỉnh
pH và gây kết tủa bằng Natri clorua
Tinh sch theo  trong c chnh pH và gây
kt ta bng c Petr Hokder t.
2.3.15. Phƣơng pháp tinh sạch IgY bằng cột “ Hi Trap IgY Purification
HP”
Tinh sng dn ca nhà sn xut GE Healthcare Bio-
Sciences AB.
2.3.16. Cố định IgY kháng BSA và IgY kháng các độc tố ruột tụ cầu SE
(A+B+C1+D+E) lên màng nitrocelullose

3.1.1.2.Chọn dòng các chủng mang gen mã hóa SEA
Sau khi tin hành bin np và thu nhn các dòng t bào E. coli c
chuyn hành sàng lc các dòng t bào E. coli  chn
ra nhng dòng tc t rut SEA nhiu nht bng vic s dng k thut
ELISA k c tng nuôi
cy. Sau khi chc 5 dòng khun lc cho kh t,
chúng tôi tin hành lp li quy trình trên có tínn n protein trong
mi m tìm ra khun lc có kh t là dòng t bào
s 2.
3.1.1.3. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp SEA
Tin hành kho sát trên ba yu t là nhi, n cht cm ng và
thi gian cm ng, la chn nuôi  hai nhi là 30
0
C và 16
0
C. Quy trình
c ti c, nuôi t bào
ng LB lng tt OD
600
= 0.8 thì thêm cht cm ng
IPTG vi các n in
hành ly mu  các mc thi gian: vi nhi 30
0
C, thi gian ly mu là
2h, 5h, 7h; vi nhi là 16
0
C, thi gian ly mu là 12h, 16h,19h.
13
3.1.2. Sản xuất và tinh chế protein tái tổ hợp SEC1
3.1.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ Staphylococcus aureus
Hình  n di ki   c DNA tng s ca chng
Staphylococcus aureus cho thc ln  trên
cao chính là DNA tng s ca S. aureusu này chng t DNA tng s
sau khi tách chit không b t gãy, còn nguyên vn nên c chúng tôi
dùng làm khuôn trong phn ng PCR khui gen sec1. Hình 3.3. Điện di đồ DNA tổng số
của chủng Staphylococcus aureus

Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn 1kb;
1-5: DNA tổng số S.aureus

3.1.2.2. Kết quả khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR
T  ngun DNA tng s tách t chng S.aureus, chúng tôi tin
hành thc hin phn ng PCR vi cp mc hiu SEC-F và SEC-
khui gen sec1 khong 801 bp. Sn phc n di
trên gel agarose 1,2%. Hình 3.4.Điện di đồ sản phẩm PCR
trên gel agarose 1,2%

Ghi chú: Kênh M: Thang DNA
chuẩn 1kb; 1, 2: Đoạn gen sec1 i cp mc hiu SEC-F và SEC-

Plasmid pGS-21a-     c t rut t cu SEC1
c bin np vào t bào E. coli kh bin bc nhit, sau
chn lc khun lc bin nng có ampicillin.  nghiên
cu s biu hin ca protein tái t hp, vi khun sau khi bin np thành
c nuôi c ng LB lng có kháng sinh ampicillin,
lc vi t 150 vòng/phút,  37
0
n khi OD
600
t 0,6-0,8 thì b
sung thêm cht cm ng IPTG vi n 1mM và nuôi tip  30
0
C trong
5 gi. Protein tng s ca dch chit t   c phân tích trên gel
polacrylamide và cho thy s xut hin ca mprotein v
m, có trng phân t trong khong t 42,7 66,2 kDa khi so sánh
vi thang protein chun, kt qu này là phù hp vi protein SEC1 mà chúng
tt.
16 Hình 3.6. Điện di đồ biểu hiện gen
SEC1 trong protein tổng số của các
tế bào E.coli BL21
Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1:
Đối chứng âm (protein tổng số trong
dịch chiết dòng khuẩn lạc E.coli
BL21); 2: Protein trong dịch chiết
dòng E. coli đã biến nạp được cảm
ứng IPTG.

0
C; 5h,30
0
C;
2h, 37
0
C; 2h,30
0
C, 0h 3.1.2.6. Tinh chế protein tái tổ hợp SEC1
Chúng tôi tinh sch protein tái t hc ký ái lc
s dng bi t HisMag Sepharose
TM
Ni  c SEC1  dng tinh khit.
17

-ein SEC1 thu nh
tinh sch cao, không tp nhim các protein ca vi khun. Hình 3.8. Điện di đồ protein SEC1 tái
tổ hợp sau tinh sạch

Ghi chú:
Kênh 1,4 : Protein trước khi tinh sạch;
Kênh 2,3: Protein sau khi tinh sạch;
M: Marker.


phân đoạn bởi PEG.  to ra kháng th    tinh sch cao, hot tính kháng th
mu cho que th phát hic t rut t cu,
kháng th c to ra t ch bn
c và NaCl c tinh sch trên ct sc ký g tác thiophylic (Hi Trap
IgY Purification HP).

Hình 3.10. Điện di đồ các giai đoạn tinh sạch kháng thể IgY qua cột
sắc ký
Ghi chú: M: thang protein chuẩn; 1: IgY sau tinh sạch bằng tối ưu hóa
kết tủa NaCl; 2, 3: Dịch rửa cột sau khi cho mẫu vào; 4: IgY thu được
sau tinh sạch; 5:Dịch rửa cột của đệm làm sạch.

3.3. NG DNG SEC1 TÁI T HP VÀ CÁC KHÁNG TH 
TR TO QUE TH
3.3.1. Xác định lƣợng kháng thể lên vạch kiểm chứng
19

Kháng th gn lên vch kim chng là kháng th 
c tách chit và tinh sch t  trng gà. Tin hành pha loãng IgY ti
các n 0,1; 0,3; 1 µg/µl và in lên màng nitrocellulose vi ling
1µl/cm. Chúng tôi s dng n kháng th  in
màng vi li 1 2 3
Hình 3.11. Lựa chọn lượng kháng
thể đa dòng kháng BSA để cố định lên vạch

20

phm bo mu âm tính phi xut hin vch. Chúng tôi tin hành s dng
1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 và 10 µl kháng nguyên cng hp cho mu âm tính.
Các kt qu ch ra rng kháng nguyên cng hp nh nht vn cho các
tín hiu vch khá rõ ràng là 2µl. Do vy, trong các thí nghim tip theo,
chúng tôi s dng 2µl kháng nguyên cng hp cho mt que th. Hình 3.13. Lựa chọn lượng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụng
Ghi chú: 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 và 10: Lượng kháng nguyên cộng hợp sử dụng
cho 1 phản ứng là 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 và 1 µl.

3.3.4. Xác định độ nhạy phát hiện của que thử với 5 loại độc tố
   n b các mu kháng nguyên SEA, SEB, SEC
1
,

SED và SEE vi n u là: 1000ng/ml ri tin
các n 300 ng/ml, 100 ng/ml, 30 ng/ml, 10 ng/ml, 3 ng/ml và 1 ng/ml.
Các kt qu thí nghim vi tc t cho thy:
Vi SEA, SEB và SED khi phân tích bng m nhy phát
hin ca que th là khong 30-100 ng/ml.

Hình 3.14. Thử độ nhạy của que thử với SEA, SEB, SED trong đệm
Ghi chú: 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8: Mẫu chứa 1000; 300; 100; 30; 10; 3; 1
ng/ml và mẫu âm tính không chứa SEA.
22

khi s dng cht nn là sa, chúng tôi có th kt lun r nhy phát hin
ca toàn b  :
- Vi SEA và SEB, SED: trong dung dm ch nhy phát
hin ca que th khong 30-100 ng/ml; trong s   nhy phát hin
khong 30-90 ng/ml.

Hình 3.17. Thử độ nhạy của que thử với SEA, SEB, SED trong sữa
Ghi chú: 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9: mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30; 9;
3 ng/ml, mẫu âm tính sữa không chứa SEA và mẫu âm tính đệm không
chứa SEA.
- Vi SEC
1
, SEE trong dung dm ch nhy phát hin ca
que th khong 10-30 ng/ml; trong s nhy phát hin khong 9-30
ng/ml.

Hình 3.18. Thử độ nhạy của que thử với SEC1 trong sữa
Ghi chú: 1 ; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; mẫu chứa 3000; 900; 300; 90; 30;
9; 3 ng/ml, mẫu âm tính sữa không chứa SEC1.


1
, SEE
 m chy khong 10-30 ng/ml, trong s   nhy phát hin
khong 9-30 ng/ml.

KIN NGH
Tip tc nghiên cu nhm t   nhy phát hin
vi 5 loc t rut ca t cu (SEA-n hóa quy trình phân
 có th n xut, ng d phát hin các loc t này
trong nhiu loi thc phm trên hing.
|