PHƯƠN
G PHÁP
SẮC KỶ
LỎNG
HIỆU
NĂNG
CAO,
CẤU
TẠO
MÁY
HPLC ỨNG
DỤNG
TRONG
THỰC

Tên chuyên đề: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)-CẤU
TẠO MÁY HPLC-ỨNG DỤNG TRONG
THỰC PHẨM
SV thực hiện: Nguyễn Song Khoa -15116024
Nguyễn Thành Lân –15116025
Lê Ngọc Pha Lê – 15116026
Nguyễn Thị Cẩm Tú-15116060
Thời gian: 13/4/2016

Trang 1

Đánh giá của GV


MỤC LỤC

In dữ liệu…………………………………………………………………..Trang 15

C-ỨNG DỤNG…………………………………………………………………...Trang15

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)-CẤU TẠO MÁY
HPLC-ỨNG DỤNG TRONG THỰC PHẨM
Trang 2


A-PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO(HPLC)
I.
-

Giới thiệu
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography ), trước kia gọi là phương

-

pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (sắc ký lỏng cao áp) là một công cụ mạnh mẽ dùng trong

-

phân tích môi trường.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao về cơ bản là một hình thức cải tiến của sắc ký cột. Thay vì
dung môi qua cột dưới lực hấp dẫn, chúng qua cột dưới áp lực cao lên đến 400 lần áp
suất khí quyển. Điều này cho phép bạn sử dụng một kích thước hạt nhỏ hơn rất nhiều
cho các vật liệu trong cột và một diện tích bề mặt lớn hơn nhiều cho các tương tác


• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).
Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được
những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối
lượng phân tử không quá lớn (
tách đến cuối cột tách .Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giưa hai
pha, trong khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một thành phần pha động nhất định,
hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó luôn
chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ đầu cột đến cuối cột sắc ký. Mặt khác, cũng vì
cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển
trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Khi ở trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc
độ của dòng pha dộng, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại không dịch chuyển, mà bị pha tĩnh
giữ lại. Như vậy là có một khoảng thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột tách sắc
ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như tính chất và cấu
trúc của mỗi chất tan khác nhau đồng thời phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha
động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan ít bị lưu giữ, điều đó dẫn đến kết quả là có quá
trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký.
Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:
•

Tương tác hấp thụ
Trang 5


Tương tác trao đổi ion
Tương tác theo cơ chế rây phân tử
Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau:
• Sắc ký hấp thụ ( hấp thụ pha thường NP – HPLC và hấp thụ pha ngược RP- HPLC)
• Sắc ký trao đổi ion ( EX- HPLC)
• Sắc ký rây phân tử (Gel – HPLC)
•
•

Tóm lại: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách chất
trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa các chất nhồi

-

được ghi lại ở hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu.

Chọn điều kiện sắc ký
Muốn cho kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn

IV.

hợp mẫu.
Các điều kiện đó bao gồm:
• Pha tĩnh :
- Loại pha tĩnh
- Kích thước cột
• Pha động:
- Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ ...Nếu là chương trình rửa
-

giải Isocratic
Thành phần và tỷ lệ ,pH , tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung

môi ... Nếu là chương trình rửa giải Gradient.
• Hệ thống trang bị:
- Loại Detector
- Van tiêm mẫu, thể tích tiêm
- Hệ đường dẫn
- Các yếu tố khác (nhiệt độ, độ nhảy của Detector, bước sóng phân tích)
 Lựa chọn pha tĩnh
- Dựa vào các thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa chọn
•

- Pha tĩnh : Dùng để tách các chất không phân cực ,ít phân cực ,các chất phân
cực có thể tạo cặp Ion .Trên bề mặt hoạt động các nhóm OH đã bị Alkyl hóa tức là
thay thế nguyên tử H bằng các mạch Carbon thẳng ( C8 hay C18 tương đương RP
8 hay RP 18) hay các mạch Carbon vòng( Phenyl- tương đương cột Phenyl ) vì thế
nó ít phân cực hay phân cực rất ít .
Ví dụ: cột Lichrosor -Lichrospher RP 8 ...... ODS, Cột Nucleosil C18........
- Pha động: Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực

như :Methanol ,Acetonitril,,nước hay các loại dung dịch đệm ,hỗn hợp của các
dung môi-đệm
 Lựa chọn pha động :
- Dựa vào các thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích .....ta lựa
chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu
đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân
tiïch phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi,hóa chất,thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu
sự hoạt động của thiết bị .
- Pha động có thể thay đổi:
Trang 8


+ Độ chọn lọc α
+ Thời gian lưu
+ Hiệu năng tách của cột
+ Độ phân giải
+ Tính đối xứng của Peak
Do đó ,Trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù
hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích.
Chính vì vậy pha động cần có những yêu cầu sau:
+ Pha động phải trơ với pha tĩnh đã có .Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi
hóa học . ( vd giá trị pH : 2.5< pH
1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc:
+ Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt cho

kết quả phân tích có độ đúng,độ lặp lại,tuyến tính,tỷ lệ dung môi ,tốc đô dòng,năng lượng
đèn ....đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra .
+ Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có
nghi ngờ về khả năng tách ,và rửa đúng qui định sau mỗi lần chạy sắc ký :
2.

Chuẩn bị dung môi pha động :

+ Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết HPLC
+ Các hóa chất dùng phải là loại PA
Trang 10


+ Pha dung môi đúng ,chính xác theo đúng tỷ lệ, ,để ổn định dung môi đúng thời
gian theo chuyên luận đã yêu cầu .Lọc dung môi qua màng lọc 0.2 - 0.45 µm ,Siêu âm
đuổi bọt khí
3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC:

+ Mẫu Thử : Xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận ,qui trình theo nguyên tắc :
Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động ,trong nhiều trường

•

hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu
• Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rưẳ giải được bằng
cách lọc hay chiết ..
• Phải lọc và ly tâm ,lọc mẫu qua màng lọc 0.2 - 0.45 µm

2. Bộ phận khử khí
3. Bơm cao áp
4. Bộ phận tiêm mẫu
5. Cộ sắc ký (pha tĩnh)
6. Đầu dò
7. Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống.
8. In dữ liệu.

Trang 12


1. Bình chứa pha động.

•

Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta sử
dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng
tỉ lệ của 4 đường là 100%.
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc mà
thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất
hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định quá trình rửa giải.

•

Lưu ý: Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùng
cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là
hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh
hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân
tích.



Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi.
Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự
động.

5. Cộ sắc ký (pha tĩnh)

-

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng

-

hiệu năng cao.
Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay

-

đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…
Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.

6. Đầu dò

Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột
và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính
và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân tích
mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp.
Tín hiệu đầu dò thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện
Trang 15


quan

đến

kết

quả

phân

tích.

8. In dữ liệu.
Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài
phần mềm điều khiển.
C- ỨNG DỤNG
-

Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) đã được ứng dụng để xác định một số
carotenoid quan trọng trong rau quả như lutein, zeaxanthin, lycopene, α-carotene và β-

-

carotene.
Hai phương pháp chính được khảo sát là phương pháp của Hart và Scott (1995) và
phương pháp theo AOAC (1984). Các carotenoid được định tính và định lượng trên sắc

-

ký lỏng với các detector UV-VIS và PDA.



khi đã hoàn tất liệu trình điều trị, ngay cả kỹ thuật sinh học phân tử như PCR cũng khó
phân biệt vì vốn dĩ chu kỳ sinh học của Plasmodium vivax là có thể ngủ và tái hoạt thể
ngủ nên không thể đánh giá thấu đáo tái phát (relapse) hay tái nhiễm (reinfection) đối với
loài KSTSR này.
Các trường hợp xuất hiện lại P. vivax, cần đo nồng độ CQ trong máu toàn phần,
các mẫu máu được lấy vào giấy thấm Whatman 31ETchr vào các ngày D 0, D7, Dthất bại và
D28. Lấy 100ml máu đầu ngoán tay bằng ống mao quản chứa sẵn heparin hoặc chất chống
đông EDTA, để khô trong môi trường và bỏ vào túi plastic có khóa (có thể để được 24
tháng), sau đó gởi đi phân tích bằng máy HPLC (Agilent 1200 series, Agilent
Technologies, Germany) theo quy trình phương pháp của Bell và cộng sự (2007). Hệ
thống sắc ký lỏng của HPLC sử dụng là cột phân tích trong pha nghịch ZORBAX Ecllpse
XDB-C18 (4.6 × 150mm ID, 5 μm), với tốc độ dòng chảy 1ml/phút, pha động isocratic
chứa nước đã khử ion, acetonitrile và triethylamine theo tỷ lệ 90%, 10% và 1%.
Theo Chương trình phòng chống sốt rét toàn cầu (Global Malaria
Programme_GMP) và Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organisation_WHO) cho
phép và hướng dẫn trong đánh giá nhạy kháng thuốc chloroquine do Plasmodium vivax,
chỉ số tổng nồng độ Chloroquine và Desethylchloroquine (CQ+DCQ) sau khi điều trị 3
ngày và trong quá trình theo dõi 28 ngày vẫn còn KSTSR Plasmodium vivax mà tại thời
điểm đó nồng độ CQ+DCQ ≥ 90 ng/ml là một chỉ điểm (marker) nghi ngờ kháng thuốc.
Do đó, việc phân tích xác định nồng độ Chloroquine và Desethylchloroquine (CQ+DCQ)
trong máu bệnh nhân trong và sau điều trị bằng máy HPLC và HPLC/MS là rất cần thiết
trong đánh giá nhạy - kháng thuốc, để đưa ra các thay đổi chính sách thuốc sốt rét phù
hợp từng giai đoạn.
Việc nghiên cứu phân bố của CQ và DCQ trong máu, huyết tương và hồng cầu trên
những cá nhân khỏe mạnh tình nguyện và bệnh nhân sốt rét đã được nghiên cứu từ nhiều
năm qua sử dụng hệ thống HPLC đo nồng độ Chloroquine (Cq) và desethyl-chloroquine
(CqM) với HPLC và các kết quả đang mang lại nhiều khía cạnh quan trọng đánh giá nhạy
kháng thuốc cũng như một số chỉ số thông số dược động học về thuốc sốt rét loại CQ .