Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High
Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High
Pressure Liquid Chromatography).
1. Khái niệm
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ
sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một
phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong
cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ
lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học
với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi
và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp
tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất
thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực
phẩm, dược phẩm, môi trường…
2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia
HPLC thành 4 loại:
• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).
• Sắc ký phân bố (partition chromatography).
• Sắc ký ion (ion chromatography).
• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).
Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích
được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp
chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000).
SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và
pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc
ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại
này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và phân tích các

organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình
hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.
Hình 2: Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4µmol/m2 bề
mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể.
Ngoài nhóm Cl người ta còn sử dụng –OCH3.
Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng
tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực
hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl)
còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài
ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn
nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn
các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.
Hình 3: Cấu trúc của cột ODS
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm –OH
chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường
pH phân tích.
Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-
C18) ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích
không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa.
Trong môi trường baz (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan
(SiO2 thành silicat), hệ quả là N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi rộng
ra và thời gian lưu cũng có thể giảm. Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ
chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như
trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để
tương tác với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end-capping). Lúc này ta sẽ có
loại cột ít tương tác với chất phân tích có tính baz (cột LC-DB của hãng
SUPELCO).

Bảng 1: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng
Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N,
hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α . Khi sự thay đổi thành phần pha động
không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất
pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α. Đôi khi có thể phải thay đổi
cả pha tĩnh.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và
pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton)
hoặc tính baz (nhận proton) của dung môi.
Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung
dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước.
Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm
alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất
và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ.
Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc
tăng áp suất cột.
Hình 6: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25
o
C
Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu
hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn
hợp dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước. Với một hỗn
hợp chất phân tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với
nước. Khi lựa chọn thì phải chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước
có độ rửa giải tương đồng.
Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ
isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình
gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
5. Một s# đại lư%ng cơ bn trong phân tích sc k
5.1. Hệ s# phân b#

5.5. Độ chọn lọc
Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.
5.6. Độ phân gii:
Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn
lọc và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau:
Hay
Với N được xác định từ phương trình (2.5) ho
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High
Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High
Pressure Liquid Chromatography).
1. Khái niệm
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ
sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một
phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong
cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ
lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học
với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi
và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp
tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất
thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực
phẩm, dược phẩm, môi trường…
2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia
HPLC thành 4 loại:
• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).
• Sắc ký phân bố (partition chromatography).
• Sắc ký ion (ion chromatography).
• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).

phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc
dạng này.
Bề mặt các hạt silica – SiO2 (các hạt này có đường kính 3, 5 hoặc 10 µm) được
xử lý (thủy phân) bằng cách đun nóng với HCl 0,1M trong một hoặc hai ngày
để tạo ra những nhóm SiOH như sau (thông thường chỉ có khoảng 8 µmol
SiOH/m2 bề mặt):
Hình 1. Bề mặt silica đã thủy phân
Sau đó bề mặt silica đã thủy phân này sẽ được cho phản ứng với các
organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình
hoặc rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.
Hình 2: Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4µmol/m2 bề
mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể.
Ngoài nhóm Cl người ta còn sử dụng –OCH3.
Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng
tương tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực
hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl)
còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài
ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn
nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn
các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.
Hình 3: Cấu trúc của cột ODS
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm –OH
chưa phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường
pH phân tích.
Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-
C18) ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích
không còn tương tác tốt với pha tĩnh nữa.
Trong môi trường baz (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan

yêu cầu nhất. Nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để
giảm khả năng rửa giải.
Mỗi dung môi đều đặc trưng bởi các hằng số vật lý như chỉ số khúc xạ
(refractive index), độ nhớt (viscocity), nhiệt độ sôi (boiling point), độ phân cực
(polarity index), độ rửa giải (eluent strength)…

Trong đó độ phân cực và độ rửa giải có tác động lớn lên khả năng phân tách
của các mũi sắc ký.
Bảng 1: Tính chất của một số pha động trong sắc ký lỏng
Có ba thông số gây ảnh hưởng lớn đến tách các mũi sắc ký: số đĩa lý thuyết N,
hệ số dung lượng K’, độ chọn lọc α . Khi sự thay đổi thành phần pha động
không đem lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất
pha động (sử dụng dung môi khác), tức thay đổi α. Đôi khi có thể phải thay đổi
cả pha tĩnh.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và
pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton)
hoặc tính baz (nhận proton) của dung môi.
Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung
dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước.
Nước là một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm
alkyl không phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất
và có tốc độ rửa giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ.
Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc
tăng áp suất cột.
Hình 6: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25
o
C
Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu
hóa cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn
hợp dung môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước. Với một hỗn

chấp nhận trong khoảng rộng 1-20.
5.4. Hiệu năng
Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc
ký của các cấu tử trên cột. N càng lớn, hiệu năng tách càng cao.
Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ. Người ta chứng minh được:
Hay
Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút)
W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)
5.5. Độ chọn lọc
Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột.
5.6. Độ phân gii:
Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp, sự chọn
lọc và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau:
Hay
Với N được xác định từ phương trình (2.5) hoặc (2.6).
/> /> />