1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

N

NG
Đ

N

T

N

TR

TƯ NG T 4
G N

RN

TẠ

NG

LU N ĂN T Ạ

N


NG Đ

T

N

N

TR

RN

TƯ NG T 4
NG N

NG

TẠ

NG

N

R

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LU N VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
N

SMV có thể lan truyền trong quần thể đậu tương do rệp, hoặc do cơ học.
Hiện nay, những biện pháp thường sử dụng để ngăn chặn sự lan truyền của SMV
chỉ có tính chất phòng bệnh mà không thể chống lại triệt để. Tuy nhiên, nhờ ứng
dụng kỹ thuật RNA interference (RNAi) người ta đã tạo ra cây trồng có khả năng
kháng lại bệnh do virus bằng cách đưa ch nh gen của virus gây bệnh vào hệ gen
của cây chủ. Theo hướng nghiên cứu này, nhiều giống cây trồng chuyển gen
kháng được các loại bệnh virus khác nhau đã được tạo ra, như cây đậu chuyển
gen kháng virus BGMV (bean golden mosaic virus), cây thuốc lá chuyển gen
kháng virus khảm dưa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV).

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




4

Xuất phát từ những l do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu
chuyển cấu trúc RNAi vào giống đậu tương DT84 phục vụ tạo dòng cây
chuyển gen kháng Soybean mosaic virus”.
2.

ục t êu

ê c u

Tạo được dòng cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi chứa đoạn gen CPi
của SMV ở giống đậu tương DT84.
3. Nộ du


lượng protein cao hơn cả ở cá, thịt và cao gấp hai lần hàm lượng protein có trong
các loại đậu đỗ khác [14]. Hàm lượng các axit amin có chứa lưu huỳnh như
methionin, sistein,… của đậu tương rất gần với hàm lượng của các chất này của
trứng. Hàm lượng của cazein, đặc biệt là của lizin rất cao, gần gấp rưỡi trứng. Vì
thế mà khi nói giá trị của protein ở đậu tương cao là nói hàm lượng lớn của nó cả
sự đầy đủ và cân đối của các loại axit amin cần thiết. Protein của đậu tương dễ
tiêu hóa hơn thịt và không có các thành phần tạo nên cholesteron. Không có các
dạng axit uric… Ngày nay, người ta mới biết thêm nó có chứa chất lexithin, có
tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, sung sức, làm tăng thêm tr nhớ và tái sinh các
mô, làm cứng xương và tăng sức đề kháng của cơ thể.
Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn các loại đậu đỗ khác
nên được coi đây là cây cung cấp dầu thực vật. Hiện nay các nước có mức sống
cao người ta lại ưa chuộng dầu thực vật hơn mỡ động vật. Lipid của đậu tương
chứa một tỷ lệ cao các axit béo chưa no có hệ số đồng hóa cao, mùi vị thơm
ngon. Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ vữa động
mạch [14]. Trong đậu tương còn có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm
lượng vitamin B1 và B2, ngoài ra còn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C… và

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




6

các loại muối khoáng khác [14]. Do đó mà từ hạt đậu tương người ta đã chế biến
ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có hơn 300 loại thức ăn bằng các
phương pháp cổ truyền, thủ công và hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lên men…
như làm giá, sữa đậu nành, xì dầu… cho đến các sản phẩm cao cấp như đậu
tương, socola- đậu tương, bánh kẹo, pate, thịt nhân tạo… ngay như ở nước ta, từ

1.1.2. Đặc đ

sinh học

Cây đậu tương (Glycine max (L) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), có
nguồn gốc từ cây đậu tương hoang dại (Glycine ussuriensis) dạng thân leo, sống
hàng năm được phát hiện ở Trung Quốc, Nhật Bản, và Triều Tiên. Chúng có rất
nhiều chủng khác nhau, thích nghi với điều kiện khí hậu từ ôn đới đến nhiệt đới
[14].
Rễ cây đậu tương khác với rễ cây hoà thảo là có rễ chính và rễ phụ. Rễ
chính có thể ăn sâu 30-50cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ
phụ, rễ phụ cấp 2, cấp 3 tập trung nhiều ở tầng đất 7-8 cm rộng 30-40 cm2. Trên
rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần. Bộ rễ phân bố nông sâu, rộng hẹp, số lượng
nốt sần ít hay nhiều phụ thuộc vào giống, đất đai, kh hậu và kỹ thuật trồng [14].
Trong điều kiện đất chua quá hoặc kiềm quá nốt sần hình thành kém. pH thích
hợp cho sự hình thành của nốt sần là 6-7, vì vậy việc lựa chọn đất trồng đậu
tương th ch hợp rất quan trọng. Điều kiện dinh dưỡng cũng ảnh hưởng rất lớn
đến sự phát triển của nốt sần. Nhìn chung bón đầy đủ NPK thì nốt sần phát triển
mạnh, bón P2O5 có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của nốt sần, còn hiệu quả kali
không rõ lắm. Bón đạm không thích hợp ức chế sự hình thành và phát triển của
nốt sần. Nốt sần ở rễ đậu tương thường tập trung ở tầng đất 0-20cm, từ 20-30cm
nốt sần ít dần và nếu sâu hơn nữa thì có ít hoặc không có. Nốt sần đóng vai trò
chính trong quá trình cố định đạm khí trời cung cấp cho cây. Lượng đạm cung
cấp cho cây khá lớn khoảng 30-60 kg/ha. Nốt sần có thể dài l cm, đường kính 5 6 mm, mới hình thành có màu trắng sữa, khi tốt nhất có màu hồng. Quan hệ giữa
vi sinh vật nốt sần với cây đậu tương là mối quan hệ cộng sinh: cây cung cấp
chất dinh dưỡng cho vi khuẩn hoạt động, ngược lại vi khuẩn lại tổng hợp nitơ tự
do của không khí chuyển sang dạng đạm hữu cơ cây có thể sử dụng được [14].
Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông
nhỏ. Thân khi còn non có màu xanh hoặc màu tím khi về già chuyển sang màu


cho nên cần phải cung cấp đầy đủ dinh dưỡng trước khi vào thời kỳ này và tạo
điều kiện cho bộ rễ phát triển thuận lợi. Trong kỹ thuật chăm sóc ta phải xới vun
kết hợp với bón thúc phân cho đậu tương vào giai đoạn 3-5 lá kép, lúc cây có
đầy đủ hoa thì sinh trưởng chậm dần rồi dừng hẳn.

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




9

Cây đậu tương có 3 loại lá: lá mầm, lá nguyên, lá kép. Lá mầm mới mọc
có màu vàng hay xanh lục, khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh.
Hạt giống to thì lá mầm chứa nhiều dinh dưỡng nuôi cây mầm, khi hết chất dinh
dưỡng lá mầm khô héo đi, cho nên trong kỹ thuật trồng đậu tương nên làm đất
tơi nhỏ và chọn hạt to cây sẽ mọc khoẻ, sinh trưởng tốt. Lá nguyên xuất hiện sau
khi cây mọc từ 2-3 ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau.
Lá đơn to màu xanh bóng là biểu hiện cây sinh trưởng tốt. Lá đơn to xanh đậm
biểu hiện của một giống có khả năng chịu rét. Lá đơn nhọn gợn sóng là biểu hiện
cây sinh trưởng không bình thường. Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét.
Lá kép mọc so le, lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng
nâu. Cũng có giống khi quả chín lá vẫn giữ được màu xanh, những giống này
thích hợp trồng làm thức ăn gia súc. Phần lớn trên lá có nhiều lông tơ. Lá có
nhiều hình dạng khác nhau tuỳ theo giống, những giống lá nhỏ và dài chịu hạn
khoẻ nhưng thường cho năng suất thấp. Những giống lá to chống chịu hạn kém
nhưng thường cho năng suất cao hơn. Nếu 2 lá kép đầu to và dày thường biểu
hiện giống có khả năng chống chịu rét. Số lượng lá kép nhiều hay ít, diện tích lá
to hay nhỏ chi phối rất lớn đến năng suất và phụ thuộc vào thời vụ gieo trồng.
Các lá nằm cạnh chùm hoa nào giữ vai trò chủ chủ yếu cung cấp dinh dưỡng cho

hoa và giống chín muộn 45-50 ngày mới ra hoa. Thời gian ra hoa dài hay ngắn
theo giống và theo thời vụ. Có những giống thời gian ra hoa chỉ kéo dài 10-15
ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ hoa rộ thường từ ngày thứ 5 đến ngày
thứ 10 sau khi hoa bắt đầu nở. Hoa trong đợt rộ mới tạo quả nhiều, còn trước và
sau đợt hoa rộ thì tỷ lệ đậu quả thấp. Điều kiện thích hợp cho sự nở hoa là ở
nhiệt độ 25-28oC, ẩm độ không khí 75-80%, ẩm độ đất 70-80%. Căn cứ vào
phương thức ra hoa người ta chia các giống đậu tương làm 2 nhóm: (i) Nhóm ra
hoa hữu hạn: Thuộc những giống sinh trưởng hữu hạn, hướng ra hoa theo trình
tự từ trên xuống dưới và từ ngoài vào trong. Những giống này thường cây thấp
ra hoa tập trung, quả và hạt đồng đều. (ii) Nhóm ra hoa vô hạn: Thuộc những
giống sinh trưởng vô hạn, có hướng ra hoa theo trình tự từ dưới lên trên và từ
trong ra ngoài. Những giống này thường ra hoa rất phân tán, quả chín không tập
trung và phẩm chất hạt không đồng đều. Trong thực tế, những giống hoa tập
trung nếu gặp điều kiện bất thuận, hoa sẽ rụng nhiều nên thất thu nặng. Còn
những giống thời gian ra hoa dài tuy quả chín không tập trung nhưng nếu bị rụng
vào một đợt thì hoa sẽ ra tiếp đợt sau nên không thất thu nặng.

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




11

Số quả biến động từ 2 đến 20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới 400
quả trên một cây. Một quả chứa từ 1 tới 5 hạt, nhưng hầu hết các giống quả
thường từ 2 đến 3 hạt. Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều dài từ 2 tới
7 cm hoặc hơn. Quả có màu sắc biến động từ vàng trắng tới vàng sẫm, nâu hoặc
đen. Màu sắc quả phụ thuộc vào sắc tố caroten, xanthophyll, màu sắc của lông,
sự có mặt của các sắc tố antocyanin. Lúc quả non có màu xanh nhiều lông (có

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




12

người trên đất nước này đang tăng lên. Dầu đậu tương chiếm tới 80% lượng dầu
ăn được tiêu thụ ở Mỹ [66].
Theo ước tính của Bộ Nông nghiệp Mỹ, tổng sản lượng đậu tương thế giới
năm 2011/12 đạt 236,03 triệu tấn, giảm 28,71 triệu tấn so với sản lượng 264,74
triệu tấn do sản lượng giảm ở Brazil (-10,00 triệu tấn), ở Mỹ (-7,44 triệu tấn), ở
Achentina (-8,00 triệu tấn), ở Trung Quốc (-1,60 triệu tấn), ở Ấn Độ (-1,2 triệu
tấn) và ở Paragoay (-4,37 triệu tấn). Sản lượng đậu tương năm 2011/12 ước tính
đạt (đơn vị: triệu tấn): Brazil 65,50; Mỹ 83,17; Achentina 41,00; Trung Quốc
13,50; ấn Độ 11,00; Paragoay 4,00; Canađa 4,25 và các nước khác 13,61.Tổng
xuất khẩu đậu tương trên thế giới năm 2011/12 ước đạt 90,54 triệu tấn, giảm so
với 92,64 triệu tấn của năm 2010/11. Trong đó, xuất khẩu của các nước ước tính
đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 36,70; Mỹ 36,74; Achentina 7,80; Paragoay 3,10;
Canađa 2,80 và các nước khác 3,40 [54].
Tổng sản lượng đậu tương thế giới năm 2012- 2013 dự báo đạt 260,46
triệu tấn, điều chỉnh giảm 6,70 triệu tấn (-2,51%) so với dự báo đưa ra hồi tháng
7/2012, song tăng 24,43 triệu tấn (+10,35%) so với sản lượng 236,03 triệu tấn
của năm 2011- 2012, trong đó sản lượng của mỹ sẽ tiếp tục giảm 9,91 triệu tấn (11,91%). Sản lượng đậu tương năm 2012- 2013 của các nước dự báo đạt (đơn vị:
triệu tấn): Braxin 81,00; Mỹ 73,27; Achentina 55,00; Trung Quốc 12,60; ấn Độ
11,40; Paragoay 8,10; Canađa 4,50 và các nước khác 14,59. Tổng xuất khẩu đậu
tương trên thế giới trong năm 2012- 2013 dự báo đạt 93,97 triệu tấn, tăng so với
90,54 triệu tấn của năm 2011- 2012. Xuất khẩu đậu tương của các nước trong
năm 2012- 2013 dự báo đạt (đơn vị: triệu tấn): Braxin 37,60; Mỹ 30,21;
Achentina 13,50; Paragoay 5,40; Canađa 3,00 và các nước khác 4,26. (Oilseeds:

nhẹ khoảng 176 và 192 nghìn tấn. Khả năng cạnh tranh của đậu tương so với ngô
vẫn còn thấp do sản lượng t nh trên mỗi héc-ta trồng đậu tương thấp hơn so với
trồng ngô. Khu vực trồng đậu tương ch nh tập trung ở vùng Đồng bằng sông
Hồng, miền Bắc nước ta [65]. Theo USDA, sản lượng đậu tương trong những năm
tới sẽ tăng và đạt được mục tiêu mà Ch nh phủ đã đề ra trong Quy hoạch Tổng thể
cho ngành hạt có dầu là 350 nghìn héc-ta diện t ch trồng trọt và 700 nghìn tấn sản
lượng vào năm 2020. Tuy nhiên, năng suất nhìn chung vẫn còn thấp và việc mở
rộng diện t ch trồng trọt của ngành chưa cao, trong đó nguyên nhân ch nh là khả
năng cạnh tranh của cây đậu tương.

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




14

Bảng 1.1.

n

n ng

ản lượng đậ

ương

11-2015 [65]

2011


1,48

Tổng sản lượng(nghìn tấn)

266,9

173,7

168,4

176,4

192,4

N uồ : Tổ
ệu

ụ T ố

ê V ệt N m (GSO), B N

ệ v P

tt

N

t


vàng lá và rụng lá. Các triệu chứng trên lá này gần giống các triệu chứng khi đậu
tương bị ngộ độc thuốc diệt cỏ 2,4D.
Hạt giống từ cây bị nhiễm bệnh có thể bị đốm nâu hoặc đen, tùy thuộc vào
màu sắc rốn hạt. Hạt có thể nhỏ hơn và nảy mầm kém hơn so với hạt của cây
không bị nhiễm. Những vết lốm đốm không thể hiện sự có mặt của virus cũng
như không phải tất cả các hạt đều chứa virus và không phải tất cả các hạt từ cây
nhiễm virus đều lốm đốm.
Bệnh khảm đậu tương lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1900 và
đến nay virus khảm đã có mặt hầu hết ở các vùng trồng đậu tương trên thế giới
[35]. Việt Nam cũng đã công bố phát hiện loại virus này từ năm 1994, chủ yếu
tập trung ở những vùng trồng đậu tương lớn, như khu vực trung du, miền núi
Bắc Bộ, khu vực đồng bằng Sông Hồng và Tây Nguyên [2], [11]. SMV gây thiệt
hại đáng kể về năng suất, thậm chí một số trường hợp tổn thất có thể lên đến
94% tổng sản lượng đậu tương. Những cây bị nhiễm SMV thường sinh trưởng
chậm, hình thái lá, thân, quả bị biến dạng, khi bị nhiễm ở giai đoạn muộn sẽ làm
giảm sản lượng và chất lượng hạt [35], [36]. SMV là một hình que cong queo
gồm chuỗi RNA đơn. Nhiều chủng virus đã được xác định dựa trên các phản ứng
trên một tập hợp các giống khác nhau. Tại hoa kỳ, SMV được phân loại thành 9
chủng và các chủng hiện nay đã được biết từ G1 đến G7, G7a, và C14. Có thể có
các chủng khác tồn tại, đặc biệt ở Trung Quốc và Nhật Bản [65].
SMV có thể lan truyền trong quần thể đậu tương nhờ rệp và hiện nay
người ta biết đến t nhất có 32 loài rệp thuộc 15 chi khác nhau truyền SMV một
cách không ổn định. Kết quả cây bị nhiễm bệnh do lan truyền qua hạt đóng một
vai trò quan trọng trong nghiên cứu bệnh về SMV. Những cây như vậy là nguồn

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN





Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




17

proteinase (P1), Helper component proteinase (HC-pro), Protein P3 (P3), 6 kDa
protein 1(6K1), Cytoplasmic inclusion protein (CI), 6 kDa protein 2 (6K2),
Protein liên kết hệ gen virus (VPg), Nuclear inclusion protein A (NIa), Nuclear
inclusion protein B (NIb), Capsid protein (CP). Hệ gen của SMV gồm các gen
mã hóa cho 3066 amino acid, gồm 10 chuỗi polipeptid và được mô phỏng theo
sơ đồ ở hình 1.2.

Hình 1.2. Cấu trúc hệ gen của SMV [48]
HC-Pro: là thành phần trợ giúp và protease; CI: là protein hình trụ;
NIb là RNA polymerase phụ thu c RNA; P1, P3, và NIa là protease;
CP: là protein vỏ c a virus; VPg: là protein liên kết

Hạt SMV được tạo thành từ khoảng 2000 tiểu đơn vị tạo nên lớp vỏ
protein (coat protein) sắp xếp theo kiểu xoắn ốc xung quanh hệ gen RNA virus
[16]. Gen CP ở SMV có k ch thước 807 nucleotide, vùng mã hóa gồm 804
nucleotide mã hóa 267 amino acid, và từ amino acid thứ 33 đến 264 trong CP
được gọi là vùng Poty- coat [37]. Trong nghiên cứu của Lò Thị Mai Thu (2014),
trình tự đoạn gen CP phân lập từ SMV dòng SL1 và SL2 có k ch thước 720
nucleotide, mã hóa 240 amino acid và vùng Poty- coat của protein có 208 amino
acid [16].
1.3. ng

ng

tiềm năng tham gia vào các kiểu hình của bệnh. Mặt khác, công nghệ RNAi sẽ
cung cấp một phương tiện hiệu quả để ngăn chặn biểu hiện của một gen cụ thể
có liên quan đến bệnh tật [25].
Hình 1.3 mô tả cơ chế RNAi phân hủy RNA. Các phần tử quan trọng
tham dự vào cơ chế can thiệp RNA này là hai enzymes, Dicer và Argonaute, và
những RNA k ch thước nhỏ (si RNA) được tạo ra từ RNA sợi đôi (ds RNA). Khi
có sự xâm nhập của chuỗi xoắn kép RNA vào tế bào, Dicer lập tức cắt những
chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotides, gọi là
siRNA có tiêu hao một phân tử ATP. Sau khi bị cắt ngắn bởi Dicer, chuỗi kép
RNA can thiệp được tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với
đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục liên kết
với Argonaute. Quá trình lựa chọn chuỗi đơn RNA này xảy ra trong phức hệ
RISC (RNA-induced silencing complex), trong đó có chứa Argounaute và
Helicase. Phức hệ RISC sau đó thu nhận các phân tử phiên mã mRNA của tế bào
có trình tự tương đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA lúc này đang có
mặt trong phức hệ RISC.
Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base tương đồng với trình
tự của siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA.
Phức hệ RISC sẽ cắt mRNA, làm phân tách phân tử mRNA mà không giải mã
nên không có protein nào được tổng hợp hay nói cách khác làm cho RNA bị suy
thoái [63].

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




19

1.3. Cơ chế RNAi phân hủy RNA [55].

các thí nghiệm chuyển gen do một số nhược điểm: có k ch thước lớn, mang các
gen gây khối u, không thể tự nhân lên… Vì vậy, các nhà khoa học đã cải tiến Ti
plasmid, cắt bỏ hầu hết các gen không cần thiết và thay vào đó là các gen chỉ thị
cho chọn lọc, gen đánh dấu và các promoter thích hợp để Ti plasmid có thể nhân
lên và biểu hiện trong E.coli, A.tumefaciens và tế bào thực vật. Các vector được
sử dụng có hiệu quả trong chuyển gen thông qua A.tumefaciens là: vector liên
hợp và vector nhị thể.
Vector (cointegrate) liên hợp là một Ti plasmid vector mang một số đoạn
chức năng của một vector thông thường khác của E. coli, và thường gồm những
phần sau: i) Một vị trí thích hợp cho phép ghép nối các đoạn gen quan tâm (gen
of interest = GOI), thường là có nguồn gốc từ một plasmid của vi khuẩn E. coli;
ii) Gen chỉ thị có t nh kháng kháng sinh để chọn lọc hoạt động được trong E. coli
và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở tế bào thực vật; iv) Đoạn
khởi đầu của E. coli, không hoạt động ở A. tumefaciens. Như vậy, vector liên
hợp thực chất là vector lai có chỗ cho GOI đi nhờ như một hành khách vào trong
tế bào thực vật [1], [12] .
Hệ vector nhị thể (binary vector) đặc trưng bởi việc phân cắt Ti plasmid
thành hai phần riêng biệt: Ti plasmid và vector T – DNA. Khắc phục tình trạng
khó nhân bản trong A. tumefaciens, loại vector nhị thể được thiết kế bao gồm các
phần như sau: i) Vị trí ghép nối đa điểm; ii) Đoạn khởi đầu tái bản hoạt động cả ở

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




21

E. coli và A. tumefaciens; iii) Gen chọn lọc hoạt động được ở cả vi khuẩn và thực
vật.; iv) gen có khả năng vận chuyển (như oriV, oriT, trfA), chỉ cần khi chuyển



22

trình di chuyển, sợi đơn DNA phải chui qua rất nhiều màng trước khi vào được
đến nhân tế bào thực vật. Vì vậy, để giữ được tình trạng nguyên vẹn thì T- DNA
sợi đơn được gắn với virE. Sản phẩm của gen vir B nằm trên màng tế bào vi
khuẩn có nhiệm vụ chuyển trực tiếp DNA sợi đơn sang tế bào thực vật. Sau khi
T-DNA chui được qua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với
DNA nhân thực vật ở những vị trí ngẫu nhiên. Tại đó các gen trên T- DNA dưới
sự điều khiển của gen thực vật bắt đầu sản sinh ra auxin và cytokinin. Đây là các
hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các khối u
[13]. Nhờ đặc điểm này người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA
bằng cách thay thế các gen tạo khối u (oncogens) nằm trong hai đầu vùng biên
bằng các gen mong muốn.
1.3.3. Nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus bằng kỹ thuật RNAi
RNAi là một hiện tượng phổ biến xảy ra ở sinh vật nhân chuẩn và đóng
vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học như điều hoà sự phát triển, tổ
chức lại nhiễm sắc thể và đặc biệt là quá trình kháng virus. Gần đây, RNAi được
xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu chống lại các bệnh do virus gây ra ở
thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi
đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật [27]. Tính hiệu
quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của
virus (gen mã hoá protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp...) có khả năng kháng
lại ch nh virus đó đã được chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo
cây trồng kháng các loại virus khác nhau như: Potato virus Y PVY [49],[51]
cucumber mosaic virus CMV, Plum pox potyvirus PPV [39] Tobaco mosaic
virus TMV và Potato virus Y PVY [51], Cho đến nay, đã có một số loại cây
trồng chuyển gen kháng bệnh virus được công nhận và trồng thương mại như:
Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã được

cao khả năng chịu hạn, kháng bệnh. Việc tạo cây chuyển gen kháng virus đã mở
ra một triển vọng mới trong nghiên cứu tạo giống đậu tương kháng virus tại Việt
Nam.

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




24

ươ

TL Ệ
2.1. ật ệu

c ất t

t

v đ

2

Ư NG
đ

ê c u

2.1.1. Vật liệu

Th nghiệm phân t ch cây chuyển gen được thực hiện tại Phòng công nghệ
ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viên Hàn lâm Khoa học Công nghệ
Việt Nam.
2.2. P ươ

ê c u

2.2.1. Phương pháp tái sinh cây đậu tương từ nách lá mầm
Phương pháp tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt ch n được tiến
hành dựa trên phương pháp của Olhoft và cộng sự (2001), Nguyễn Thu Hiền
(2011) [6], [42]. Các môi trường đều được chuẩn pH và khử trùng, thành phần
các loại môi trường sử dụng cho tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín
được trình bày ở bảng 2.1. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3
lần lặp lại. Các thí nghiệm của phần nuôi cây mô tế bào thực vật đựơc thực hiện
trong phòng nuôi cây với điều kiện chiếu sáng theo quang chu kì 16 giờ sáng và
8 giờ tối, nhiệt độ phòng 250C ± 2, cường độ chiếu sáng 2000 lux.
2.2.2.
tươ

ươ
c u

v

u

u

c