GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----------------------------------------

ĐẶNG THỊ THU PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU, SÀNG LỌC VÀ THU NHẬN APTAMER ĐẶC HIỆU
KHÁNG SINH STREPTOMYCIN VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ
LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG SỮA

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số

: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn:PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN

Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội – 12/2015

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
1

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
2

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

657/EC/2002) cho phép sử dụng phương pháp ELISA trong phân tích dư lượng các chất
kháng sinh cấm, tuy nhiên có những yêu cầu rất khắt khe về giới hạn phát hiện và độ
không đảm bảo đo, các tỷ lệ dương tính giả và âm tính giả của xét nghiệm. Một trong các
phương pháp hiện nay đang được tập trung nghiên cứu để xác định dư lượng kháng sinh là
phương pháp aptasensor (sử dụng aptamer tham gia cấu tạo sensor) điện hóa.
Aptamer là các oligonucleotide (các acid ribonucleoic, RNA và các sợi đơn của acid
deoxyribonucleic, ssDNA) hoặc là các phân tử peptide có cấu hình không gian đặc trưng
và có khả năng nhận biết và gắn kết với các phân tử đích tương đương kháng thể đơn
dòng. Aptamer đã trở thành lớp chất có nhiều tiềm năng và hy vọng nhất để tạo KIT chẩn
đoán và thuốc điều trị hướng đích,.. Với những ưu điểm vượt trội, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu khả năng sử dụng aptamer đặc hiệu kháng sinh streptomycin nhằm tạo KIT xác
định nhanh kháng sinh này trong thực phẩm.
Aptasensor là một Biosensor, một thiết bị phân tích có khả năng chuyển một tín hiệu
sinh học thành một tín hiệu quang hoặc tín hiệu điện. Đối với aptasensor điện hóa bao gồm
các yếu tố thành phần: (1) Phần nhận biết sinh học đối với aptasensor là aptamer; (2) Phần
chuyển đổi và khuếch đại tín hiệu nhận biết thành tín hiệu điện có thể định lượng; (3) Phần
xác định cường độ tín hiệu điện. Từ kết quả liên quan tới tín hiệu điện có thể suy ra lượng
chất phân tích cần xác định. Biosensor theo nguyên lý điện hóa hoạt động theo nguyên lý
chuyển hóa trực tiếp một hiện tượng sinh học thành tín hiệu điện để có thể đo được bằng
các thiết bị điện.

Sàng lọc Aptamer đặc hiệu với kháng sinh streptomycin

-

Tách dòng và chọn dòng các aptamer thu được có ái lực cao với kháng sinh đích

-

Sử dụng phương pháp ELISA để phát hiện dư lượng kháng sinh streptomycin

CHƢƠNG I : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
***
Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
4

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

1.1.Tổng quan về streptomycin
1.1.1. Kháng sinh streptomycin
Kháng sinh còn được gọi là trụ sinh là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay
kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp
độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình
phát triển của vi khuẩn.
Từ “antibiotics” (kháng sinh) có nguồn gốc từ chữ “antibiosis”. “anti” có nghĩa là
“chống lại” và “biosis” có nghĩa là “cuộc sống”. Chất kháng sinh tác động, chống lại một


amoxicillin

7

ampicillin

4

benzylpenicillin

Họ thuốc

Chất hoạt động

n

chlortetracycline

6

oxytetracycline

6

9

dihydrostreptomycin

3


aminoglycosides

Bảng 1.1 Phân loại (n : loại nhóm) các hợp chất hoạt động có trong thuốc thú y được
đăng ký ở Bỉ áp dụng để quản lý quá trình sản xuất sữa bò. ( 5/8/2010 - Anon.)
Trong thú y thường dùng streptomycin sulfat. Trong đó hàm lượng Dihydro
streptomycin chiếm 79,87%.
 Tác dụng:
Tác dụng trên các cầu khuẩn gram (+) kháng penicilin, tụ cầu khuẩn, đóng dấu, nhiệt
thán, phế cầu, liên cầu (có tác dụng hiệp đồng với kháng sinh nhóm β lactam)

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
6

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

Tác dụng chủ yếu đối với vi khuẩn gram (-). Đặc biệt nhạy cảm là: vi khuẩn tụ huyết
trùng, E.coli, shigella (lỵ), pseudomonas, salmonella (vi khuẩn thương hàn), Haemophilus,
Brucella.
Đặc biệt tác dụng đối với trực khuẩn lao, brucella và các xoắn khuẩn (leptospira)
Vi khuẩn kháng streptomycin: khuẩn kỵ khí, trực khuẩn mủ xanh và 1 số nấm bệnh.
Hấp thu nhanh qua mao mạch và thải trừ qua thận sau khi tiêm nồng độ streptomycin
cao nhất trong máu vào giờ thứ 2. Thải trừ nhanh qua thận 50-70% và sau 12 giờ thải trừ
hết.
Ứng dụng điều trị: Người ta thường kết hợp streptomycin với các sulfamid hay với

1.1.2. Cơ chế tác động của kháng sinh streptomycin lên vi khuẩn
Streptomycin là thuốc diệt khuẩn, ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn ở mức
ribosom. Streptomycin gắn đặc hiệu vào tiểu phần 30s của ribosom ở vị trí P10. Do vậy, mã
bị đọc sai, gây tổng hợp và tích lũy protein sai lạc, kìm hãm vi khuẩn phát triển.
Streptomycin gây rối loạn cả quá trình tổng hợp khâu khởi đầu, kéo dài đến kết thúc, do có
thể những P8 và P11... cũng gắn vào Streptomycin. Ngoài ra còn có cơ chế khác như: thay
đổi tính thấm màng, hô hấp tế bào, đến DNA của vi khuẩn.

Hình 1.2. Kháng sinh tác động đến sự tổng hợp protein
1.1.3. Kháng sinh trong chăn nuôi
1.1.3.1. Tác dụng của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
8

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh là rất phổ biến. Nó được
sử dụng với 3 mục đích: điều trị bệnh, phòng bệnh và dùng như chất kích thích sinh trưởng
đem lại những lợi ích sau:
-

Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm

-

Council Directive 96/23/EC of 29 April 1996, về định lượng các chất trong động vật sống
và sản phẩm từ động vật
1.1.3.2. Tình hình sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ở một số quốc gia

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
9

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

* Trên thế giới
ở Mỹ, hàng năm có khoảng 6 triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh được dùng trong
chăn nuôi. Xấp xỉ 80% gia cầm, 70% lợn, 70% bò sữa và 60% thịt bò ở Mỹ được nuôi
dưỡng bằng thức ăn có bổ sung kháng sinh và cứ mỗi một USD chi phí cho kháng sinh
dùng trong thức ăn, người chăn nuôi thu được lợi tức 2 – 4 USD.
Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong chăn
nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu pao (9270 tấn), trong đó kháng sinh nhóm
ionophore và arsen chiếm nhiều nhất (47,5%), tetracycline (15,67%), penicillin (4,26%) và
các loại khác (32,57%). Trong số 20,42 triệu pao, có khoảng 2,8 triệu pao (13,7%) được
dùng như chất kích thích sinh trưởng.
Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng trong
nhân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10.500 tấn (quy theo mức 100% tinh khiết của
các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong nhân y, 33% trong điều trị thú y và
15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi.
*Tại Việt Nam
Theo tổng hợp việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi thú y ở Việt Nam – TS.

và 16,67% sử dụng thuốc theo thông tin và khuyến cáo của nhà sản xuất, chỉ có
5,95% trại sử dụng thuốc theo kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ

-

Tỉ lệ mẫu thức ăn chăn nuôi có sử dụng kháng sinh lần lượt là : tylosin 31/60 mẫu
(51,67%), tetracyclin : 25/60 mẫu (41,16%), oxytetracycylin: 4/60 mẫu (6,6%) và
chlotetracycline: 15/60 mẫu (25%)

-

Số mẫu vượt quá quy định theo 10TCN 861 – 2006: tylosin 1/60 mẫu (1,66%),
tetracycline 2/60 mẫu (3,3%), oxytetracyline 1/60 mẫu (1,66%), chlotetracycline
9/60 mẫu (15%) [9,10,11,13]

Hình 1.3. Biểu đồ tỉ lệ 13 loại kháng sinh sử dụng nhiều nhất ở 55 trại chăn nuôi tại
Đồng Nai, Bình Dương
1.1.4. Dƣ lƣợng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm và một số phƣơng pháp xác
định dƣ lƣợng kháng sinh.
1.1.4.1.

Dƣ lƣợng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm và sữa

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
11

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn



Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
12

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

Nhiều nghiên cứu trong nước cũng cho thấy tình trạng lờn thuốc của các vi khuẩn gây
bệnh với tỉ lệ rất cao, chính vì thế mà dịch bệnh thường xuyên xảy ra và một số loại kháng
sinh đặc hiệu cho một số bệnh trên đường hô hấp và đường tiêu hóa đã không còn tác dụng
nữa.
Quy định về tồn dƣ kháng sinh streptomycin trong thực phẩm

1.1.4.2.

Sự tồn dư streptomycin trong thực phẩm có nguồn gốc động vật có thể gây dị ứng.
Người ta cũng thấy có sự phát triển của các chủng vi khuẩn kháng thuốc khi thực phẩm có
dư lượng kháng sinh streptomycin. Các yếu tố kháng thuốc khi truyền vào con người sẽ trở
thành nguy cơ tiềm ẩn và có thể làm giảm đáng kể hiệu quả của thuốc kháng sinh chữa
bệnh cho người. Trong ngành công nghiệp sữa, sữa có tồn dư kháng sinh có thể phá hoại
các sản phẩm lên men như sữa chua hay pho mát do sự kìm hãm các giống khởi động và
gây ra thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Cây cối có phun nồng độ cao streptomycin có thể tạo
ra chuỗi lan nhiễm từ phấn hoa, mật hoa, ong và cuối cùng là mật ong.
Để bảo vệ người tiêu dùng, các nhà chức trách đã thiết lập giới hạn dư lượng cho
phép đối với hầu hết các thuốc thú ý được cấp phép sử dụng trong thực phẩm có nguồn
gốc động vật. Các giới hạn này dựa trên các dữ liệu độc tố bao quát từ các thử nghiệm y


(trâu,

200

Sữa

Gia súc, cừu, lợn,

500

Cơ

gia cầm

500

Mỡ

500

Gan

500

Thận

Gia súc, cừu

200


500

Cơ

cừu, lợn

1000

Thận

500

Mỡ

500

Gan

2000

Thận

500

Mô ăn được

2000

Thận

Bảng 1.3: Giới hạn dư lượng streptomycin và dihydrostreptomycin theo quyết định
46/2007/QĐ-BYT

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
14

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

MRL (µg/kg)

Thực phẩm
Trâu, bò và cừu
Sữa (µg/l)

200

Thịt

600

Gan

600

Thận

bình chất tồn dư có trong một loại mô mà một người có thể sử dụng trong 1 ngày,
không gây độc tính

-

MRL (maximum residue limit) giới hạn tồn dư tối đa: hàm lượng cao nhất mà chất
tồn dư được phép có trong một khối lượng mô (µg/kg, UI/lit)

Bảng 1.4. Quy định giới hạn dư lượng streptomycin/dihydrostreptomycin trong các sản
phẩm sữa [4,5,6,7,8]
Quy chuẩn

Phạm vi quản lý

QCVN 5-1:2010/BYT: Quy

Các sản phẩm sữa dạng lỏng:

chuẩn kỹ thuật quốc gia đối

sữa tươi nguyên chất thanh

Đặng Thị Thu Phương

Giới hạn
tối đa
(µg/kg)

Phân
loại


bột, cream bột, whey bột, sữa bột

với các sản phẩm sữa dạng

gầy có bổ sung chất béo thực vật

200

A

200

A

200

A

200

A

bột.
QCVN 5-3:2010/BYT: Quy

Các sản phẩm phomat sản xuất

chuẩn kỹ thuật quốc gia đối


phương pháp vi sinh vật (Phạm Kim Đăng và cs., 2007; Bogaerts and Wolf, 1980;
Myllyniemi et al., 1999), bán định lượng bằng phương pháp ELISA, định lượng bằng
phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (Chukwuenweniwe et al., 2003), phương pháp

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
16

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

sắc ký lỏng hiệu năng cao (Nguyễn Minh Đức, 2006; Robert and Fischer, 1978)… Trong
những năm gần đây, kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ đang được nghiên cứu và áp dụng đối
với các nhóm kháng sinh… Với tính ưu việt và chính xác nên chỉ các phương pháp phân
tích sắc ký khối phổ mới được coi là phương pháp phân tích khẳng định, có giá trị pháp lý
để phát hiện và định lượng, đặc biệt đối với nhóm chất cấm hoặc các chất cần được kiểm
soát ở lượng vết hay siêu vết. Tuy nhiên, do tính phức tạp, tính đặc hiệu của phương pháp
nên việc ứng dụng, vận hành ổn định và giá thành phân tích luôn là thách thức đối với
người làm công tác phân tích.

Hình 1.4: Biểu đồ phân bố tỉ lệ các phương pháp phân tích sử dụng để xác định kháng
sinh trong thực phẩm (Cháfer-Pericás et al., 2010)
Bên cạnh phương pháp chính là sắc ký, phương pháp sinh hóa – công nghệ sinh học,
đặc biệt là phương pháp dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên – kháng thể cũng được sử
dụng rộng rãi, và có nhiều kết quả ứng dụng. Cụ thể, dựa trên phân loại sáng chế quốc tế
IPC (International Patent Classification) của các sáng chế về phân tích dư lượng kháng
sinh được đăng ký cho thấy 2 xu hướng nghiên cứu chính là dựa trên hóa tính, lý tính và

lớn. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi thiết bị, quy trình kiểm soát chất lượng và
tay nghề cao vì thế phần nào hạn chế phạm vi ứng dụng thực tế

-

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enxyme (ELISA – Enzyme linked
Immuno Sorbent Assay): dùng kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng
nguyên trong mẫu cần phân tích, hiện được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
như y học, nông nghiệp và đặc biệt trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
18

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

các sản phẩm thực phẩm. Thị trường tiềm năng hiện nay của phương pháp này là
lĩnh vực kiểm soát dư lượng kháng sinh trong thực phẩm, bệnh nhiệt đới… Phương
pháp ELISA có ưu điểm nhanh, thao tác đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết
bị đắt tiền, không cần nhân viên chuyên môn cao, chi phí kiểm mẫu thấp do có thể
kiểm đồng thời số lượng mẫu lớn. Tuy nhiên, nhược điểm do đây là sinh phẩm nên
một số hóa chất phải bảo quản lạnh và có hạn sử dụng nhất định, độ chính xác
không cao bằng các phương pháp hóa lý như phương pháp sắc ký vì thế chỉ thích
hợp với các phân tích sàng lọc hơn là các phân tích định lượng

Hình 1.6: KIT dùng trong sắc ký miễn dịch

-

Tuerk C., Gold L.: Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:
RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990; 249: 505-10

-

Ellington Ad, Szostak JW: in vitro selection of RNA molecules that bind specific
ligands, Nature 1990, 346:818-22

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
20

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

-

Hiện nay đã có hơn 2000 ấn phẩm về aptamer
Aptamer là các cấu trúc DNA, RNA hay peptide ngắn có tiềm năng liệu pháp điều trị

lớn, do chúng có năng lực đặc hiệu và ái lực tương đương với các phân tử và protein đích
các kháng thể không phù hợp. Những cấu trúc này có thể được dùng như là các kháng thể
tổng hợp và hoạt động như các chất bổ sung để đạt tới những vùng mà liệu pháp điều trị
trước đó không chạm tới được.
Các aptamer nhận biết hầu như một phổ không giới hạn các phân tử đích, không bị

-

Loại thuốc điều trị mới

-

Công cụ liệu pháp

-

Chuyển giao thuốc

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
23

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

-

Chẩn đoán bệnh

-

Cảm biến sinh học


có thể được chọn lọc nhờ quá trình SELEX trong nhiều giờ, được phân lập, hoàn thiện
sau khi tạo ra – aptamer luôn tồn tại, chỉ cần tìm ra chúng.
c. Sản xuất: quá trình tạo aptamer có thể được thực hiện hoàn toàn ngoài tế bào, trong ống
nghiệm, điều kiện môi trường thông thường do chúng không phải chịu các điều kiện
như của động vật. Quá trình này cũng nhanh hơn và rẻ hơn so với quá trình tạo kháng
thể đơn dòng.
d. Đích: Các aptamer có phổ đích hầu như không giới hạn, bao gồm cả các phân tử kháng
thể không nhận biết

Đặng Thị Thu Phương

Viện Sinh Thái&Tài Nguyên Sinh Vật K17
24

Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn


GVHD: PGS.TS. Lê Quang Huấn

e. Kháng nguyên: bởi vì axit nucleic không bị coi là chất lạ trong hệ thống miễn dịch, các
aptamer có ít rủi ro đối với các đáp ứng miễn dịch chống lại chúng, có tác động hiệu
quả, đặc biệt với thuốc dựa trên công nghệ aptamer.
f. Kích thước: Do chúng có kích thước nhỏ, các aptamer, thậm chí cả khi kết hợp, có thể
đi qua cơ thể theo cách các phân tử lớn, như kháng thể không thực hiện được.
g. Khả năng biến đổi : Các aptamer có thể biến đổi, hoặc bằng cách thay đổi hoá học cẩu
trúc của chúng, hoặc gắn kết, hoặc tiếp hợp, hoặc bổ sung các phần như polyethylene
glycol để chống lại quá trình lọc của thận, hoặc của thuốc,…

Hình 1.11: Minh họa kích thước aptamer – kháng thể
1.2.4. Phƣơng pháp thu nhận aptamer – phƣơng pháp SELEX