Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
===    ===

HOÀNG THỊ THANH

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH
NĂM GIỐNG HOA CÚC (TÍM HUẾ, PHA LÊ,
PHAN TRẮNG, PHÁO HOA, KIM CƯƠNG)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Người hướng dẫn khoa học:
TS. LA VIỆT HỒNG

HÀ NỘI - 2016


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến
TS. La Việt Hồng đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều
kiện để tôi hoàn thành khóa luận này.

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BAP

6- benzyl amino purin

NAA

Napthalene acelic acid

CT

Công thức

Agar

Thạch

MS

Murashige & Skoog, 1962

ĐC

Đối chứng


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

2.5.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................ 13
2.5.3. Phương pháp phân tích thống kê số liệu ......................................... 14
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 15
3.1. Tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro của năm giống hoa cúc .............. 15
3.1.1. Giống cúc Tím huế ......................................................................... 16
3.1.2. Giống cúc Phan trắng...................................................................... 19
3.1.3. Giống cúc Pha lê ............................................................................. 22
3.1.4. Giống cúc Pháo hoa ........................................................................ 25
3.1.5. Giống cúc Kim cương ..................................................................... 28
3.2. Ảnh hưởng của NAA tới khả năng ra rễ - tạo cây hoàn chỉnh của
chồi cúc ........................................................................................................ 31
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 36
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 40


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các giống cúc được sử dụng trong nghiên cứu *....................................... 11
Bảng 3.1.1. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân
nhanh chồi của giống cúc Tím huế........................................................ 16
Bảng 3.1.2. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân

1. Lí do chọn đề tài
Cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) là một loài hoa trồng chậu và cắt
cành phổ biến trên thế giới. Ngày nay, nó đã được nhân giống thành công
bằng nhiều phương pháp như nuôi cấy đoạn cắt, mô sẹo, tế bào trần và tái
sinh thành cây con [20]. Cùng với sự phát triển của xã hội, chất lượng cuộc
sống con người được nâng cao thì người ta càng chú ý đến những giá trị thẩm
mỹ và tinh thần; trong đó hoa là một trong những lựa chọn của con người để
làm đẹp cho cuộc sống, sản xuất hoa trở thành ngành kinh tế phát triển đem
lại nhiều giá trị kinh tế cao. Hoa cúc là một trong những loại hoa được ưa
chuộng và phổ biến nhất. Hoa cúc hấp dẫn con người bởi sự đa dạng về màu
sắc, dáng vẻ; chúng được sử dụng nhiều trong các buổi lễ trang trọng; nhiều
loài còn có tác dụng chữa bệnh, dùng để tách chiết tinh dầu hay ngâm rượu;
giá cả lại phải chăng. Ngoài ra, hoa cúc còn có sự hấp dẫn lớn tới các nhà
kinh doanh bởi độ bền, bông lâu tàn, khi tàn bông chỉ héo chứ không rụng,
năng suất cao. Với các ưu thế đó, hoa cúc đang được các nhà trồng hoa chú
trọng phát triển.
Khi sản xuất được mở rộng, nhu cầu về giống cũng tăng theo, phương
pháp nhân giống cũng không ngừng cải tiến. Cây hoa cúc được nhân giống
chủ yếu bằng phương pháp vô tính qua phương pháp giâm cành truyền thống.
Nhiều năm qua, thực tế cho thấy phương pháp này không đáp ứng kịp nhu cầu
giống, mặt khác còn mang nguy cơ lây lan bệnh hại và làm thoái hóa giống.
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, công nghệ nhân giống vô tính
bằng phương pháp nuôi cấy in vitro tỏ ra rất hiệu quả trong sản xuất số lượng
lớn cây trồng sạch bệnh với tốc độ nhanh, chất lượng đồng nhất về mặt di
truyền, không những tận dụng được chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ mà còn

1


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


2


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Nguồn gốc
Hoa cúc còn được gọi Higo-giku (bằng tiếng Nhật), nghĩa là hoa vàng,
có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản (C. indicum và C. zawadskii) được
trồng cách đây khoảng 2000 năm [22], [27]. Cúc Higo là cây trồng tự nhiên
chỉ có duy nhất ở Higo (trước đây là tỉnh Kumamoto) của đảo Kyushu, được
đặc trưng bởi hình thức canh tác độc đáo và kỹ thuật sản xuất có uy tín vào
nửa sau thế kỷ XVII [34]. C. coronarium và C. segetum phân bố rộng rãi ở
Địa Trung Hải, phía tây châu Phi và châu Á [37].
Vào năm 1860, nhân dịp thăm viếng Nhật Bản, ông Robert Fortune đã
đem về Châu Âu nhiều loại cúc mới. Trong sự phát triển hoa cúc, chính sự lai
giống tiếp của các loại cúc này mà người ta được thêm nhiều giống mới nữa.
Ở châu Úc, hoa cúc được trồng tại Tasmania vào năm 1836, New South
Wales 1843, Victoria 1855 và ở New Zealand 1860. Ở Mỹ cuối thế kỷ XIX,
cúc được trồng rất nhiều. Riêng hoa cúc của Việt Nam hiện tại có xuất xứ từ
Trung Quốc, Nhật Bản và châu Âu.
Trên thế giới đã có rất nhiều hội Hoa Cúc Quốc gia được thành lập. Ở
Anh Hội Hoa Cúc Anh Quốc được thành lập vào năm 1846 tại Stoke
Newington. Dần dần nhiều Hội Hoa Cúc Quốc Gia khác cũng được thành lập
như ở Canada, Châu Úc, New Zealand, Mỹ, Pháp và Nam Phi...
Hoa cúc có tên khoa học là Chrysanthemum vào năm 1753. Nhà thực vật

Quả: Cây hoa cúc có dạng quả bế khô, hình trụ, hơi dẹt, chỉ chứa một
hạt. Hạt có phôi thẳng và không có nội nhũ [15].
1.4. Giá trị sử dụng
Phân loài của họ cúc rất đa dạng, bao gồm các giống cây trồng quan
trọng (hoa cắt) và cây trồng trang trí (chậu và vườn), cũng như các cây trồng
thực phẩm trong nấu nướng, có dược tính và dược lý đang được quan tâm
[24]. Năm 1966, hoa cúc được Thị trưởng Richard J. Daley công nhận là hoa
chính thức của thành phố Chicago, Illinois [38]. Hoa cúc cũng là hoa chính
thức của thành phố Salinas, California. Ở Trung Quốc, một số loại hoa cúc

4


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

được sử dụng làm trà, thậm chí được sử dụng làm thuốc trừ sâu thân thiện
môi trường. Ở Nhật Bản, hoa cúc được coi là người bạn tâm tình và có một
“lễ hội hạnh phúc” để kỉ niệm. Hoa cúc được dử dụng rộng rãi ở Nhật Bản:
40% sử dụng làm quà, 25% cho các cơ sở thương mại (khách sạn, sự kiện),
25% sử dụng trong gia đình để thờ cúng và 10% cho mục đích giáo dục trong
giảng dạy cắm hoa nghệ thuật [29]… Riêng ở Việt Nam, hoa cúc thường có
mặt ở công viên, vườn hoa, phòng khách, bàn làm việc, trong các lễ thăm
viếng… Ngoài ra cúc còn được trồng đại trà nhằm mục đích cắm hoa bình,
trồng trong bồn hay để trang trí… [5], [37]. Hoa cúc Garland C. coronarium,
trồng ở Nhật Bản, Trung Quốc và Đông Nam Á là họ hàng gần của rau diếp và là
một loài ăn được có giá trị [31]. Cúc cũng như như các thành viên khác của
Anthemideae là một nguồn cung cấp các chất chuyển hóa thứ cấp có giá trị sinh
học, các hợp chất có hoạt tính và các loại tinh dầu [17].

cúc mỗi năm [21], Nhật Bản là quốc gia đứng đầu thế giới về sản xuất hoa
cúc (2 tỷ USD), tiếp theo là Hà Lan (800 triệu USD), Colombia (600 triệu
USD), Italy (500 triệu USD) và Mỹ (300 triệu USD) [23].
1.5.2. Tình hình sản xuất và thương mại hoa cúc ở Việt Nam
Ở Việt Nam, diện tích trồng hoa cúc còn ở mức khiêm tốn, khoảng 3500
ha, chủ yếu tập trung ở các vùng trồng hoa như: Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt…
chủ yếu là các giống cúc nhập nội. Riêng Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh
hàng năm sản xuất hàng chục triệu cành hoa cúc cắt, cúc chậu phục vụ nhu
cầu trong nước.
Ở Hải Phòng cúc là cây quan trọng thứ hai trong cơ cấu sản xuất hoa
tươi. Cùng với Layơn, cúc là mặt hàng xuất khẩu tiềm năng trong những
năm tới.
Ở các tỉnh phía nam như Đà Lạt, Huế là nơi có diện tích trồng cúc lớn
nhất. Đà Lạt là vùng lý tưởng cho nhiều giống cúc sinh trưởng và phát triển.
Có thể nói, so với những năm trước đây sản xuất hoa cúc ở Việt Nam đã tăng
lên đáng kể. Tuy nhiên, lượng hoa sản xuất ra còn rất hạn chế so với nhu cầu
rất cao của thị trường, cũng như tiềm năng kinh tế to lớn mà cây hoa cúc có
thể đem lại nếu được đầu tư phát triển. Năm 2014, hoa cúc nhập khẩu từ Việt

6


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Nam được giao dịch với giá 29 Yen/cành trên thị trường bán sỉ tại Tokyo, chỉ
bằng một nửa so với giá cúc trồng tại Nhật và thấp hơn từ 30 - 40% đối với
cúc nhập từ Malaysia, Trung Quốc [39].
Hiện nay ở Việt Nam, việc nhân giống cây hoa cúc chủ yếu bằng phương

dễ thành công, ít nhiễm bệnh, có hiệu quả cao hơn so với việc sử dụng các bộ
phận khác của hoa cúc để nuôi cấy. Sử dụng phương pháp này cho phép tạo ra
một số lượng lớn cây con sạch bệnh và đồng nhất về mặt di truyền trong thời
gian ngắn, hoàn toàn đáp ứng được cho sản xuất ở quy mô công nghiệp.
Smavanda Vantu (2005), tiến hành nhân nhanh 2 giống Prince de Monaco
và Romica bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, kết quả môi trường MS bổ
sung BAP 2 mg/l và NAA 0,002 mg/l cho kết quả tối ưu [33].
Methods Mol Biol (2010), tiến hành nhân giống từ đốt thân của giống
Kitam trên môi trường MS cơ bản, chiếu tia gama gây đột biến làm thay đổi
màu sắc ban đầu của hoa [28].
Kashif Waseem và cộng sự (2011), tiến hành nhân nhanh cây hoa cúc
(Chrysanthemum morifolium L.) từ đốt thân. Sau khi khử trùng với HgCl 1%,
họ tiến hành nuôi cấy mẫu trên môi trường MS cơ bản bổ sung IAA, BAP,
NAA với các nồng độ khác nhau. Kết quả: môi trường MS bổ sung IAA 0,3
mg/l và MS bổ sung BAP 1,0 mg/l là tốt nhất cho nhân nhanh và tái sinh chồi
cúc; môi trường bổ sung IBA 0,2 mg/l kết hợp NAA 0,2 mg/l phù hợp nhất cho
ra rễ tạo cây hoàn chỉnh [25].
Snjezana Keresa và cộng sự (2012), tiến hành nhân nhanh giống cúc
Palisade White từ chồi nách và phôi soma bằng vi nhân giống trên môi trường
bổ sung các loại chất điều hòa sinh trưởng có nồng độ khác nhau như: BAP,
GA, IAA, NAA, IAB, 2,4_D. Kết quả: môi trường MS bổ sung BAP 0,1 mg/l
+ GA 0,5 mg/l cho hệ số nhân cao nhất từ 3,7 - 4,1 chồi/mẫu; môi trường bổ
sung IAA 2mg/l cho rễ dài nhất (2,24 cm); môi trường bổ sung IBA 0,5 mg/l
cho nhiều rễ nhất: khoảng (5,3 rễ/chồi) [32].
Aurelia Slusarkiewicz-Jarzina và cộng sự (2014), sử dụng mô lá của
giống Bronze Bornholm nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung cytokinins
(kinetin - KIN, zeatin - ZEA, BAP) và auxins (2,4_D, NAA, IAA, PFA) với

8


sung NAA (0,2 - 0,5 mg/l), IBA (0,2 - 0,5 mg/l) đều tạo rễ cho chồi cây hoa
cúc tốt hơn trong môi trường 1/2 MS có bổ sung IAA (0,2 - 0,5 mg/l) [7].

9


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Trần Thu Hiền và cộng sự (2007), nghiên cứu phương pháp sản xuất giống
cúc CN97 bằng nuôi cấy mô tế bào, kết luận môi trường bổ sung NAA 0,5 mg/l là
môi trường ra rễ tạo cây hoàn chỉnh phù hợp nhất cho chồi cúc CN97 [11].
Hoàng Thị Thái Hòa và Đỗ Đinh Thục (2010), nghiên cứu ảnh hưởng
của một số loại phân bón lá Diệp lục tố, Growmore, Agriconik, phân chiết
suất từ cá, hỗn hợp ngâm ủ (gồm: cá kết hợp chất dinh dưỡng vô cơ) đến sự
sinh trưởng và phát triển của cây hoa cúc Chi vàng Đà Lạt [2].
La Việt Hồng và cộng sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy
trình nhân nhanh giống cúc CN01 bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Kết quả
cho thấy: môi trường tái sinh đa chồi phù hợp là môi trường MS bổ sung BAP
0,7 mg/l; môi trường ra rễ cho cây in vitro là môi trường MS bổ sung NAA
0,3 mg/l; cây con được rèn luyện trên giá thể tro trấu và xơ dừa (1:1) cho tỷ lệ
sống cao nhất [3].

10


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Sinh lý thực vật, khoa Sinh KTNN - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.2.1. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, panh gắp, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, pipet, kéo…
2.2.2. Thiết bị
Nồi hấp khử trùng, máy cất nước 2 lần, máy đo pH, cân kĩ thuật, tủ
lạnh Hitachi, tủ lạnh sâu, buồng cấy vô trùng, Cân phân tích
2.3. Môi trường nuôi cấy và chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Môi trường nuôi cấy cơ bản [13]: MS + 30 g/l đường sacharose + 7 g/l
agar và chất điều hòa sinh trưởng của hãng Dulchefa, Hà Lan chứa khoáng đa
lượng, vi lượng và vitamin, pH môi trường là 5,8.
Các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng: BAP (6-benzyl amoni
purie), NAA (α- Naphthalene acetic acid). Ngoài ra trong nghiên cứu còn sử
dụng nước dừa.

11


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

BAP là một homone thực vật nằm trong nhóm cytokinin. Nó là dạng
cytokinin tổng hợp đầu tiên giúp cho quá trình phát triển của cây. Trong nuôi
cấy mô tế bào thực vật, BAP đã được sử dụng từ lâu và đem lại các kết quả
rất tích cực BAP được sử dụng với mục đích kích thích tạo nhánh bên. Tuy
nhiên chồi bên tạo ra có kích thước nhỏ [1], và có thể gây ra hiện tượng mọng
nước (thủy tinh thể và kìm hãm sự tạo rễ). Ở nồng độ BAP quá cao sẽ dẫn đến
việc mọc quá nhiều chồi không như mong muốn.
NAA là một homone thực vật nằm trong nhóm auxin. Là chất điều khiển

chất lượng tương đương nhau. Mẫu được cấy trong bình, mỗi công thức nhắc
lại 3 bình, mỗi bình cấy 6 mẫu.
2.5.2. Phương pháp nghiên cứu
a. Tái sinh và nhân nhanh chồi
Đánh giá thí nghiệm sau 4 tuần theo dõi dựa trên chỉ tiêu:
- Số chồi/mẫu.
- Chiều cao chồi (cm): Được đo bằng thước kẻ, đối tượng được đặt song
song với thước kẻ thẳng, gốc chồi được đặt tương đương với vạch mức 0 cm
của thước, ngọn chạm tương ứng vạch nào thì đó là chiều cao chồi.
- Theo dõi sự hình thành của chồi mới phát sinh và đặc điểm của mẫu
nuôi cấy. Cụ thể: nguồn gốc chồi phát sinh, mức độ đồng đều của chồi, sự
hoại tử và thủy tinh hóa.
* Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh và
tạo đa chồi ở một số giống cúc
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30 g/l đường sacharose
+ 7 g/l agar có bổ sung BAP với nồng độ như sau: 0; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 mg/l.
* Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp 10% nước dừa đến
khả năng tái sinh và tạo đa chồi của cây hoa cúc in vitro
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30g/l đường
sacharose + 7 g/l agar có bổ sung 10% nước dừa kết hợp BAP với nồng độ
như sau: 0,3; 0,5; 0,7 mg/l.
* Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp BAP đến khả
năng tái sinh và tạo đa chồi ở một số giống cúc
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30 g/l đường
sacharose + 7 g/l agar có bổ sung NAA kết hợp BAP với nồng độ như sau:

13


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

3.1.1. Giống cúc Tím huế
Bảng 3.1.1. Ảnh hưởng của BAP, nước dừa, NAA đến sự tái sinh và nhân nhanh chồi của giống cúc Tím huế
Công thức

Số chồi/mẫu

Nguồn gốc chồi

Chiều cao

phát sinh

chôi (cm)

Thân

Độ đồng đều

Đặc điểm

của chồi

chồi

Mô sẹo


BAP0,3

7,00±1,00c

3,00±0,00c

X

Đều

Xanh-mập

Đen/1 cm

X

X

BAP0,5

7,00±1,73cd

2,83±0,29c

X

Đều

Xanh-mập


2,00±0,00ab

X

Đều

Xanh-gầy

Xanh/0,5 cm

-

X

4,67±0,29

2,00±0,50

Hiệu quả của BAP+10% nước dừa
b

BAP0,3+10% ND

10,67±0,58

BAP0,5+10% ND

10,00±1,73b
7,00±1,00


Đều

Xanh-mập

-

-

-

a

X

Đều

Xanh-mập

-

X

-

2,67±0,29

2,00±0,00

Hiệu quả của NAA+BAP

NAA0,02+BAP1,0

10,00±1,00c

2,33±0,29bc

X

Đều

Xanh-mập

-

X

-

NAA0,04+BAP0,5

6,67±1,15ab

2,50±0,00bc

X

Đều

Xanh-mập


1,60±0,17a

X

Không đều

Xanh-mập

-

-

-

2,33±0,29

2,00±0,00

với mỗi thí nghiệm, trong cùng một cột, ký tự theo sau khác nhau a, b, c… thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê với α=0,05

16


Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

Khóa luận tốt nghiệp

Kết quả thí nghiệm cho thấy: Hầu hết các công thức đều cho chồi xanh,
mập, các chồi đều nhau, các mẫu phản ứng tốt. Ở các công thức bổ sung BAP
đều xuất hiện mô sẹo ở ngay đầu tuần thứ 3, đến tuần thứ 4 các mô sẹo này