TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

PHẠM THỊ NHUNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN
(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)
BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ
BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

HÀ NỘI, 2016


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
===o0o===

PHẠM THỊ NHUNG

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH
NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN
(ANOECTOCHILUS SETACEUS BLUME)
BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ
BÀO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật



LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan kết quả nghiên cứu đề tài: “Hoàn thiện quy trình
nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi do TS. La Việt
Hồng hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trong nghiên cứu này là trung thực và
chưa được ai công bố.
Hà Nội, ngày 12 tháng 04 năm 2016
Sinh viên

Phạm Thị Nhung


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NAA:

Napthlacetic acid

BAP:

6-Benzyl amino purin

KI:

Kinetin

MS:


1.1.2. Đặc điểm thực vật học .................................................................... 4
1.1.3. Sinh học và sinh thái ...................................................................... 5
1.1.4. Phân bố ........................................................................................... 5
1.1.5. Công dụng của lan Kim tuyến ........................................................ 5
1.1.6. Thực trạng khai thác và phát triển cây lan Kim tuyến
ở Việt Nam ................................................................................................ 8
1.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam ........................................... 8
1.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến ........ 10
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................... 10
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................. 12
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 15
2.1. Vật liệu thực vật ................................................................................. 15
2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................... 15
2.2.1. Dụng cụ ........................................................................................ 15
2.2.2. Thiết bị .......................................................................................... 15
2.3. Môi trường nuôi cấy ........................................................................... 15


2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro ................................................................. 15
2.5. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 16
2.5.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................... 16
2.5.3. Phương pháp phân tích thống kê kết quả thực nghiệm ................ 18
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................... 19
3.1. Hoàn thiện giai đoạn tái sinh lan Kim tuyến in vitro ......................... 19
3.2. Hoàn thiện giai đoạn ra rễ tạo cây lan Kim tuyến in vitro
hoàn chỉnh.................................................................................................. 22
3.3. Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây lan Kim tuyến với điều kiện
tự nhiên ...................................................................................................... 24
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 26
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 27

(Orchidaceae) là loại thảo dược quý hiếm của Việt Nam [1]. Ở nước ta, cây
lan Kim tuyến mọc rải rác ở trong rừng núi đá vôi, nơi ẩm, dọc theo khe
suối, ở độ cao 300-1000 m như Sa Pa (Lào Cai), Quản Bạ (Hà Giang), Tam
Đảo (Vĩnh Phúc), Mĩ Đức (Hà Tây)… Lan Kim tuyến được cấp báo thuộc
nhóm IA của Nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích
thương mại [3] và nhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a, c, d, trong
sách đỏ Việt Nam [4].
Trong y học, lan Kim tuyến được sử dụng làm thuốc trị lao phổi, ho do
phế nhiệt, phong thấp, đau nhức khớp xương, chấn thương, viêm dạ dày
mãn tính, viêm khí quản, viêm gan mãn tính, suy nhược thần kinh, giúp tăng
cường sức khoẻ, làm khí huyết lưu thông, có tính kháng khuẩn [24].
Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở
ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp, sau đây là những
ưu điểm chính: cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh
trưởng, phát triển và đạt năng suất cao. Tạo cây con đồng nhất về mặt di
truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. Tạo được dòng thuần của
các cây tạp giao. Tạo được cây có gen mới (đa bội, đơn bội). Bảo quản và
lưu trữ tập đoàn gen. Có khả năng sản xuất quanh năm. Có thể nhân nhanh
nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt
nảy mầm kém. Hệ số nhân giống cực cao, rút ngắn thời gian đưa một giống
mới vào sản xuất đại trà [2].
Về phương diện hệ số nhân giống, nhân giống in vitro là phương pháp
không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Theo

Phạm Thị Nhung

1


Mai Thị Tân và cộng sự đã đạt được hệ số nhân 532 trong vòng một năm đối


2. Mục đích nghiên cứu
Hoàn thiện quy trình nhân nhanh loài lan Kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nhằm góp phần bảo
tồn và phát triển loài lan dược liệu quý hiếm của Việt Nam, đáp ứng nhu cầu
cây lan Kim tuyến giống phục vụ nhu cầu con người.
3. Nội dung nghiên cứu
Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh giống cây lan Kim tuyến bằng kỹ
thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Hoàn thiện giai đoạn ra rễ của lan Kim tuyến in vitro.
Hoàn thiện giai đoạn rèn luyện cây con lan Kim tuyến in vitro.
4. Phạm vi nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học
Sư phạm Hà Nội 2.
5. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu về nhân giống in vitro
cây lan Kim tuyến.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ra được nguồn cây giống với số lượng lớn và sạch bệnh cung cấp
cho thị trường.
Góp phần bảo tồn được nguồn gen của loài lan Kim tuyến.

Phạm Thị Nhung

3


NỘI DUNG
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4


với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu - đỏ với mạng gân màu vàng - lục
hay hồng); cuống lá dài 2 - 3 cm [3].
Cụm hoa dài 10 - 15 cm, mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình
trứng, chóp thót nhọn, dài 8 - 10 mm, màu hồng. Hoa thường màu trắng, dài
2,5 - 3 cm; các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm; môi dài đến 1,5 cm, ở mỗi
bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa mật dài
7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lông mềm [3].
1.1.3. Sinh học và sinh thái
Mùa hoa tháng 2 - 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít và sinh
trưởng rất chậm. Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy,
rậm thường xanh nhiệt đới mưa mùa cây lá rộng trên sườn núi đá granit,
riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 - 1600 m, rải rác thành từng nhóm vài ba cây
trên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng [3].
1.1.4. Phân bố
Trong nước: Lào Cai (Sapa: Phăng Xi Păng, Văn Bàn: Liêm Phú), Hà
Tĩnh (Hương Sơn: Rào Àn), Quảng Trị, Kontum (Đắk Glei: núi Ngọc Linh,
Sa Thầy: núi Chư Mom Ray), Đắk Lắk (Krông Bông: núi Chư Yang Sinh),
Lâm Đồng (Lạc Dương: núi Bì Đúp) [3].
Thế giới: Ấn Độ, Nêpan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào,
Campuchia, Malaixia, Inđônêxia [3].
1.1.5. Công dụng của lan Kim tuyến
Theo các tài liệu của Đài Loan thì lan Kim tuyến là một loại cây thuốc
vô cùng quý giá, có bán tại các tiệm thuốc Bắc và được sử dụng phổ biến
trong nhân dân. Cây lan Kim tuyến có các tác dụng như: tăng cường sức
khỏe, làm khí huyết lưu thông; có tác dụng kháng khuẩn, chữa các bệnh
viêm khí quản, viêm gan mãn tính; chữa thần kinh suy nhược, chữa ho khan,


đờm, giải độc, hạ huyết áp, trợ tim, lợi tiểu, trị bệnh đái đường, chữa viêm
gan, trị mụn và thường dùng cây tươi sắc uống [25].

Phạm Thị Nhung

6


Trong y học hiện đại bằng nhiều công trình nghiên cứu khoa học, các
nhà khoa học ở nhiều Viện và Trường đại học Y trên thế giới đã cung cấp
các bằng chứng cho thấy nhiều công dụng của lan Gấm – lan Kim tuyến như
[26]:
Điều trị ung thư: “Các chất chiết xuất từ thực vật Chi Lan Kim Tuyến
A. formosanus và các thành phần có nguồn gốc từ nó được sử dụng như là
các loại thuốc thảo dược hoặc các chất bổ sung dinh dưỡng để ngăn ngừa
hóa chất (chemoprevention) hoặc điều trị bệnh lý ác tính của con người”.
Nghiên cứu này đã được cấp bằng sáng chế ở Mỹ (US 7033617 B2).
Tăng cường miễn dịch: Chi Lan Kim Tuyến có tiềm năng tăng cường
hệ miễn dịch. Các kết quả nghiên cứu cho thấy những tác dụng tăng cường
hệ miễn dịch rất quý của dịch chiết Chi Lan Kim Tuyến.
Bảo vệ gan - Giải độc rượu: tác dụng bảo vệ gan, giải độc rượu của
Chi Lan Kim Tuyến đã được chứng minh bằng nhiều công trình khoa học.
Dung dịch nước chiết xuất của Chi Lan Kim Tuyến formosanus đã cho
thấy hoạt động bảo vệ gan đáng kể so với silymarin tiêu chuẩn. Các nghiên
cứu độc tính cấp đã kết luận rằng nó có thể được coi là an toàn trong một
thời gian dài.
Điều trị tiểu đường: kinsenoside là một hợp chất hoạt tính sinh học cơ
bản có trong lan Gấm. Nó thể hiện các hiệu ứng dược lý như chống mỡ
máu, chất chống oxy hóa, chống viêm, tăng cường miễn dịch, và các hoạt
động bảo vệ gan và gần đây đã được phát triển như là một ứng cử viên

Phải chăng, đã đến lúc chúng ta phải có những đánh giá nghiêm túc,
công trình nghiên cứu chính thức về giá trị tài nguyên của dược liệu quý,
chẳng hạn như cây lan Gấm… Để từ đó, có được những hướng phát triển
cũng như khai thác các loại dược liệu quý, thay vì để các doanh nghiệp nước
ngoài lợi dụng sự thiếu hiểu biết của ta để trục lợi.
1.1.7. Các loài lan Kim tuyến có ở Việt Nam
Theo GS. Phạm Hoàng Hộ (Cây cỏ Việt Nam, tập III), ở Việt Nam chi
lan Kim tuyến gồm có những loài sau [6]:
+ Loài Anoectochilus daoensis Gagnep. Còn gọi là Giải thùy tam đảo,
phân bố ở Tam Đảo.

Phạm Thị Nhung

8


+ Loài Anoectochilus elwesii (Hook.f.) King & Pantl. Còn gọi là Giải
thùy Elwes, phân bố ở Lào Cai, Vĩnh Phúc, Phú Thọ.
+ Loài Anoectochilus lanceolatus Lindl. Còn gọi là Giải thùy thon,
phân bố ở SaPa, Ba Vì.
+ Loài Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie. Còn gọi là Giải thùy
Lyle; phân bố ở Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Gia Lai, Kontum, Bảo Lộc, Đà Lạt.
+ Loài Anoectochilus siamensis Schltr. Còn gọi là Giải thùy Xiêm;
phân bố ở Mường Xen.
+ Loài Anoectochilus setaceus Blume (tên khác là Anoectochilus
roxburghii (Wall.) Lindl.). Còn gọi là Giải thùy Roxburgh (còn Võ Văn
Chi gọi là Sứa hồng); phân bố ở Tam Đảo, SaPa, Quảng Trị, Bình Trị
Thiên, Gia Lai, Kontun.
Theo Sách Đỏ Việt Nam (Phần II. Thực Vật), có 5 loài lan Kim tuyến
cần phải bảo vệ vì là những loài có trong “Danh mục Thực vật rừng, Động

ở Vĩnh Phúc (Tam Đảo); thế giới chưa biết.
1.2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến
1.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều cơ sở nghiên cứu
tìm các biện pháp nhân giống loài lan Kim tuyến quý hiếm có nguy cơ bị
tuyệt chủng.
Gangaprasad A và cộng sự (2000) nghiên cứu vi nhân giống hai loài
lan A. sikkimensis và A. regalis. Hai loài lan Kim tuyến này được nuôi cấy
trên môi trường Woody Plant Medium (WPM) sau 12 tuần tỷ lệ callus được
tạo ra 4,8 - 5,6 và số chồi tương ứng 95 - 98%. Khi mẫu được cấy chuyển
sang môi trường tương tự trên thì số chồi bên tăng 21,4 và chồi đỉnh là 8,2
đối với loài A. regalis. Còn đối với loài A. sikkimensis sự bật chồi chậm hơn,
số chồi bên đạt 12,3 và chồi đỉnh là 4,3 [17].
Với công trình nghiên cứu gieo hạt in vitro cây A. roxburghii, tác giả
Huang H và cộng sự (2002) đã tìm ra được môi trường Knudson C có bổ
sung 0,5 mg/L BAP + 20% dịch khoai tây là thích hợp nhất cho sự phát triển
protocom từ hạt của A. roxburghii [18].

Phạm Thị Nhung

10


Vi nhân giống cây A. formossanus được tác giả Ket N.V và cộng sự
(2004) nghiên cứu nhằm mục tiêu bảo tồn nguồn gen quý có nguy cơ bị
tuyệt diệt. Đã tìm ra môi trường nhân nhanh cụm chồi thích hợp nhất là môi
trường Hyponex có bổ sung 1 g dm-3 Benzyl adenin hoặc 1 - 2 mg dm-3
Thidiazuron (TDZ). Bổ sung 1 g dm-3 than hoạt tính vào môi trường có chứa
TDZ thúc phát triển chồi (11,1 chồi/mô cấy). Tuy nhiên, tốc độ chồi tái sinh
chậm và không kéo dài thân. Trên môi trường Hyponex bổ sung 2% đường

việc giúp các nhà nghiên cứu nước ta kế thừa kinh nghiệm để đem lại hiệu quả
cao trong việc nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến trong điều kiện Việt Nam.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cây lan Kim tuyến đang có nguy cơ tuyệt chủng do khai thác quá mức.
Vì vậy, trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng đã có nghiên cứu về loài
lan này nhằm phát triển và bảo tồn nguồn dược liệu quý.
Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh
chồi in vitro lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Kết quả
cho thấy: môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi Lan Kim tuyến in
vitro là Knud*. Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ
2-3 cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud* bổ
sung 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 0,3 mg/l NAA + 100 ml/l ND + 100 g/l
dịch chiết khoai tây + 20 g/l saccarozơ + 7 g/l agar + 0,5 g/l than hoạt tính [9].
Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) đã nghiên cứu đặc điểm hình thái,
phân bố của loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume ở vườn quốc
gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc [10].
Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2012) đã nghiên cứu kỹ thuật nhân
giống loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) in vitro bảo tồn
nguồn dược liệu quý. Kết quả cho thấy: cơ quan vào mẫu phù hợp nhất là
thể chồi và mắt đốt ngang thân được khử trùng và đưa vào các môi trường
nền khác nhau (MS, Knud, Knudson). Tiếp đó, các chồi và mắt đốt được
chuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung BAP, KI, α - NAA trong

Phạm Thị Nhung

12


4 tuần. Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngang
thân là Knud* + 0,5 mg/l BAP + 0,3 mg/l KI + 0,3 mg/l NAA + 20 g/l

phát triển của chồi cây lan Gấm. Sau 2 tháng nuôi cấy, trên môi trường có
bổ sung 1,0 mg/l BAP kết hợp 1,0 mg/l α - NAA các chồi có sự sinh trưởng
và phát triển tốt (chiều cao chồi: 9,03 cm; số đốt: 9,33 đốt/mẫu; khối lượng
tươi: 2,63 g và khối lượng khô: 0,2187 g), hệ rễ phát triển mạnh (số rễ: 7,33
rễ/mẫu; chiều dài rễ: 1,36 cm). Tuy nhiên, mẫu bị nâu hóa do lượng phenol
trong mẫu tiết ra nhiều. Để tối ưu hóa môi trường, các điều kiện nuôi cấy:
lỏng tĩnh, lỏng lắc, agar, bông gòn đã được khảo sát. Kết quả cho thấy, các
chồi trên môi trường lỏng có bông gòn sinh trưởng tốt, to khỏe, hệ rễ phát
triển mạnh và đặc biệt không còn hiện tượng nâu hóa [5].
Từ các kết quả trên cho thấy ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu
về việc nhân giống và bảo tồn lan Kim tuyến. Tuy nhiên, việc nghiên cứu
này mới chỉ dừng lại ở một số đối tượng và chưa hoàn thiện được kỹ thuật
trồng, chăm sóc đầy đủ. Các kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở mức độ
nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng vào sản xuất.

Phạm Thị Nhung

14


Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu thực vật
Cây lan Kim tuyến in vitro do Phòng Sinh lý thực vật, Khoa Sinh KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 cung cấp.
2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
2.2.1. Dụng cụ
Dao cấy, khay cấy, kéo, túi nilon, bình tam giác, đèn cồn, bình xịt cồn
vỉ xốp nuôi cấy,…
2.2.2. Thiết bị
Các thiết bị sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật: cân kĩ thuật, máy đo

Nhân nhanh lan Kim tuyến
+ NAA
Tạo cây lan Kim tuyến in vitro hoàn chỉnh

+ Xơ dừa, đất, phân bò
Rèn luyện cây in vitro ngoài môi trường tự nhiên
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần
nhắc lại.
2.5.2. Phương pháp nghiên cứu
2.5.2.1. Thí nghiệm 1: Hoàn thiện giai đoạn nhân nhanh lan Kim tuyến bằng
kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Thí nghiệm tiến hành trên môi trường cơ bản: MS + 30 g/l đường, 7 g/l
agar có bổ sung KI và BAP với nồng độ như sau:

Phạm Thị Nhung

16