§¹i häc Th¸i Nguyªn
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÙI VĂN BÁCH
Tên đề tài:
“HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN
(Anoectochilus roxburghii)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ sinh học
Khoa : CNSH - CNTP
Khóa học : 2010 - 2014 Giáo viên hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thị Tình
Khoa CNSH - CNTP - Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Bùi Văn Bách
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 4.1.: Kết quả ảnh hưởng của một số hóa chất diệt nấm, vi khuẩn đến khả
năng tạo vật liệu sạch nấm, vi khuẩn mẫu chồi Lan Kim Tuyến
(sau 10 ngày nuôi cấy) 29

Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch NaClO
1%

kết hợp HgCl
2
0,1% đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy
chồi Lan Kim Tuyến (sau 10 ngày nuôi cấy) 31

Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (BA,
GA3,TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến (sau 30
ngày nuôi cấy) 34
Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với Auxin(IAA) đến
khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
(sau 30 ngày nuôi cấy) 37

Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với dung dịch nước
dừa đến khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến sau (4 tuần
nuôi cấy) 40

Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan
Kim Tuyến (sau 15 ngày nuôi cấy) 43
ADN : Acid deoxyribonucleic
B1 : Thiamin
B3 : Nicotinic acid
PP : Acid nicotinic
B6 : Pyridoxine
BA : 6-Benzylaminopurine
CV : Coefficient of Variation
Đ/C : Đối chứng
IAA : Indol axetic acid
Kinetin : 6-Furfurylaminopurine
LSD : Least Significant Difference Test
MS : Murashige and Skoog’s
NAA :
α
- Naphlene axetic acid
TN : Thí nghiệm
CT : Công thức
GA
3
: Acid ascorbic
VW : Vaccine và Went

MỤC LỤC

Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu 2


2.2.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 8

2.2.4. Nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV 9

2.2.5. Môi trường nuôi cấy mô TBTV 9

2.2.6. Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật 15

2.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam 18

2.3.1. Tình hình nghiên cứu Lan Kim Tuyến trên thế giới 18

2.3.2. Tình hình nghiên cứu Lan Kim Tuyến ở Việt Nam 19

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 21

3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 21

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.2. Phạm vi nghiên cứu 21

3.2. Hóa chất và thiết bị 21

3.2.1. Hóa chất 21

3.2.2. Thiết bị 21


4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân
nhanh của Lan Kim Tuyến 40

4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan
Kim Tuyến 42

4.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan
Kim Tuyến 43

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

5.1. Kết luận 46

5.2. Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 471
PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Họ Lan (danh pháp khoa học: Orchidaceae) là một họ thực vật có hoa,
thuộc bộ Măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm. Đây là một trong
những họ lớn nhất của thực vật, với tổng số 865 loài thuộc 154 chi. Lan Kim
Tuyến-Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl thuộc họ Lan - Orchidaceae, có
phân bố rộng ở hầu hết các tỉnh Việt Nam [2] tên khác Lan Kim Tuyến lông cứng,
Kim Tuyến tơ, Giải thủy tơ, Lan Gấm, Cỏ nhung, Kim cương (Anoectochilus
setaceus Lindl) là một loài thực vật điển hình của chi cùng tên (Anoectochilus).
Đây là một loài lan đất có mặt ở Vân Nam, Lào và Việt Nam. Chúng

- Xác định ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích sinh trưởng (BA,
GA3, TDZ, IAA) tới khả năng nhân nhanh chồi Lan Kim Tuyến
(Anoectochilus roxburghii).
- Xác định ảnh hưởng của nước dừa tới khả năng nhân nhanh chồi Lan
Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii).
- Xác định ảnh hưởng của cường độ chiếu sáng tới khả năng ra rễ Lan
Kim Tuyến (Anoectochilus roxburghii).
1.3. Ý nghĩa của đề tài
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hoá lại kiến thức đã học vào
nghiên cứu khoa học.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân
tích số liệu, trình bày một bài báo cáo khoa học
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô, hoàn
thiện quy trình nhân nhanh giống Lan Kim Tuyến bằng phương pháp nuôi cấy
in vitro, đảm bảo cung cấp số lượng cây giống có chất lượng tốt đồng đều cho
quá trình sản xuất.
- Bảo tồn nguồn dược liệu quý đang có nguy cơ tuyệt chủng.

3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về cây Lan Kim Tuyến
2.1.1. Phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật [16] Lan Kim Tuyến được phân
loại như sau:
Giới (regnum) Plantae
Ngành Magnoliophyta
Lớp Liliospida

0,5-8cm, rễ dài nhất trung bình là 6,07cm và ngắn nhất trung bình là 1,22cm,
chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,82cm [4].
- Lá mọc cách xoắn quanh thân, xoè trên mặt đất. Lá hình trứng, gần
tròn ở gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3 - 4cm, trung bình
là 4,03cm và rộng từ 2 - 3cm, trung bình là 3,12cm. Lá có màu nâu đỏ ở mặt
trên và phủ lông mịn như nhung. Hệ gân lá mạng lưới lông chim, thường có 5
gân gốc. Các gân này thường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ. Đôi khi
gân ở giữa có màu vàng nhạt. Mặt dưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân
gốc nổi rõ. Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ, gân ở giữa lá mặt dưới không rõ.
Cuống lá dài 0,6 - 1,2cm, thường nhẵn và có màu trắng xanh, đôi khi hơi đỏ
tía ở bẹ lá. Bẹ lá nổi rõ và nhẵn. Số lá trên một cây thay đổi từ 2 - 6, thông
thường có 4 lá. Kích thước của lá cũng thay đổi, các lá trên một cây thường
có kích thước khác nhau rõ rệt [4].
- Đặc điểm của hoa, quả: Cụm hoa dài 10 - 20 cm ở ngọn thân, mang 4-
10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, dài 6 - 10 mm, màu hồng. Các mảnh bao
hoa dài khoảng 6 mm; cánh môi màu trắng, dài đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc
mang 6-8 dải hẹp, đầu chẻ đôi. Mùa hoa tháng 10 - 12. Mùa quả chín tháng 12
- 3 năm sau [4].

2.1.3. Đặc điểm phân bố của Lan Kim Tuyến
Lan Kim Tuyến thường mọc ở dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là
nguyên thủy, rậm thường xanh, nhiệt đới, trên sườn núi đá granit, riclit, phiến
sét, ở độ cao 500 - 1600m rải rác thành từng nhóm vài ba cây trên đất ẩm rất
giàu mùn và lá cây rụng [2].
Ở Việt Nam, Lan Kim Tuyến có phổ phân bố khá rộng bao gồm: Lào Cai
(Sa Pa, Liêm Phá), Hà Tĩnh, Quảng Trị, Kom Tum, Lâm Đồng, Đắk Lăk [2].
Thế giới: Ấn Độ, Nhật Bản, Butan, Trung Quốc, Mi-an-ma, Thái Lan,
Lào, Cam-pu-chi-a, Ma-lay-xi-a, In-đô-nê-xi-a [2].

5

2.2. Tổng quan về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái niệm về phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là thuật ngữ được dùng một cách rộng rãi để
nói về việc mô tả các phương thức nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn,
mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiện vô

6
trùng [5]. Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào thực vật là sử dụng các điều
kiện như: nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, các chất điều hoà sinh
trưởng thực vật… để điều khiển qúa trình sinh trưởng và phát triển của tế bào,
mô nuôi cấy theo mục tiêu và yêu cầu đặt ra. Nuôi cấy mô tế bào thực vật còn là
một phương pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều
loài thực vật. Phương pháp này giúp mở ra những hướng mới trong nghiên cứu
sinh lý và di truyền thực vật như: cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử -
đột biến, sinh lý dinh dưỡng ở tế bào thực vật và nhiều vấn đề sinh học khác…
Tất cả dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước:
- Các phần của thực vật hoặc một cơ quan thực vật nào đó được tách ra
khỏi phần còn lại. Đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác lẫn
nhau trong một tổ chức thực vật nguyên vẹn.
- Các phần tách ra nói trên phải đặt trong môi trường thích hợp để nó có
thể biểu lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó [5].
2.2.2. Đặc điểm của nuôi cấy mô tế bào thực vât (TBTV)
2.2.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Mỗi tế bào đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể và có
khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
Gottlibeb Haberlant (1902) - nhà thực vật học người Đức đã đặt nền móng
đầu tiên cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Ông đã đưa ra giả thuyết về tính
toàn năng của tế bào trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy tách rời".
Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ
lượng thông tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ của cả sinh vật đó. Khi gặp

Hình 2.1. Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa,
ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có
một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng
mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một
chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào
khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài
hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích
thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [13].

8
2.2.2.3. Sự trẻ hoá
Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần cơ quan thực vật là rất khác
nhau. Vì vậy để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay
tuổi mẫu. Trong nuôi cấy mô TBTV (hay còn gọi là nuôi cấy in vitro), các
mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trường nuôi cấy nhanh,
dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mô sẹo, phôi. Ngoài ra mô non trẻ mới
được hình thành, sinh trưởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn [6].
2.2.3. Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy mô TBTV
Quá trình nuôi cấy mô TBTV có những ưu điểm như sau:
- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường hợp,
công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1 cây sau khi
được nuôi cấy từ 1 đến 2 năm có thể tạo ra hàng triệu cây.
- Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công nghệ
nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có
kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
- Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng
thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết bên ngoài và các vật liệu khởi đầu
có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất

cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình
thường của cây. Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường
nuôi cấy thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau
được sử dụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được
sử dụng rất phổ biến như MS , LS (Linsmainer và Skoog, 1965)… Môi
trường MS là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế
bào thực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm.
Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy mô đóng vai trò quyết định
đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật. Mỗi một
loại vật liệu nuôi cấy hay loại cây khác nhau cần những thành phần môi
trường thích hợp để phù hợp với mục đích việc nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Nhìn chung, môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các thành phần cơ
bản sau:
+ Các khoáng đa lượng
+ Các khoáng vi lượng
+ Nguồn cacbon
+ Các vitamin
+ Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác

10
+ Các chất điều hòa sinh trưởng.
+ Các chất bổ sung khác: nước dừa; dịch chiết nấm men; than hoạt tính; Agar
2.2.5.1. Khoáng đa lượng
Các khoáng đa lượng bao gồm các nguyên tố khoáng được sử dụng ở
nồng độ trên 30 ppm tức là 30 mg/l. Những nguyên tố đó là: N, Fe, P, K, Ca,
Mo. Riêng Na và Cl cũng được sử dụng trong một vài loại môi trường, nhưng
chưa rõ vai trò của chúng.
- Nitrogen: Mô, tế bào thực vật có thể sử dụng nitrogen khoáng như
ammonium và nitrate. Tỷ lệ ammonium và nitrat thay đổi tùy theo loại cây và
trạng thái phát triển của mô. Nitrogen được cung cấp dưới NO

cấy dưới dạng kali nitat (KNO
3
), kali clorua (KCl) và kalihydrophotphat
(KH
2
PO
4
) [5].
- Canxi (Ca): Ca có mặt rất nhiều trong vách tế bào và màng tế bào. Sự
có mặt của Ca
2+
rất quan trong trong khả năng đối kháng với sự nhiễm nấm.
Sự ổn định của màng tế bào chịu ảnh hưởng rất lớn bởi ion Ca
2+
. Sự thiếu hụt
Ca
2+
sẽ làm tăng quá trình giải phóng các hợp chất ra khỏi màng tế bào. Canxi
được cung cấp dưới dạng canxi nitrat (Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O) canxi clorua
(CaCl
2
.6H
2
O)

)
3
, Fe(C
4
H
4
O
6
). Hiện nay hầu hết các
phòng phòng thí nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với Na
2
-
Ethylene
Diamine Tetra Acetate (EDTA). Ở dạng này sắt không bị kết tủa và giải
phóng tư từ ra môi trường theo nhu cầu mô thực vật [5].
2.2.5.2. Khoáng vi lượng
Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng
trong môi trường nuôi cấy in vitro. Các nguyên tố này đóng vai trò quan trọng
trong các hoạt động của enzyme. Chúng được dùng với nồng độ thấp hơn
nhiều so với các nguyên tố đa lượng. Các dung dịch vi lượng thường dùng là:
Nistch (1951), Heller (1953), MS [11].
2.2.5.3. Nguồn cacbon
Trong nuôi cấy mô TBTV, các mẫu nuôi cấy nói chung không thể
quang hợp hoặc quang hợp ở cường độ rất thấp, vì vậy trong môi trường nuôi
cấy cần bổ sung các hợp chất hydratcacbon. Nguồn hydratcacbon được sử
dụng phổ biến là đường saccarozơ với hàm lượng từ 2-6% (W/V). Những loại
đường khác như fructose, glucose, maltose, sorbitol, rất ít dùng [7].
2.2.5.4. Các vitamin
Thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng
trưởng và phát triển của chúng. Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình

học khác nhau được tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan, bộ
phận nhất định của cây để điều hòa hoạt động sinh lý cũng như quá trình sinh
trưởng và phát triển của cây nhằm duy trì mối quan hệ hài hòa giữa các cơ
quan, các bộ phận trong cơ thể thực vật. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
tham gia vào quá trình phân chia tế bào, phân hóa các mô, phát sinh phôi, tác
dụng lên chức năng của DNA và RNA làm ảnh hưởng mạnh đến những quá
trình chủ yếu của hoạt động sống thực vật như quá trình sinh tổng hợp các
enzyme, hô hấp, dinh dưỡng rễ, quang hợp… Chính vì vậy chúng có tác dụng
điều hòa sinh trưởng phát triển của cây. Các chất điều hòa sinh trưởng bao
gồm những chất sau:

13
a. Auxin
Auxin là chất điều hòa sinh trưởng được nghiên cứu đầu tiên với việc
xác định cấu trúc hóa học đầu tiên vào năm 1934. Auxin là chất xúc tác cho
sự sinh trưởng của cây trồng , có phổ hoạt động rộng hơn Gibberellin. Tác
động sinh lý của auxin đối với thực vật rất phức tạp. Các mô thực vật khác
nhau có phản ứng khác nhau đối với tác động của auxin. Hoạt động của auxin
tùy thuộc vào nồng độ và sự tác động tương hỗ giữa chúng với các chất điều
hòa sinh trưởng khác [5]. Auxin kết hợp chặt chễ với các thành phần dinh
dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo,
huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được
sử dụng phối hợp với cytokinine. Khi nồng độ cytokinine cao hơn auxin thì sẽ
có sự tạo chồi từ mẫu cấy, ngược lại hoặc khi chỉ xử lý với auxin thì rễ sẽ
được tạo thành [5], [9]. Auxin đẩy mạnh sự sinh trưởng thông qua sự kéo dài
tế bào. Hiệu quả này là do chúng thúc đẩy các hoạt động của enzyme, làm gia
tăng tính đàn hồi của thành tế bào làm cho sự xâm nhập của nước vào trong tế
bào được dễ dàng, giảm sức đề kháng của thành tế bào và tế bào tự kéo dài ra.
Auxin hoạt hóa các quá trình sinh tổng hợp các chất cao phân tử (protein,
xenluloza, pectin,… ) và ngăn cản sự phân giải chúng. Vì vậy, chúng có tác

vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. Một tỉ lệ thích hợp giữa
auxin và cytokinine sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái mẫu cấy, khi
nồng cytokinine cao hơn nồng độ cytokinine thì kích thích sự tạo chồi và
ngược lại nồng độ auxin cao hơn cytokinine thì kích thích sự tạo rễ. Nồng độ
cytokinine cao thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ đồng thời cũng ngăn cản
sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin. Đại diện
chính của cytokinine là kinetine được phát hiên trong dịch thủy phân nấm
men. Đặc trưng nhất của chất này là ngăn cản sự mất màu của lá trong tối,
tăng cường sự xâm nhập của dòng chất dinh dưỡng và thúc đẩy sự phân chia
tế bào khi nuôi cấy tế bào rời. Trong nhóm cytokinine còn bao gồm các chất
thường được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô: BA và TDZ (1-phenyl 3-
(1-2,3 thiadiazol- 5yl) urea); Zeatine
c. Gibberellin
Gibberellin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật gồm hơn 80 hợp
chất khác nhau. Hoạt động của mỗi chất phụ thuộc vào khả năng di chuyển
qua mô hoặc sự biến đổi nó thành một dạng hoạt động khác. Acid gibberellic
(GA3) và hỗn hợp giũa GA3 và GA7 là những Gibberellin duy nhất có giá trị
thương phẩm do chúng thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật Khi
bổ sung Gibberellin vào môi trường nuôi cấy mô thực vật thì chúng thường có
tác dụng như auxin tự nhiên, sẽ làm giảm bớt hoặc ngăn cản sự tạo chồi, Acid
gibberellic có ảnh hưởng chủ yếu lên sự phân hóa tế bào in vitro ngoài sự tác

15
động của auxin. Tuy nhiên, sự tăng trưởng của chồi từ đỉnh sinh trưởng và
mẫu cấy chồi cũng có thể tăng thêm khi bổ sung acid gibberellic [5], [25].
2.2.5.7. Các chất bổ sung
a. Nước dừa
Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất
khoáng và chất kích thích sinh trưởng [26]. Nước dừa đã được sử dụng để
kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây. Nước dừa thường

trẻ hoá vật liệu giống. Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, tiến hành lấy
mẫu và xử lý mẫu cấy trong những điều kiện vô trùng. Người ta thường sử
dụng một số loại hoá chất như: HgCl
2
0,1 %, H
2
O
2
, Ca(OCl)
2
để khử trùng
mẫu cấy. Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu nuôi cấy mà lựa chọn loại hoá chất,
nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp [6].
2.2.6.2. Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mẫu vật đã
được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Về nguyên tắc thì mô
nuôi cấy có thể là bất kỳ bộ phận nào của cây lấy từ các phần non của cây
(thân, rễ, lá,…) nhưng theo Bhatt thì mô nuôi cấy lấy từ các phần non của cây
có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trưởng thành
khác. Vì vậy, người ta thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in
vitro.Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của cây mô,
các mô ở thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho khả
năng tái sinh chồi tốt hơn. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ
nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Giai đoạn này
thường kéo dài trong 4-6 tuần.
2.2.6.3. Giai đoạn nhân nhanh
Một trong những ưu thế lớn nhất của phương pháp nhân giống in vitro
so với các phương pháp nhân giống truyền thống là có hệ số nhân cao. Vì vậy
giai đoạn nhân nhanh được coi là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình
nhân giống. Giai đoạn này sẽ kích thích mô nuôi cấy phát sinh nhiều chồi

với môi trường tự nhiên. Khi cây đủ tiêu chuẩn cứng cáp (chiều cao, số lá, rễ)
thì mang trồng. Giá thể phải đảm bảo tơi xốp và sạch bệnh. Trong 2- 3 tuần
đầu cần duy trì độ ẩm trên 50%, tránh ánh sáng quá mạnh gây cháy lá, tránh
nhiễm khuẩn và nấm gây hiện tượng thối nhũn. Điều kiện môi trường trong
giai đoạn này là rất quan trọng, cần tạo điều kiện cho bộ rễ phát triển, cứng
cáp và phòng bệnh cho cây. Đây được xem là công đoạn quyết định khả năng
ứng dụng quy trình này trong thực tiễn sản xuất.
2.2.7. Các yếu tố khác ảnh hưởng đến nhân giống nuôi cấy mô TBTV
2.2.7.1. Ánh sáng
Ánh sáng: Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ
các yếu tố như thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh
sáng.Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy.
Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 - 18 h/ngày.
Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy.
Cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 lux (Morein, 1974),
chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực
vật invitro: ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng

18
trắng. Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế sinh trưởng chiều
cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Hiện nay trong
các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có
cường độ 2000 - 2500 lux người ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang đặt cách
bình nuôi cấy từ 35- 40 cm.
2.2.7.2. Nhiệt độ
Nhiệt độ: có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây nuôi
cấy in vitro. Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ
cho phù hợp. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở
nhiều loài cây là 20-25
0