TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

TRẦN THỊ THUẬN

ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ CHẤT
ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG THỰC VẬT
ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁI SINH CHỒI VÀ RA RỄ
CỦA CÂY CHÙM NGÂY TRONG NUÔI CẤY
IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học Thực vật
Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH

HÀ NỘI, 2016


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đến thầy giáo
PGS.TS NGUYỄN VĂN ĐÍNH người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo
điều kiện tốt nhất để em hoàn thành khóa luận này.
Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Sư phạm Hà
Nội 2 cùng các thầy cô giáo khoa Sinh – Kĩ thuật nông nghiệp, cùng các bạn
trong nhóm đề tài Sinh lí học Thực vật đã giúp đỡ em trong quá trình học tập tại
trường và tạo điều kiện thuận lợi cho em được thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Trong quá trình nghiên cứu, không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế.
Kính mong được sự đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo và các bạn để đề tài


ĐHST

: Điều hòa sinh tưởng

NAA

: 1-Naphthalene acetic acid

IAA

: Indol acetic acid

IBA

: Indol butyric acid

BAP

: 6-Benzylamonipurine

KI

: Kinetin

MS

: Murashige and Skoog medium

CT

CHƯƠNG 2: VẬT LIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 11
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................................ 11
2.2. Địa điểm nghiên cứu. ......................................................................................................... 11
2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ....................................................................................... 11
2.3.1. Thiết bị ................................................................................................................................. 11


2.3.2. Dụng cụ................................................................................................................................ 11
2.4. Môi trường nuôi cấy và chất điều hòa sinh trưởng ................................................ 11
2.5. Điều kiện nuôi cấy .............................................................................................................. 12
2.6. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................................. 12
2.6.1. Bố trí thí nghiệm .............................................................................................................. 12
2.6.3. Phương pháp phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm. .................................... 16
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 17
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu.......................................................................................................... 17
3.2. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình tái sinh
chồi in vitro cây Chùm Ngây. ................................................................................................. 19
3.2.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi của Chùm Ngây in vitro
.............................................................................................................................................................. 19

3.2.2. Ảnh hưởng Kinetin đến khả năng tái sinh chồi cây Chùm Ngây in vitro
.............................................................................................................................................................. 23

3.2.3. Ảnh hưởng BAP + NAA đến khả năng tái sinh chồi cây Chùm Ngây in
vitro .................................................................................................................................................... 25
3.3. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Chùm Ngây in vitro ...... 26
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 28
4.1. Kết luận ................................................................................................................................... 28
4.2. Kiến nghị................................................................................................................................. 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 29

Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP 0,3 mg/l tới phát sinh chồi ở cây Chùm Ngây in
vitro ..................................................................................................................... 21
Hình 3.5. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng BAP khác đến quá trình
tái sinh chồi ở cây Chùm Ngây in vitro .............................................................. 22
Hình 3.6. Ảnh hưởng của môi trường cơ bản MS tới tạo chồi cây Chùm Ngây in
vitro ..................................................................................................................... 23
Hình 3.7. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng KI 0,3 mg/l đến tái sinh chồi
ở cây Chùm Ngây in vitro ................................................................................... 24
Hình 3.8. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng KI 0,5 mg/l đến tái sinh chồi
ở cây Chùm Ngây in vitro ................................................................................... 24
Hình 3.9. Ảnh hưởng của BAP + NAA đến quá trình tái sinh chồi in vitro cây
Chùm Ngây.......................................................................................................... 26
Hình 3.10. Ảnh hưởng của NAA 0,5 mg/l đến quá trình tạo rễ chồi Chùm Ngây
in vitro ................................................................................................................. 27
Hình 3.11. Ảnh hưởng của MS cơ bản đến quá trình tạo rễ chồi Chùm Ngây in
vitro ..................................................................................................................... 27


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Chùm Ngây có tên khoa học là Moringa oleifera L,. Là một loài cây đa tác
dụng, giá trị sử dụng của nó được chia làm hai nhóm chính: (1) sử dụng làm
thuốc chữa bệnh, (2) sử dụng làm nguồn lương thực giàu chất dinh dưỡng.
Trong cây Chùm Ngây có hơn 90 chất dinh dưỡng tổng hợp và chất khoáng
đa dạng không kém các sản phẩm từ động vật. Đặc biệt, trong Chùm Ngây rất
giàu dinh dưỡng, hàm lượng Vitamin C cao hơn 7 lần so với Vitamin C trong
quả cam, hàm lượng Canxi cao hơn 4 lần so với Canxi trong sữa [19]. Giá trị
làm thuốc của Chùm Ngây được khoa học chứng minh là có khả năng chống
viêm, kháng khối u, đặc biệt là những khối u ở vùng bụng, kháng nấm gây bệnh,
trị bệnh tiểu đường, bảo vệ gan, chống nhiễm xạ, kích thích hoạt động của tim

3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần nâng cao năng suất, chất lượng và
hiệu quả kinh tế cao của cây Chùm Ngây.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Các chất điều hoà sinh trưởng ở thực vật
chất điều hoà sinh trưởng là những chất với liều lượng thấp hiệu ứng sinh
học cao, được tổng hợp tại một cơ quan và gây ảnh hưởng điều tiết đến các quá
trình sinh lý, trao đổi chất nào đó trong những cơ quan khác. Chất điều hoà sinh
trưởng là sản phẩm trao đổi chất bình thường của cơ thể thực vật. Nó đóng vai
trò chủ đạo trong quá trình sinh trưởng, phát triển và những quá trình sinh lý,
sinh hoá khác cũng như trong phản ứng thích nghi của thực vật đối với điều kiện
của môi trường [3]. Mỗi chất điều hoà sinh trưởng đều mang chức năng riêng,
nhưng trong cơ thể thực vật để điều khiển những hoạt động của thực vật, chúng
tham gia vào thường không phải một vài chất. Tuỳ vào mỗi giai đoạn nuôi cấy,
mỗi giai đoạn phát triển của thực vật thì sự kết hợp của các chất này là khác
nhau. Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô tế bào, hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng
được sử dụng rộng rãi là cytokinin và auxin.
- Auxin: có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt
động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng
của thực vật,.. [4]. Auxin cùng với một số chất điều chỉnh khác đảm bảo sự tạo
thành khối các tế bào đang phân chia tạo thành các cơ thể thực vật hoàn chỉnh.
Trong nuôi cấy sử dụng một số chất như: Indol acetic acid (IAA);
Naphthyl acetic acid (NAA); 2,4 - D Dichlorophenol acetic acid (2,4- D), Indol
butyric acid (IBA) [1].
- Cytokinin: có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ.
Cytokinin ảnh hưởng rõ rệt và đặc trưng lên sự phân hoá của cơ quan thực vật,


Họ Chùm Ngây

: Moringaceae

Chi

: Moringa

Loài

: Moringa oleifera L.

1.2.2 Nguồn gốc, phân bố
Nguồn gốc: Cây có xuất xứ từ vùng Nam Á, có lịch sử hơn 4 ngàn năm
nhưng phổ biến rất nhiều ở Châu Á và Châu Phi
Phân bố:
Cây Chùm Ngây là cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, thích hợp trồng điều kiện
đất đai khô cằn và điều kiện khí hậu khắc nghiệt, chịu được hạn hán nên được
trồng nhiều nơi trên thế giới để làm hàng rào, che chắn, che bóng, chắn gió, chắn
cát. Cây cũng có khả năng cải tạo đất tốt, lá già làm phan hữu cơ và bổ sung cho
gia súc rất tốt.
Chùm Ngây được trồng phổ biến ở cả Châu Á và Châu Phi. Ở Việt Nam,
Chùm Ngây mọc tự nhiên ở Ninh Thuận, Bình Thuận [24], vùng núi Bảy ở An
Giang, đảo Phú Quốc. Tuy nhiên, nhiều năm gần đây nhiều nghiên cứu đã chứng
minh công dụng tuyệt vời của loài cây này đến nay Chùm Ngây được mở rộng
diện tích trồng ở nhiều nơi.

4


5


sitosterol, caffeoylquinic acid và kaempferol. Một số nguồn nghiên cứu cho biết
chùm ngây chứa hơn 90 chất dinh dưỡng tổng hợp bao gồm 7 loại vitamin, 6
loại khoáng chất, 18 loại acid amin, 46 chất chống ôxi hóa, liều lượng lớn các
chất chống viêm nhiễm, các chất kháng sinh, kháng độc tố, các chất giúp ngăn
ngừa và điều trị ung thư, u xơ tiền liệt tuyến, giúp ổn định huyết áp, hạ
cholesterol, bảo vệ gan [23],[28].
M. oleifera là một cây có nhiều giá trị cho con người và có một loạt giá trị
sử dụng thuốc. Nó có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, dinh dưỡng, nông
nghiệp, nước, vệ sinh môi trường, đa dạng sinh học và môi trường... Moringa
được coi là "cây phép lạ" trong một số nước trên thế giới bởi vì tất cả các bộ
phận của nó (rễ, vỏ, lá, hoa, quả, và hạt giống) đều có thể được sử dụng, có tính
dinh dưỡng và dùng làm dược liệu [7],[14]
Lá moringa giàu dinh dưỡng hiện được hai tổ chức thế giới WHO và FAO
xem như là giải pháp ưu việt cho các bà mẹ thiếu sữa và trẻ em suy dinh dưỡng,
và là giải pháp lương thực cho thế giới thứ ba.
Đối với trẻ em từ 1-3 tuổi, cứ ăn 20gr lá tươi moringa là cung ứng 90%
Calcium , 100% Vitamin C, Vitamin A, 15% chat sắt, 10% chất đạm cần thiết và
hàm luợng Potassium, Đồng, …và Vitamin B bổ sung cho trẻ

.

Đối với các bà mẹ đang mang thai và cho con bú, chỉ cần dùng 100gr lá
tươi mỗi ngày là đủ bổ sung Calcium, Vitamin C, Sắt , Đồng, Magnesium,
Sulfur, các vitamin B cần thiết trong ngày [20]
Lá được ăn như rau, và ép hoặc sấy khô để phục vụ trong y học, dược cổ
truyền trị nhiều bệnh, hoặc được sử dụn như là gia vị. Hoa sản xuất mật hoa và
có đặc tính kháng viêm. Hạt Moringa rất giàu protein và dầu và được sử dụng để

rằng "bột lá chùm ngây có tác dụng dinh dưỡng và có thể sử dụng để chống lại
nạn đói."[13],[15],[18] Cây chùm ngây cho nhiều lá vào cuối mùa khô trong khi
các loài cây rau khác thường cho ít lá[13].
1.3. Thực trạng gieo trồng và sử dụng cây Chùm Ngây
1.3.1. Trên thế giới
Chùm Ngây được phát hiện và sử dụng hơn 4 nghìn năm, do toàn bộ các

7


phần trên cây đều có thể làm thức ăn hoặc phục vụ cho các mục đích khác nhau
nên Chùm Ngây đang được khuyến khích trồng ở 80 quốc gia trên thế giới, đặc
biệt là những nước nghèo. Loài cây được trồng phổ biến nhất ở các nước vùng
châu Phi, Trung Mỹ, Nam Mỹ, Đông Nam Á như Ấn Độ, Pakistan, Kenya, Úc,
Sri Lanka... Ngoài ra, Mỹ hiện đang là nước nhập nguyên liệu Moriga thô nhiều
nhất, sử dụng trong công nghệ mĩ phẩm cao cấp, nước uống dinh dưỡng và quan
trọng hơn là chiết xuất thành nguyên liệu tinh cung ứng cho công nghiệp thức
phẩm, dược phẩm hóa chất [16].
1.3.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, Chùm Ngây (Moringa oleifera L.) là loài cây duy nhất của
Chi Chùm Ngây (Moringa) được phất hiện mọc hoang từ lâu đời tại nhiều nơi:
Thanh Hóa, Ninh Thuận, Bình Thuận, ngoài ra còn được trồng ở nhiều nơi Đà
Nẵng, Khánh Hòa, Kiên Giang và đảo Phú Quốc. Cho đến nay, Chùm Ngây
được trồng chủ yếu nhiều ở tỉnh phía Nam để làm rau và dược liệu [23].
1.4. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Chùm Ngây
Chùm Ngây được xem là cây đa công dụng, rất hữu ích tại các quốc gia
nghèo. Vì vậy, nó được nghiên cứu rất nhiều về nhân giống, trồng trọt và thu
hái; cũng như nghiên cứu về các hoạt tính y dược học và giá trị dinh dưỡng.Đa
số nghiên cứu được thực hiện ở Ấn Độ, Phipipines và Châu Phi nghiên cứu rất
nhiều về giá trị cây Chùm Ngây

- RK Saini, NP Shetty, P. Giridhar và GA Ravishanka (9/ 2012), báo
Công nghệ sinh học:187 - 192 đã nghiên cứu nhân nhanh chồi tái sinh in vitro
cây Chùm Ngây và đánh giá hiệu quả của lĩnh vực trồng cây nuôi cấy mô môi
trường giàu dinh dưỡng. Kết quả thấy Benzyladenine (BAP) tại 4,44 mM là tối
ưu trong in vitro tạo số chồi tối đa trung bình là 9,0 ± 1,0 trên mẫu cấy sau 15
ngày . Trong tạo rễ Chùm Ngây in vitro trên môi trường có chứa axit indole-3acetic (IAA) tại 2,85 mM cùng với indole-3-butyric acid (IBA) tại 4,92 mM.
Sau đó đưa vào trong đất, với điều kiện là các cây con trồng trong chậu được
bao bọc bằng túi nilon rõ ràng và giữ trong một nhà kính bóng mờ trong 15 ngày
trước khi tiếp xúc với điều kiện môi trường xung quanh [21].

9


- Marla Magana (2012) tại sở Khoa học, Khoa Khoa học và Công nghệ,
Đại học Belize đã nghiên cứu sự phát triển và chuẩn hóa phương pháp nuôi cấy
in vitro trong lĩnh vực cấy trồng cây Chùm ngây. Kết quả nghiên cứu mẫu sau
xứ lí vô trùng được cấy chuyển vào môi trường MS. Mẫu chỉ xử lí NaClO thì tỉ
lệ mẫu nhiễm cao 62%, còn mẫu xử lí cả NaClO và C2H6O tỉ lệ mẫu nhiễm thấp
45%. Đặc biệt kết quả nghiên cứu này rất hữu ích trong nhân giống in vitro cây
Chùm Ngây khi xử lí mẫu cấy với NaClO 4% cùng ngâm với C2H6O 70% hiệu
quả trong giảm tỉ lệ mẫu nhiễm [17].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có báo cáo nào về biệc nhân giống
thành công cây Chùm ngây bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Hầu hết sử
dụng hình thức trồng bằng hạt hoặc giâm cành. Những phương pháp này có ưu
điểm là đơn giản, thuận tiện, dễ tiến hành, tuy nhiên có những nhược điểm : Phụ
thuộc vào nguồn cung cấp hạt giống, cây con ban đầu, chất lượng giống không
đảm bảo, hệ số nhân không cao, không thể cung cấp với số lượng lớn
Do hạn chế của phương pháp trồng bằng hạt và giâm cành như trên,
phương pháp nhân giống bằng nuôn cấy in vitro là một lợi thế.


11


2.5. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo
Ánh sáng: 3000 lux
Quang kì: 16 giờ/ ngày
Nhiệt độ phòng: 25oC - 27oC
Độ ẩm trung bình: 70 - 74%
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.1. Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắc
lại.
2.6.2. Phương pháp nghiên cứu
* Thí nghiệm 1: Tạo vật liệu khởi đầu
Mẫu tự nhiên sau khi thu về, cắt mẫu là đốt thân dài 3 - 4cm, rửa xà
phòng dưới vòi nước chảy, sau đó rửa lại nước sạch 2 - 3 lần.
Tiếp đó đưa mẫu vào tủ cấy, tiến hành khử trùng làm sạch mẫu cấy.
Trước hết khử trùng sơ bộ qua cồn (70% (v/v) rồi rửa nước cất 2 - 3 lần, rửa
mẫu bằng Javen (từ 5 - 15%/5 - 15 phút) rồi rửa lại nước cất 4 - 5 lần, thấm khô,
đưa mẫu vào cấy. Theo bảng 2.1

12


Bảng 2.1 Công thức thí nghiệm tạo vật liệu khởi đầu cây Chùm Ngây
Công thức

Chất xử lí/ thời gian

bổ sung 30g saccarozơ/l, 7g agar/l, pH =5,8.
Đặt lên giàn cấy và theo dõi tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sạch, tỉ lệ mẫu sạch
nhưng chết trong 1 tuần.

Tỉ lệ mẫu nhiễm (%)

Số mẫu bị nhiễm
x 100

=
Tổng số mẫu cấy

Tỉ lệ mẫu sạch sống (%)

Tổng số mẫu sạch
=

x 100

Tổng số mẫu cấy

Tỉ lệ mẫu sạch chết (%)

Tổng số mẫu sạch nhưng chết
=
Tổng số mẫu cấy

13

x 100


CT 4

MS + BAP 0,4 mg/l

CT 5

MS + BAP 0,5 mg/l

CT 6

MS + BAP 0,6 mg/l

CT 7

MS + BAP 0,7 mg/l

CT 8

MS + BAP 1 mg/l

CT 9

MS + BAP 1,5 mg/l

CT 10

MS + BAP 2 mg/l

* Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của Kinetin đến quá trình tái sinh chồi in vitro của

CT 4

MS + KI 0,7 mg/l

* Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của BAP + NAA đến quá trình tái sinh chồi in vitro
của cây Chùm Ngây
Thí nghiệm nghiên cứu của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá
trình tái sinh chồi in vitro cây Chùm Ngây là BAP kết hợp NAA với 3 công thức
bố trí như bảng 2.4:
Bảng 2.4. Công thức ảnh hưởng BAP + NAA đến quá trình tái sinh chồi in
vitro cây Chùm Ngây
Công thức
ĐC

Môi trường
MS cơ bản

CT 1

MS + BAP 0,2 mg/l + NAA 0,1 mg/l

CT 2

MS + BAP 0,5 mg/l + NAA 0,1 mg/l

CT 3

MS + BAP 0,7 mg/l + NAA 0,4 mg/l

* Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của NAA đến quá trình tạo rễ của chồi cây Chùm

MS + NAA 0,5 mg/l

2.6.3. Phương pháp phân tích thống kê dữ liệu thực nghiệm
Các số liệu thu được được phân tích thống kê theo các tham số: giá trị
trung bình, độ lệch chuẩn,… Sự sai khác giữa các giá trị trung bình được kiểm
tra bằng phương pháp giới hạn sai khác nhỏ nhất trên chương trình Excel 2010
[2].

16


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vật liệu khởi đầu
Đây là giai đoạn quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trình nhân
giống in vitro. Đối với mỗi loại cây, mỗi loại mô khác nhau phải xác định
phương thức khử trùng khác nhau cho thích hợp. Có loại chỉ cần bóc sạch các
lớp bên ngoài để lấy đỉnh sinh trưởng và rửa lại bằng cồn 700 (chuối, mía...), có
loại phải sử dụng hoá chất khác nhau như HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2… với
nồng độ và thời gian thích hợp. Đối với cây Chùm Ngây, sử dụng NaOCl 5 15% để khử trùng bề mặt trong 5 - 15 phút. Sau 2 tuần theo dõi các chỉ tiêu: tỉ
lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sạch sống, tỉ lệ mẫu sạch chết giống được thể hiện qua
bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây Chùm Ngây sau 14 ngày
nuôi cấy
Công thức

Tỉ lệ mẫu

Mẫu sạch

nhiễm (%)

17,78%

CT 3

76,92%

23,08%

7,69%

CT 4

41,18%

58,82%

21,57%

CT 5

100%

0%

0%

CT 6

75%